定义NSD2相互作用体：PARP1 PAR化降低NSD2组蛋白甲基转移酶活性并阻碍染色质结合

研究2：无标签定量MS捕捉NSD2相互作用伙伴

为了进一步确定高度自信的NSD2相互作用伙伴并减少BirA随机标记的噪音，我们开发了一种BirA对照，以从屏幕上消除非特异性蛋白质。将BirA连接酶和C末端核定位信号肽克隆到逆转录病毒载体中并稳定转导到TKO细胞系。然后使用对照细胞系对NSD2-BirA实验中的生物素化蛋白进行比较定量与只有比拉。在添加生物素的培养基中培养表达NSD2-BirA或BirA对照的三个TKO生物复制品(图2A类). 同样数量的细胞被采集和溶解。相同数量的总蛋白用于亲和捕获，以确保具有高度可比性的条件。对每个样品进行技术分析，一式三份，用于蛋白质鉴定和定量。利用基于层次线性模型的统计平台从表达NSD2-BirA的细胞中搜索蛋白质富集。由于亲和力富集，数据呈现为不对称火山图，其中x轴表示NSD2-BirA之间的相对丰度差异与BirA控制和年轴是瞬时的q个-值，衡量丰度差异在统计上的可信度(图2B类). 为量化设置了2倍差异和5%错误发现率的阈值，该阈值响应-log₁₀（瞬时q个-值）。总共有42个蛋白质在NSD2-BirA状态下被鉴定出具有统计学意义的富集，其中24个是核蛋白（有色红色在图中）。由于NSD2在生理学上定位于细胞核，我们将这24次核打击视为自信的相互作用伙伴(表S2). 每个定量肽的信号强度变化被指定为每个不同来源的总信号强度的百分比(图2C类). 生物和技术复制的微小变异和NSD2-BirA的大变异与BirA对照表明我们的定量研究是高度可靠的。

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图2。

无标签定量MS确定的NSD2-结合伙伴。 A、，研究设计：三个稳定表达NSD2-BirA的TKO细胞生物复制品或核定位BirA对照品与生物素培养、裂解并定量。每个样品中等量的总蛋白用于捕获链霉亲和素和胰蛋白酶消化。将得到的肽纯化并通过纳米毛细管LC-MS进行分析，一式三份。高分辨率MS1用于相对肽定量，MS2用于蛋白质鉴定。B、，显示了定量蛋白质的火山图。这个x轴是NSD2-BirA相对于BirA对照的蛋白质丰度的折叠变化。这个年轴（瞬时q个-值）测量NSD2 BirA和BirA对照之间的变化的统计置信度。这个垂直虚线表示2倍的更改阈值。这个水平虚线表示错误发现率为5%。超过阈值的20个核目标被着色红色.C，方框图和胡须图显示每个定量蛋白质的信号强度变化。治疗引起的变化（NSD2-BirA与BirA对照）、生物复制、技术复制或残留（之前描述的任何来源都无法解释的变化）。D、，24个高置信NSD2伙伴的基因本体KEGG通路分析。E、，BioID IP-MS定性研究1中重叠点击的维恩图（参见图1)无标签定量研究2。

使用EnrichR通过KEGG途径2016对24个相互作用靶点进行的GO分析表明，NSD2结合蛋白与碱基切除修复途径高度相关(图2D类)负责在整个细胞周期中清除基因组中的基础损伤。剪接体是图上的第二条顶部通路，这表明NSD2的功能可能超越转录延伸，以促进剪接体的组装或功能。

BioID IP-MS定性研究1中确定的63次点击和研究2中的24次无标签定量点击有16个重叠目标(图2E类). 如上所述，BRD4先前被鉴定为与转录延伸有关的NSD2相互作用蛋白。在研究1中，BRD4是63个高自信的点击之一。同时，在无标签定量研究中，BRD4在NSD2-BirA细胞中富集了6倍，表明基于邻近性的方法鉴定NSD2相关蛋白在机械上是有效的。

聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）是一种NSD2结合蛋白

与BirA对照组相比，NSD2-BirA样本中的PARP1蛋白水平增加了5倍(图2B类). 在BioID IP-MS分析的所有6个生物复制品中也发现了它，表明它是NSD2的真正结合蛋白。因为NSD2可能在DNA修复中起作用，我们选择进一步研究这种相互作用。MM细胞系KMS-11和KMS-11衍生的NTKO细胞(5)两者均为t（4；14）+，并表达高水平的NSD2，用于捕捉NSD2和PARP1的内源性相互作用。相互免疫共沉淀结果证实，PARP1和NSD2在MM细胞的生理条件下发生物理相互作用(图3A类).

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图3。

PARP1是NSD2绑定合作伙伴。 A、，NTKO和KMS11细胞内源性PARP1和NSD2的相互免疫共沉淀。B、，NSD2结合伙伴的火山图，PARP1基底着色绿色PARP1底物信息来自参考文献。33和34.C、，NTKO细胞分别用0.5和1 m米过氧化氢处理15分钟，收获后提取核蛋白。然后用聚ADP-核糖结合大域树脂亲和捕获PARP1和NSD2的PARylated蛋白，并进行免疫印迹，如图所示。

PARP1是一种核DNA依赖的ADP-核糖基转移酶，对核蛋白的聚（ADP-核糖基）化（PAR）进行催化(29). 它通过修饰自身和其他蛋白质在不同的分子途径中发挥关键作用。PARP1的PAR酰化活性对于介导DNA损伤修复是必需的。以前基于蛋白质组学的方法被广泛用于确定PARP1 PAR化靶点(30,–34). 在这里，我们比较了NSD2交互合作伙伴和先前发表的多篇论文中确定的PARP1目标(33,34). PARP1靶点绘制于绿色关于火山区(图3B类)和中所示表S2有趣的是，在24个已确定的NSD2交互伙伴中，有17个可以通过PARP1进行PARylated。此外，在其他筛选实验中，NSD2本身被确定为PARylation靶标(33,34). 因为有报道称，PARP1可能在DNA损伤和氧化应激时被激活，我们通过过氧化氢处理诱导NTKO细胞中的氧化应激，并使用富氏古球虫宏域(35). 结果表明，在应激细胞中观察到PARP1蛋白沉淀，而在对照细胞中观察不到PARP2蛋白沉淀后，PARP1在氧化应激和NSD2富集时发生自身PARP1化，这表明NSD2可以在DNA损伤刺激下发生PARPA化体内(图3C类).

NSD2是PARP1基板

由于NSD2在生理条件下与PARP1相互作用，并在氧化应激时被PAR基化，我们进一步测试了PARP1是否负责NSD2的PAR基化在体外.重组NSD2蛋白与PARP1孵育，添加和不添加NAD⁺和DNA辅因子。与PARP1酶孵育时，NAD⁺和DNA，观察到NSD2的约50 kDa质量位移，表明聚（ADP-核糖基）化(图4A类,图S1A类,车道5). 分子量偏移约为90个PAR单位。在同一反应中，PARP1的自身PARP1化在PAR印迹中被观察到是一个模糊的宽带，阻止了与PARP1抗体的识别(图4A类,图S1A类,车道7). PAR化所需辅因子NAD⁺NAD滴定后⁺，当PARylated NSD2达到约200kDa时，NSD2 PARylation平台化，这表明PAR修饰受到高度调节，或者只能向NSD2中添加有限量的PAR(图4B类,图S1B类). 作为对照，反应中DNA的缺失以及PARP1抑制剂Olaparib的存在显著降低了PARP1的酶活性(图4A类,图S1A类,车道3和6).

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图4。

NSD2是PARP1基板。 A、，重组NSD2蛋白与PARP1酶和指示的辅因子孵育。反应在室温下孵育10分钟，然后通过免疫印迹分析。B、，NAD的影响⁺滴定在体外PAR化反应。0.25 μ米NSD2和0.25μ米PARP1与NAD孵育⁺浓度为1μ米, 5 μ米, 10 μ米, 50 μ米, 100 μ米, 500 μ米和1米米在室温下保持10分钟。用所示抗体进行免疫印迹分析反应。C、，一个在体外组蛋白甲基转移酶检测采用放射性[^三H] SAM，重组NSD2酶。当使用重组PARP1作为底物时，未观察到放射性掺入。纯化核小体用作阳性对照。合并^三H信号归一化为阳性对照。展示了两个独立的实验。

因为一些非组蛋白被报道为HMT底物(36)最近，AURKA被确定为NSD2调节p53稳定性的新的非组蛋白靶点(37)，我们使用PARP1作为底物进行NSD2甲基转移酶分析。值得注意的是，未检测到PARP1甲基化在体外表明PARP1不是NSD2的底物(图4C类). 综上所述，我们的数据表明NSD2是PARP1的底物，但并非相反。

PARP1对NSD2的PAR化降低NSD2组蛋白甲基转移酶活性

先前的研究表明，PARylation可以调节酶的活性(38,39). 因此，我们测试了NSD2的PAR修饰是否影响其组蛋白甲基转移酶活性。为了测试这一点，将NSD2和PARP1分别与NAD孵育和不孵育⁺HMT分析前PAR化所需的辅因子。将奥拉帕布加入反应中以终止PARP1酶活性(图5A类). 孵育后，通过免疫印迹分析小份反应以测量NSD2的PAR化(图5B类,图S2,车道8). 值得注意的是，组蛋白甲基转移酶分析显示，与未修饰的酶相比，PARylated NSD2的酶活性降低了2倍(图5C类,第8车道与第9车道). NSD2与NAD的孵育控制⁺、激活的DNA或奥拉帕利单独不影响NSD2活性(车道4–6). 有趣的是，PARP1和NSD2的相互作用单独对NSD2组蛋白甲基转移酶活性没有显著影响(车道7). 因此，我们的结果表明，NSD2的PAR化可能调节其活性和PAR修饰，但不调节PARP1的相互作用，并且NSD2抑制NSD2 HMT功能。

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图5。

NSD2的PAR酰化抑制其酶活性。 A、，实验策略示意图。如步骤1所述，NSD2与单个辅因子或与PARP1共同孵育以进行PAR化反应。随后，通过添加奥拉帕利终止反应，并在冰上培养30分钟，如步骤2所示。B、，去除三分之一的PAR化反应，并通过免疫印迹分析以检测PAR化。C、， ^三添加H标记的SAM和纯化的HeLa寡核小体用于NSD2组蛋白甲基转移酶反应，如步骤3所述，并通过一种过滤结合分析来分析甲基化活性，该分析用于测量^三H标记的甲基。显示了两个独立的实验。

NSD2的PAR化破坏了其与染色质的联系

接下来，我们评估PARylated NSD2 HMT活性的降低是否是由于酶活性丧失或染色质结合抑制所致。为了验证这一点，我们首先进行了PAR化反应，然后提供SAM和生物素化寡核苷酸用于组蛋白甲基转移酶分析。然后捕获并分析生物素化核小体以及任何相关的NSD2(图6A类). 因为使用的核小体是从HeLa细胞中分离出来的，所以观察到基础H3K36me2(图6,B类和C类,图S3,车道2). 当未修饰的NSD2蛋白在反应中时，检测到H3K36me2增加(车道3和5). 然而，当NSD2被PARylated时，H3K36me2水平与未添加NSD2时保持不变(车道4)，进一步支持NSD2的PARylation抑制其酶功能。值得注意的是，未经修饰的NSD2蛋白与生物素化核小体共同纯化(图6B类,图S3,车道3和5)，PARylated NSD2与核小体的结合大大减少(车道4与车道3)表明PARylation阻断了NSD2-色氨酸相互作用。无NAD的NSD2和PARP1交互⁺对NSD2染色质结合无影响，同时NSD2可催化H3K36me2水平升高(图6,B类和C类,图S3,车道5). 总之，我们的数据表明，PARP1对NSD2的PAR化阻止其与染色质结合，导致组蛋白甲基转移酶活性降低。

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图6。

NSD2的PAR化破坏了其与染色质的联系在体外. A、，实验策略示意图。PAR化反应后，允许SAM和生物素化HeLa寡核苷酸与NSD2结合。将链霉亲和素磁珠添加到反应中，并在室温下培养1h。B、，通过对NSD2、组蛋白H3K36me2和总组蛋白H4的免疫印迹，捕获并分析生物素化核小体以及结合的NSD2。C、，使用ImageJ定量组蛋白H3K36me2带的相对强度。显示了两个独立的实验。

生物ID

按照参考文献中的描述执行BioID。27对于每个实验复制，培养一个15厘米的TKO或TKO-NSD2-BirA细胞皿，并在50μ米生物素48小时，在PBS中洗涤3次，在BioID裂解缓冲液（50 m）中裂解米三氯化氢，pH 7.4，500 m米氯化钠，0.2%十二烷基硫酸钠，1米米DTT，1×停止蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）），并淬火。14000×离心保存上清液克在4°C下保持10分钟。通过BCA分析（Pierce）对总蛋白进行定量，并使用与每个重复中总蛋白相同的量来捕获链霉亲和素。皮尔斯^TM公司用裂解缓冲液将链霉亲和素磁珠（60μl，Thermo Fisher Scientific）洗涤3次，并在4°C的试管旋转器上与蛋白裂解物孵育过夜。用三种不同的洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的磁珠(27)然后准备消化。

对于磁珠上消化，磁珠首先在100 m内清洗两次米通过添加DTT，碳酸氢铵和结合蛋白的最终浓度降低到10 m米并在50°C下培养30分钟。然后通过在100 m内培养进行烷基化米碘乙酰胺（Sigma）在室温下黑暗中放置30分钟。结合蛋白用100米洗涤米碳酸氢铵，并在37°C下用1μg胰蛋白酶（Promega）消化过夜。通过添加2μl甲酸停止反应。进行ZipTip（Millipore）清理以脱盐样品。将得到的肽在SpeedVac离心机中进一步干燥。

质谱数据采集

使用填充有1.9μm Reprosil C18珠的75μm×10.5-cm PicoChip柱（新品目，MA）进行纳米毛细管LC-MS/MS分析。在线安装一个150μm×3-cm的捕集器，捕集器内装有3-μm珠。溶剂A由水中0.1%甲酸组成，溶剂B由乙腈中0.1%甲酸构成。将肽重新悬浮在30μl溶剂A中用于LC-MS，并注入6μl。对于无标签定量研究，每个样品注射技术性一式三份。共有18次LC-MS/MS运行（3次生物重复×3次技术重复×2次状态）以随机顺序注入，用于图2用100%溶剂A在5μl/min的条件下捕获肽5 min，然后以300 nl/min的流速在35 min内分离，梯度为5到40%B。在4 min的斜坡达到60%B后，在95%B下清洗柱3 min，然后重新平衡到5%B 10 min，总分析时间为60 min。

LC通过电喷雾与LTQ Velos Orbitrap质谱仪耦合，该质谱仪以数据相关MS/MS模式运行，采用前10种方法。毛细管温度为275°C。收集了400至2000年的MS1扫描数据米/z（z）400时的分辨率为60000米/z（z）MS1 AGC设置为1×10⁶用1.5米/z（z）隔离宽度，CID归一化碰撞能量设置为35%。动态排除设置为60秒，电荷1+离子也被排除。离子阱AGC目标设置为3×10⁵.

蛋白质鉴定

进行吉祥物搜索以进行BioID蛋白鉴定。原始文件已转换为.mgf作为输入。使用人类SwissProt AC 2018_02数据库（20317序列）进行搜索。胰蛋白酶被用作蛋白水解酶，最多有两个缺失的裂解。选择甲硫氨酸的氧化和天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨作用作为可变修饰。半胱氨酸上的氨基甲酰被设置为静态修饰。肽质量耐受性为10ppm；MS/MS耐受性为0.6 Da。

生物信息学和统计分析

对于无标签定量研究，在不同的日子使用不同批次的细胞创建三个生物复制品，每个生物复制品注射技术性的三份。由于LC问题，TKO-BirA对照生物复制品1的一次技术注射失败。这导致17次LC-MS/MS运行用于本实验。蛋白质组发现器（2.1版；Thermo Fisher）用于鉴定和肽定量。光谱选择器用于从.raw文件导入光谱。Sequest HT搜索引擎用于对照人类Uniprot fasta数据库交叉引用已识别的肽。前体离子的质量容限设定为10 ppm，碎片离子的质量容差设定为0.6 Da。选择蛋氨酸氧化和天冬酰胺和谷氨酰胺脱氨作为可变修饰。半胱氨酸上的氨基甲酰被设置为静态修饰。胰蛋白酶被设置为蛋白水解酶，最多有两个缺失的裂解。使用Proteome Discoverer v2.1中的前体离子区域检测器进行定量。

共鉴定出2955个肽。当至少两个独特的肽与从生物复制品中观察到的至少两个独立的肽谱匹配进行鉴定时，认为每个蛋白质都已被鉴定。共有52个蛋白质被270个肽识别。对于差异表达分析，所有肽强度在肽的所有测量中都是标准化的。对于每种蛋白质，每种肽都被视为一组独立的蛋白质观察结果。使用分层线性模型对标准化肽强度进行差异表达测试，技术复制嵌套在生物复制中，采用其他地方描述的改进形式(53,54). 然后，针对多次测试对产生的F测试概率进行修正(55)错误发现率为5%。所有统计分析均使用SAS 9.4的自定义脚本进行（北卡罗来纳州卡里）。用于差分表达式计算的SAS脚本包含在支持数据Xiaoxiao_20170201.sas.zip.

协同免疫沉淀

根据制造商的方案，使用核复合物Co-IP试剂盒（Active Motif，CA）制备核提取物，并通过BCA分析（Pierce）进行量化。核蛋白（200μg）与2μg PARP1抗体（39559，活性Motif）、兔IgG（2729S，CST）、NSD2抗体（ab75359，Abcam）或小鼠IgG2b（ab91366，Abcam）在4°C下在试管旋转器上孵育过夜。接下来，向混合物中添加40μl蛋白质G脑葡萄糖微球（Sigma）并孵育1h。用PBS+0.5%Nonide P-40洗涤蛋白复合物结合的微球3次，用PBS洗涤蛋白复合体结合的小球3次。然后在20μl 1×SDS负载缓冲液中煮沸10 min洗脱结合蛋白，并用NSD2和PARP1抗体进行Western blotting分析。

PARylated蛋白质沉淀

用PBS清洗细胞，并在PBS中培养0.5或1 m米37°C下过氧化氢（Sigma）15分钟。提取核蛋白，并将200μg的核蛋白稀释在500μl PAR裂解缓冲液（50 m）中米三氯化氢，pH 8.0，200 m米氯化钠，1米米EDTA、1%Triton X-100、10%甘油、0.5%脱氧胆酸盐、1 m米DTT，1×停止蛋白酶抑制剂）。总共，用PAR裂解缓冲液预洗20μl聚（ADP核糖）结合大结构域树脂（Tulip Biolabs，PA），并将其加入核蛋白混合物中，在4°C的试管旋转器上孵育过夜。用PAR裂解缓冲液清洗珠子3次。结合的PARylated蛋白在20μl 1×SDS负载缓冲液中煮沸10分钟后洗脱，并用抗NSD2和PARP1抗体（ab194586，Abcam）进行免疫印迹分析。

体外PARylation分析

重组NSD2甲基转移酶（0.25μ米，反应生物学，PA）与0.25μ米PARP1酶（郁金香生物实验室，PA）在10μl PAR化缓冲液（50 m）中米三氯化氢，pH 8.0，100 m米氯化钠，10米米氯化镁₂，1米米DTT）。其他成分包括10μg/ml小牛胸腺DNA（Sigma）、50μ米北美⁺和500 n米如图所示，将Olaparib（Selleckchem）添加到反应中。将反应在室温下培养10 min，并通过添加10μl 2×SDS负载缓冲液和煮沸2 min使其失活。洗脱通过SDS-PAGE进行解析，并用NSD2、PARP1和聚ADP-核糖聚合物（ab14459、Abcam）抗体进行免疫印迹。

体外组蛋白甲基转移酶测定

含有0.25μ的PAR化反应米重组NSD2，0.25μ米PARP1酶、10μg/ml DNA和50μ米北美⁺在15μl的PARylation缓冲液中建立PARylate NSD2缓冲液。在室温下培养10分钟后，500 n米Olaparib或ddH₂添加O以停止反应。去除反应的三分之一（5μl），以通过免疫印迹确认PAR化。剩余的10-μl反应在40μl HMT缓冲液（50 m）中稀释米三氯化氢，pH 8.5，50 m米氯化钠，10米米氯化镁₂，2米米三（2-羧乙基）膦）与1μ米HeLa寡核苷酸体（反应生物学，PA）和2μ米[^三H] SAM（PerkinElmer Life Sciences），在30°C水浴中孵育1小时。通过添加最终浓度为10%的三氯乙酸（TCA）终止HMT反应。沉淀的蛋白质被发现在玻璃微纤维过滤器（GE Healthcare）上，并用冰镇的10%TCA和100%乙醇清洗。过滤器在化学罩中风干，并通过液体闪烁计数测量^三H公司。

NSD2-核小体关联分析

如上所述，建立15μl的PAR化反应。用Olaparib终止后，在HMT缓冲液中用1μ米生物素化HeLa寡核苷酸（HMT-35-160，反应生物学，PA）和2μ米SAM（新英格兰生物实验室）最终体积为60μl，并在30°C下培养30分钟。培养后，保留20μl反应物作为输入分数。剩余的40μl反应物在460μl洗涤缓冲液（50 m米三氯化氢，pH 8.5，100 m米氯化钠，5米米氯化镁₂，2米米三（2-羧乙基）膦，0.5%Nonide P-40，Halt蛋白酶抑制剂）与50μl预先洗涤过的链霉亲和素磁珠（88817，Pierce）混合，并在室温下培养1h。核小体结合复合物在洗涤缓冲液中洗涤三次，并在30μl 1×SDS负载缓冲液中煮沸洗脱。输入和洗脱通过SDS-PAGE进行解析，并用针对NSD2、PARP1、组蛋白H4（ab7311，Abcam）和H3K36me2（2901S，CST）的抗体进行印迹。

核分馏分析

根据制造商的方案（培养细胞亚细胞蛋白分馏试剂盒，Thermo）进行核分馏分析。保存可溶性和不溶性核蛋白组分，并通过BCA分析（Pierce）进行量化。用SDS-PAGE解析过氧化氢处理和未处理样品中相同数量的可溶性和不溶性蛋白质，并用NSD2、HDAC2（05-814，Millipore）和组蛋白H3（9715S，CST）抗体进行印迹。

ChIP-qPCR

单元格（10⁷)处理0.5 m或不处理0.5 m米过氧化氢与0.8%甲醛在室温下交联7min。甘氨酸添加至250 m米并孵育5分钟。然后旋转细胞并将其重新悬浮在1 ml裂解缓冲液（5 m米HEPES，pH 7.5，14 m米氯化钠，0.1米米EDTA、10%甘油、1%Triton X-100），并在冰上孵育10分钟以分离细胞核。将提取的细胞核旋转下来，并在1 ml洗涤缓冲液（2 m）中洗涤米Tris，pH 7.6，20 m米氯化钠，0.1米米EDTA）在冰上放置10分钟。然后将生成的细胞核重新悬浮在950μl剪切缓冲液（10 m）中米Tris，pH 7.6，1 m米EDTA）并转移至1 ml毫升的微管（Covaris，MA）中，用E220聚焦超声仪（Covaries，MA）以10%的占空比、140的峰值发生率和200次循环/脉冲持续35分钟进行超声处理。用1 ml的ChIP缓冲液将超声染色质样品稀释两次（30 m米Tris，pH 8.0，300 m米氯化钠，2米米EDTA，2%Triton X-100），并与10μg NSD2抗体一起孵育(6)或IgG2b抗体在4°C下过夜进行免疫沉淀。输入（1%）被保存，直到反向交联。将预先锁定的25μl Dynabeads蛋白A/G（Thermo）添加到样品中，并在4°C下旋转培养2 h。分离蛋白结合磁珠，并用以下缓冲液清洗两次：ChIP缓冲液（15 m米Tris，pH 8.0，150 m米氯化钠，1米米EDTA，1%Triton X-100），高盐缓冲液（20 m米Tris，pH 8.0，500 m米氯化钠，2米米EDTA、0.1%十二烷基硫酸钠、1%Triton X-100）、氯化锂缓冲液（10 m米Tris，pH 8.0，1 m米乙二胺四乙酸二乙酯，0.25米氯化锂、1%非碘酸盐P-40、1%脱氧胆酸盐）和10 m米Tris，pH 8.0，缓冲液，然后用100μl洗脱缓冲液（1%SDS，200 m米氯化钠，10米米EDTA，50米米Tris，pH 8.0）在65℃下培养4 h。添加RNase A（3μg，20 mg/ml，Thermo）和蛋白酶K，并在45℃下培养1 h。使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化DNA样品。底漆1月2日和CLS2之前已描述(6). 在CFX96 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad）上使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行qPCR。富集度以总输入DNA的百分比计算。