突触前早期和突触后晚期成分对脑源性神经营养因子诱导突触可塑性的独立贡献

摘要

介绍

BDNF是中枢神经系统突触活动的主要调节器(Thoenen，2000年). BDNF对突触功能的急性调节可归因于突触前和突触后机制。几项研究表明BDNF会改变突触前参数，包括在几分钟内增加微型EPSC（mEPSC）频率(莱斯曼和休曼，1998年;Li等人，1998年;Schinder等人，2000年;Tyler和Pozzo-Miller，2001年). 此外，BDNF基因敲除小鼠突触前功能的几种电生理指标降低，其活动区也表现出形态学缺陷(Pozzo-Miller等人，1999年). 最后，使用CA1和/或CA3特异性BDNF和肌钙蛋白相关激酶B(trkB型)敲除小鼠(Xu等人，2000年;Zakharenko等人，2003年). 总之，这些研究表明突触前元件对BDNF诱导的突触可塑性有重要贡献。

突触后成分也参与BDNF对突触效能的急性调节。长时间接触BDNF后突触后细胞谷氨酸诱导电流增强(Crozier等人，1999年)突触后细胞中的trkB拮抗剂可通过BDNF阻止EPSC振幅的增加(Levine等人，1995年). 这些电生理研究得到生化分析的支持，这些生化分析证明BDNF对神经传递机制的翻译后修饰。BDNF对NMDA受体NR2B亚基的磷酸化作用(Lin等人，1998年)可能有助于在BDNF存在的情况下观察到的NMDA通道开放概率增加(Levine等人，1998年). 最后，最近通过将弱刺激与局部应用于树突的BDNF配对以诱导增强，描述了滋养蛋白在LTP中的突触后作用(Kovalchuk等人，2002年). 尽管这些研究表明BDNF诱导突触增强的突触前和突触后方面，但这些成分的确切作用仍有待完全确定。

研究突触前和突触后机制参与的一种方法是使用两个组件中的一个有缺陷的系统，以便可以独立检查。在我们之前的研究中，BDNF诱导了一个编码突触前囊泡蛋白Rab3A的基因(Thakker-Varia等人，2001年). 以前的报告拉布3A敲除小鼠表明，尽管基础突触传递正常，但CA3区突触前苔藓纤维LTP缺失(Bean和Scheller，1997年;Castillo等人，1997年). 此外，在短串重复刺激后，敲除显示突触抑制增加，这表明Rab3A在突触小泡向活性区的募集中发挥作用，可能在分泌过程的很晚阶段(Geppert等人，1997年). 使用拉布3A敲除小鼠后，我们证明在BDNF诱导的突触电荷早期增加中需要这种突触囊泡蛋白(Thakker-Varia等人，2001年). 相比之下拉布3A观察到BDNF突变细胞，其时间与谷氨酸离子导入和BDNF暴露配对产生的细胞相似(Crozier等人，1999年). 我们假设BDNF表现出双成分反应：早期成分依赖于Rab3A，后期成分独立于Rab5A。

材料和方法

细胞培养制剂。CO杀死定时妊娠小鼠或大鼠₂根据动物护理和使用的机构指南窒息。通过剖宫产将胎儿取出，并用PBS转移到无菌培养皿中。从周围脑组织中解剖胎儿海马，并完全切除脑膜。游离胚胎第16天野生型或拉布3A如前所述制备纯合敲除小鼠（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）(Thakker-Varia等人，2001年). 简单地说，每一窝幼崽的混合组织在7.5%的营养培养基中进行机械分解，然后涂敷在聚乙烯上-d日-赖氨酸包被培养皿，每皿350000个细胞。培养物保存在无血清培养基中(Levine等人，1995年)10-13天。

电生理记录。在培养10-13天后进行全细胞斑贴灯记录。使用Axoclamp 200（加利福尼亚州联合市Axon Instruments）放大器记录电流，并使用INDEC接口（加利福尼亚州山景城INDEC BioSystems）进行数字化。用于数据采集和分析的程序是在内部编写的。内部和外部记录解决方案已在前面介绍过(Thakker Varia等人，2001年). 吸管电阻的典型范围为3-5 MΩ。电池电容为10-20 pF，接入电阻为7-20 MΩ。真空灌注系统含有BDNF（50ng/ml；Peprotech，Princeton，NJ）或含有神经元记录溶液（NRS）作为对照。为了记录mESPC和谷氨酸诱导电流，NRS和BDNF溶液中含有1μ米河豚毒素（TTX）（西格玛，密苏里州圣路易斯）。在电压灯模式下记录金字塔型细胞，mEPSC记录的膜电位保持在-80 mV，离子导入实验的膜电位维持在-40 mV，以减少Mg²⁺阻断NMDA受体。使用五支微量移液管进行谷氨酸的离子导入。一个桶，装满0.1米NaCl用于电流平衡。其他桶装满0.2米 我-谷氨酸，pH值7.5。以10 s的间隔施加离子导入脉冲，喷射时间足以实现稳定一致的响应（通常为10-30 ms）。每个数据点代表一个单独培养皿中的一个细胞，每个条件下至少使用三种不同的镀层。

数据分析。电生理数据按基因型进行盲法分析。通过计数在整个记录期间每2秒收集一次1.4 s扫描期间记录的所有mEPSCs来量化自发突触小泡释放。通过测量每个离子导入脉冲的峰值电流来分析谷氨酸诱导电流。对1分钟内所有扫描的测量值进行平均（装箱）。基线被视为BDNF应用前NRS中2 min期间（-2至0 min）的mEPSC频率或谷氨酸诱导电流大小。然后通过将BDNF暴露期间的mEPSC频率或谷氨酸诱导电流除以基线来确定倍数增加。如果在BDNF暴露期间切换后0-5分钟或5-10分钟的装箱时间段低于基线2×SEM，表明“耗尽”，则拒绝记录t吨使用检验、方差分析或Kolmogorov-Smirnov进行统计比较（未配对第页<0.05表示显著性）。

突触体的制备。成年野生型和拉布3A根据突触后密度准备方案的第一部分，用敲除小鼠（每只两只动物）制备突触小体(Wu等人，1986年). 在含有蛋白酶抑制剂（0.32米蔗糖，0.5米米氯化钙₂，1米米氯化镁₂和1米米氯化钠_三). 匀浆连续两次离心。将上清液混合并离心，通过0.32的均质化使所得颗粒重新悬浮米蔗糖和1米米氯化钠_三含有蛋白酶抑制剂。这种粗制备是在蔗糖梯度上进行的。突触体恢复为一条带，在0.32内重新悬浮米蔗糖和1米米碳酸氢钠_三加上蛋白酶抑制剂，造粒并重新悬浮在含有抑制剂（20 m）的HEPES缓冲液中米HEPES，pH 7.5，含110 m米氯化钠，5.3米米KCl，1.0米米硫酸镁₄，1.8米米氯化钙₂，25米米葡萄糖，68.3米米蔗糖蛋白酶抑制剂片，1米米PMSF和0.5 m米钒酸盐）。使用BCA蛋白质分析法对突触体进行定量，以调整在HEPES和NaH中平衡的等量蛋白质₂人事军官₄1小时，并在37°C下用BDNF（10或50 ng/ml）处理10分钟。通过添加4倍负载缓冲液停止反应，并煮沸5分钟。

SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE以7-12%的丙烯酰胺梯度进行，每条通道使用100μg蛋白质。在转移到Millipore（马萨诸塞州贝德福德）过滤器并阻断后，抗磷酸化Tyr抗体¹⁴⁷²-NR2B（1μg/ml）（来自日本东京东京大学山本T.Yamamoto的礼物）应用1 h。驴抗兔二级抗体（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）在1:5000下使用1 h，然后进行ECL检测（PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Boston，MA）。去除过滤器，并使用抗NR2B一级抗体（1:1000）（纽约州普莱西德湖最新生物技术公司）和驴抗兔二级抗体（Amersham Biosciences）测定NR2B蛋白水平。在Bio-Rad（加利福尼亚州Hercules）凝胶Doc上对带状物进行定量。

结果

BDNF的双相反应

为了描述分离海马神经元对BDNF的急性突触反应的时间剖面，进行了30分钟的全细胞电压灯记录。对于～60%的记录，引发了双成分反应。在BDNF暴露的前5分钟内突触电荷增加，在～10分钟下降，随后在～15分钟再次上升。在BDNF-治疗期间，活性的第二个峰值保持不变(图1). 在其余的记录中，BDNF产生了突触电荷的持续升高，其中两个成分虽然可能仍然存在，但无法明确区分。这些实验表明，大多数锥体样海马神经元对BDNF表现出双相反应。之前，我们定义了BDNF介导的突触增强早期（5分钟内）突触前囊泡蛋白Rab3A的需求，使用拉布3A敲除小鼠(Thakker-Varia等人，2001年). 这些数据表明，BDNF的早期反应是突触前驱动的。相比之下拉布3A20分钟时观察到BDNF突变细胞，这与谷氨酸离子导入和BDNF暴露配对产生的突变细胞在时间上相似(Crozier等人，1999年). 因此，突触后位点可能有助于BDNF的这种迟发作用。

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图1。

长时间接触BDNF可引起大鼠海马细胞突触活性的双重增强。A类，在BDNF暴露之前和暴露期间在指定时间点进行的样本扫描。注意，突触活动在接触BDNF的前5分钟内增加，然后下降到接近基线水平，但随后随着持续接触BDNF.而增加。B类，实验中突触活动变化的时间过程A类反应的两个组成部分是显而易见的。C，显示出双组分反应的那些实验（第13个，共22个）的分组时间进程。点代表平均电荷±SEM。在剩下的9个记录中，BDNF产生了突触活动的持续性升高，其中早期和晚期成分无法明确区分。

BDNF对Rab3A基因敲除小鼠突触前参数的影响

为了确定突触前成分对双相BDNF反应的贡献，我们研究了滋养蛋白对突触前参数的影响。在野生型和拉布3ABDNF应用期间的敲除细胞。来自野生型小鼠的细胞在应用BDNF的3分钟内表现出最大的约1.7倍mEPSC频率增加（平均事件/s，BDNF前-2至0分钟的0.18±0.05；BDNF后3-5分钟的0.26±0.08）。然而，在整个20分钟的记录中，BDNF并没有引起突变细胞自发释放的增强。从BDNF前的0.45±0.17事件/秒到BDNF后3-5分钟的0.29±0.09事件/秒的小幅下降不显著(图2A、 C类). 对于两组记录，对单个mEPSC进行归一化和平均。上升时间保持不变，但我们确实注意到mEPSC持续时间在BDNF暴露期间有略微延长的趋势(图2B类). 衰变时间的增加在野生型和拉布3A突变体神经元，提示BDNF的突触后活动在拉布3A击倒小鼠。这种可能性直接通过谷氨酸的离子导入法进行检测（见下文）。脑源性神经营养因子未改变mEPSC振幅的分布拉布3A突变细胞，与野生型和大鼠细胞的观察结果一致(图2D类) (莱斯曼和休曼，1998年). 计算三个时间段的平均mEPSC振幅：BDNF前（野生型，38.2±7.4 pA；拉布3A，41.6±5.1 pA），BDNF后3-5分钟（野生型，39.9±6.2 pA；拉布3A39.8±4.3 pA），BDNF后18-20 min（野生型35.5±3.8；拉布3A, 42.2 ± 6.7). 因此，拉布3A在BDNF治疗的前5分钟内观察到的囊泡胞吐频率的增加特别需要。这些数据支持这样的假设，即突触前机制有助于BDNF诱导的突触可塑性的早期成分。

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图2。

A类，野生型或Rab3A敲除细胞在暴露于BDNF之前和～5分钟后mEPSCs的代表性痕迹。全电池电压灯记录(V（V）_持有=-80 mV）。在BDNF暴露后5分钟内，野生型细胞的mEPSC频率增加，但在拉布3A敲除细胞。B类，BDNF治疗前和治疗后两个时间段野生型和拉布3A细胞。将单个mEPSCs归一化为相同的振幅并取平均值。上升时间不变，但BDNF处理后两种基因型的衰退时间都有延长的趋势。来自第二组记录的平均mEPSC给出了类似的结果。C，记录过程中BDNF（bar）响应的平均mEPSC频率。mEPSC频率标准化为基线（-2至0分钟）。野生型细胞对BDNF的反应使mEPSC频率立即增加（约1.7倍）拉布3A敲除细胞(第页< 0.05;t吨测试）。拉布3A在整个20分钟的记录过程中，突变细胞对BDNF没有反应，实际上与基线相比，mEPSC频率略有下降，但无显著意义(第页> 0.05;t吨测试）。虚线表示基线。误差条代表SEM。D类，野生型和拉布3A突变细胞(n个分别为8和7）。误差条代表SEM。BDNF治疗前和治疗后两个时间段的野生型或拉布3A突变细胞(第页> 0.05; Kolmogorov-Smirnov试验）。从多次电镀中获得记录。

Rab3A缺失时突触后特征的电生理和生化分析

为了确定BDNF介导活动的突触后成分，我们测量了野生型和野生型海马锥体样细胞中谷氨酸诱导的电流拉布3A突变神经元。谷氨酸在培养的胚胎海马神经元树突状突起基底部的离子电泳应用可诱发缓慢的内向电流，可能包括突触和突触外神经递质受体。在建立了稳定的基线测量值后，在继续通过谷氨酸离子导入激发电流的同时，对BDNF进行浴敷。在野生型细胞中，谷氨酸诱导的电流从BDNF处理后10分钟开始明显增加，并在整个记录过程中持续增加，因此与之前看到的时间曲线相似（BDNF前143.7±22.2 pA；BDNF后18-20分钟，170.2±31.9 pA）(Crozier等人，1999年).拉布3A在BDNF存在下，突变细胞对谷氨酸也表现出类似的离子导入反应（BDNF前为137.4±8.7 pA；BDNF后18-20分钟为161.5±15.2 pA）(图3)证明突触后成分在没有拉布3A对BDNF的突触后反应直到治疗10分钟后才可检测到，这一事实支持了双峰BDNF突触反应的第二阶段具有突触后成分的观点。

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图3。

A类，显示暴露于BDNF前和暴露于BDNF后约20分钟谷氨酸诱导电流的示例迹线。全电池电压灯记录(V（V）_持有=-40 mV）。野生型和拉布3A突变细胞相似。B类，记录过程中BDNF（水平条）响应的平均峰值电流。峰值电流振幅标准化为基线（-2至0分钟）。请注意年-轴从0.75开始，1表示对BDNF没有响应。电流从~15分钟开始增加。野生型和拉布3A敲除细胞在统计学上彼此没有差异(第页> 0.05;t吨测试）。在野生型细胞中观察到的谷氨酸诱导电流的早期小幅度增加与拉布3ABDNF后0-5分钟的个别时间点(第页> 0.05;t吨测试）。虚线表示基线。误差条代表SEM。记录来自多个镀层。

作为对BDNF正常突触后反应的检查拉布3A对敲除小鼠进行平行生化分析。NMDA受体亚单位NR2B的磷酸化在BDNF处理的海马突触后密度中均有记录(Lin等人，1998年)LTP诱导后的海马切片(Nakazawa等人，2001年).图4显示Tyr处NR2B磷酸化增加1.5倍¹⁴⁷²野生型和拉布3ABDNF作用10分钟后突触体发生突变。BDNF处理未改变NR2B总蛋白水平。这些结果支持了BDNF的生化突触后效应不会因缺乏拉布3A基因。事实上拉布3A谷氨酸诱导电流增加或10分钟后BDNF增强NMDA受体磷酸化均不需要，这表明双峰反应的第二阶段具有独立于突触前元件的突触后成分。

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图4。

A类、来自成人野生型和拉布3A敲除小鼠皮层。在10或50 ng/ml BDNF存在下孵育突触体10分钟。使用Tyr抗体检测磷酸NR2B¹⁴⁷²在同一膜上检测到总NR2B蛋白。B类NR2B磷酸化的定量表明，BDNF将NR2B的磷酸化增强了约1.5倍。BDNF诱导的磷酸化水平在野生型和拉布3A淘汰样品。10和50 ng/ml BDNF处理的NR2B磷酸化水平相似。将磷酸-NR2B标准化为总NR2B蛋白，并且数据以磷酸-NR2B相对于对照、未处理样品的倍数表示(n个= 3). 误差条代表SEM。^*第页<0.05，与对照样品显著不同（ANOVA）。

讨论

我们使用拉布3A突变小鼠，以确定对BDNF的时间双峰突触反应的机制。缺少拉布3A是一种突触囊泡蛋白，对滋养素诱导的突触增强的突触前元件有特殊作用，这在BDNF暴露的几分钟内就很明显。相反，突触后成分在较长时间的BDNF治疗后表现出来。关于mEPSC频率和谷氨酸诱导电流的电生理研究以及NMDA受体磷酸化的生化数据都支持这些发现。我们的研究首次证明了突触前和突触后对滋养蛋白介导的突触可塑性的贡献是自主的和时间离散的。

BDNF增加了野生型细胞中释放的囊泡数量，如mEPSC频率的增加所示，证实了先前的报道(莱斯曼和休曼，1998年;Li等人，1998年;Schinder等人，2000年;Tyler和Pozzo-Miller，2001年). 对mEPSC频率没有影响拉布3A突变体细胞表明，突触囊泡蛋白是BDNF增强囊泡胞吐频率所必需的，并且与Rab3A在囊泡融合后期的作用一致(Geppert等人，1997年). 这个拉布3A短时间重复刺激后，突变小鼠也表现出突触抑制增加(Geppert等人，1994年). 最后，最近的一项研究表明拉布3A-Rab3D四重基因敲除小鼠的突触形成或突触特性没有重大改变，但诱发的突触反应较小，囊泡释放概率降低(Schluter等人，2004年). 因此，我们的研究结果表明，Rab3A在BDNF暴露后增强传递过程中突触小泡的募集中起重要作用。BDNF诱导的mEPSC频率的增加可以被显性负离子阻断trkB型突触前细胞(Li等人，1998年)证实突触前BDNF信号对这一现象的贡献。BDNF基因敲除小鼠的活性区小泡较少，小泡相关蛋白水平降低，也证明了BDNF与突触小泡运输的调节有关(Pozzo-Miller等人，1999年). BDNF突变小鼠表现出电生理反应下降，包括破伤风后增强和配对脉冲促进(Pozzo-Miller等人，1999年)它们都是突触前驱动的。在本研究中，我们证明突触前成分发生在双峰BDNF介导的突触增强早期。

双峰BDNF反应的后期由突触后成分驱动，如谷氨酸激活电流增加所示拉布3A因此，即使在没有完整的突触前机制的情况下，突触后反应也是完整的，这表明这些成分是独立的。我们以前的电生理研究已经确定了NMDA受体NR2B亚单位在突触后BDNF反应中的作用(Crozier等人，1999年).

这些生理学研究与我们对BDNF对突触体中NMDA受体作用的生化特征完全一致。与我们之前对大鼠海马的研究类似(Lin等人，1998年)，BDNF在野生型小鼠中产生NR2B亚单位的快速酪氨酸磷酸化。BDNF处理拉布3A突触体突变产生了相同的反应，表明磷酸化不依赖于突触前BDNF反应，并且与孤立的突触后密度的观察结果一致(Lin等人，1998年). 因此，对BDNF的突触后生化反应与突触前机制的存在无关。Fyn激酶被认为负责NR2B亚单位的酪氨酸磷酸化(Nakazawa等人，2001年). BDNF诱导的突触传递增加在Fyn公司激酶敲除，表明磷酸化对滋养蛋白反应至关重要（I.B.Black，个人交流）。此外，Tyr¹⁴⁷²NR2B亚单位的磷酸化也与CA1区的LTP有关(Nakazawa等人，2001年)这表明了这种机制在学习和记忆中的作用。

突触前蛋白的磷酸化已被证明可以调节BDNF介导的突触增强。囊泡相关蛋白突触蛋白1被BDNF磷酸化，导致谷氨酸释放增加(Jovanovic等人，2000年). 最近的研究表明突触蛋白与Rab3A的结合，以及这种相互作用如何调节这两种蛋白质的活性(Giovedi等人，2004年)，这可能与缺少拉布3A影响神经元对BDNF的突触前反应。此外，Rab3A相关蛋白rabphilin在2分钟内通过增加细胞内钙而被磷酸化(Foletti等人，2001年). BDNF信号是否会导致兔亲蛋白磷酸化尚待确定。已经证明，rabphilin磷酸化依赖于Rab3A的存在。因此，对突触前BDNF可塑性缺乏的一种可能解释是拉布3A突变体可能是raphilin磷酸化不足。磷酸化因此成为滋养素诱导的突触可塑性的关键调节器。

总之，我们的研究表明BDNF诱导的塑性是一个双组分系统，呈现出双峰轮廓：突触前早期成分依赖于拉布3A以及后来的突触后方面拉布3A这些过程可能启动对LTP、学习和记忆重要的下游信号。

脚注

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