介绍分析大脑组织内神经元回路的突触基础需要电子显微镜。由于分辨率能够看到最小的突触接触，该方法使用不同的切片技术生成适合观察大量脑组织内超微结构的序列图像。切片是从组织块上切下的，留下块面用扫描电子显微镜成像，或者切片本身用透射电子显微镜成像。在这里，我们探索了使用聚焦离子束铣削结合块面扫描电子显微镜连续切割和成像成年啮齿动物大脑中的神经膜体积。我们发现，传统的透射电镜固定、染色和包埋程序可以提供足够的膜对比度，以观察所有轴突和树突及其突触接触。块面的铣削和成像提供了具有足够分辨率的串行图像，使观察者能够跟踪整个体积中的所有轴突及其连接。该技术为传统组织切片和EM成像方法提供了一种可行的替代方案，用于获取可用于神经连接重建和分析的大型数据集。
几十年来，电子显微镜一直被用于研究神经元的超微结构，这是第一次使用透射电子显微镜（TEM）对大脑皮层中的突触进行分类的研究(格雷，1959年)对大部分已识别神经元进行详细的连续切片分析(《怀特与洛克》，1980年;安德森等人，1994年). 尽管光学显微镜有了进步，但只有电子显微镜能够看到神经膜内的每一个轴突、树突和突触连接。然而，利用连续切片透射EM成像大量组织是目前依赖熟练人员大量体力劳动的一种方法。迄今为止的研究已经分析了复杂神经系统微小部分的连通性(Shepherd和Harris，1998年)或者简单得多的完整系统(怀特等人，1986年). 即使是经验丰富的显微镜师，成功获取大组对齐TEM图像也具有挑战性。许多因素都可能导致序列中断或图像堆栈不完美：在放置到支撑膜上的过程中，部分折叠，电子束损坏导致部分扭曲，以及污渍污染。
最近，描述了一种使用扫描电子显微镜对组织成像的串联截面TEM方法的替代方案。使用集成在扫描电子显微镜（SEM）内的切片机对树脂包埋的组织样品进行连续切片(Denk和Horstmann，2004年)用扫描电子束对铣削表面进行成像。因此，该方法依赖于机械切片方法，使用金刚石刀从块面切割薄片。与TEM不同，在TEM中，图像中的对比度是由高密度区域中电子的弹性散射产生的，块面扫描方法捕获从块体表面下方反向散射的电子。更多的后向散射发生在电子密度较高的染色区域，这使得对传统制备的生物组织进行成像成为可能。该技术可以高度自动化，消除了TEM中手动连续切片操作和成像的许多问题，自动生成对齐的连续图像。
我们在这里提出了一种替代的切片方法，使用平行于块面的聚焦离子束（FIB）去除（或研磨）嵌入组织的薄层，以及集成到同一显微镜中的扫描电子束对研磨区域进行成像(Heymann等人，2006年). 我们使用这项技术对常规准备的成人脑组织进行连续成像，其分辨率允许我们追踪体积为286μm的轴突和树突三并识别它们的突触连接。这种铣削方法可以从块表面去除薄至15nm的层。该研究表明，该方法有潜力通过脑组织体积自动收集序列图像，用于分析神经连接。
材料和方法
组织准备
一只成年小鼠（雌性，C57BL/6；10周龄）通过腹腔注射戊巴比妥钠进行深度麻醉。然后通过心脏灌注10ml等渗PBS对动物进行化学固定，随后立即在磷酸盐缓冲液中灌注200ml 2.5%戊二醛和2%多聚甲醛（0.1米pH值为7.4）。灌注两小时后，将大脑取出，并将60μm厚的振动体（Leica VT100；Leica Microsystems，Wetzlar，德国）切片切穿体感皮层和小脑。然后在二甲氨基甲酸缓冲液（0.1）中清洗切片米pH7.4），并在1.5%亚铁氰化钾和1%四氧化锇中后固定40分钟，然后在1%四氧化二锇中单独固定1小时，每个都在相同的缓冲液中，然后在水中1%醋酸铀酰中固定40分钟。然后在酒精中脱水，最后用Durcupan树脂渗透（瑞士Buchs的Fluka）。将切片平嵌在新鲜树脂中的玻璃载玻片之间，并在60°C下放置48小时，以使树脂硬化。该程序符合瑞士联邦动物实验法，该法由洛桑坎通纳医院管理。
砌块制备
树脂变硬后，从含有体感皮层第四层的切片上切下一块1×1 mm的方形块。将该块粘贴在空白树脂支架上，并使用切片机和玻璃刀将其切割成600×200μm的块面(). 这些通常是用于制作TEM系列截面的块尺寸。然后，使用导电银涂料（宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学公司）将最后一块安装在标准SEM显微镜存根上，然后使用溅射镀膜机（英国沃特福德Cressington Scientific公司）涂上一层铂/钯（厚度约30 nm），以去除表面上可能积聚的任何电荷。
一，树脂块的三维图，显示镓离子束（白色）的排列，镓离子光束平行于块扫描（用双头箭头表示），并磨掉一层树脂，形成一个成像面。然后使用与该垂直面成52°角的电子成像束（灰色）对该表面的嵌入组织进行成像。b条，组织块的扫描电子显微照片，与一用虚线表示铣削区域，如所示c与此相反。比例尺，20μm。
该试块被放置在双光束显微镜（FEI Helios NanoLab；FEI Company，Acht，Eindhoven，The Netherlands）内，该显微镜将场发射枪产生的扫描电子束与镓离子聚焦束结合在一起。该离子束与气体注入系统结合使用，在样品上表面感兴趣区域上方沉积一层厚厚的铂层（～1μm）。该系统在样品附近释放前体气体，甲基环戊二烯基（三甲基）铂（IV）（FEI公司）。当镓离子与样品相互作用时，在这种气体存在下，会发生分解，导致铂固体沉积在离子束指向的样品表面。
在感兴趣区域正上方的铂层的额外沉积减少了FIB铣削伪影。涂层确保树脂表面研磨均匀，并保持与离子束方向平行。如果没有它，由于样品表面的形貌或材料差异，会出现过度的不均匀铣削。这可能会导致木块表面出现过多条纹或垂直条纹，称为窗帘(一) (Heymann等人，2006年).
一，研磨成像面的反向对比背散射电子显微照片，以暴露～120×115μm的视野。在这个初始准备阶段，可以在右下角看到少量的“窗帘”。一旦开始串行铣削和成像，就可以消除这种成像伪影。在束流电压为5keV、束流电流为0.40nA、像素驻留时间为10μs的条件下拍摄图像。图像的分辨率为30 nm/像素。在这张图片中，细胞体（cb）和血管（bv）很容易被看到。b条，从成像面拍摄的反向对比背散射扫描电子显微照片，如所示一使用相同的光束参数，但分辨率为10nm/像素。通过这些设置，显微镜可以生成清晰显示染色膜和神经膜内许多特征的图像，例如树突（de）。c，中白色方框内区域的相同图像b条，它已经被放大，以说明可以通过这些成像参数看到的细节。图像显示轴突隆起（ab）和树突棘头（sp）。比例尺：一，20微米；b条，5微米。
剖切和成像
准备初始成像面，测量范围为~10000μm2(c,一)被磨碎了。本质上，光束掠过表面，当离子与物质中的分子碰撞时，它们被抛出。当束扫描平行于块面时，它会慢慢地越来越近，直到100×100μm的面被研磨，离子束路径中的所有树脂都被移除。这创造了一个与铣削平面平行的光滑抛光面(). 使用电子束形成的图像监测进展，同时使用离子束铣削[同步图形和成像（SPI）模式]。接下来，将离子束设置为从该区域研磨层。我们研磨了40纳米的层，但也测试了小到15纳米的研磨。去除每一层后，收集后向散射电子图像。电子成像束与试块表面成52°角(一)图像是通过电子与样品相互作用产生的，并再次被反向散射出去。这些电子是通过透镜内检测器检测到的，使用的是收集电子的管上的负电位。这个负电势意味着低能二次电子被排斥，只有高能背散射电子有助于成像。
当铣削材料在成像区域周围重新沉积时，可能会发生图像干扰。当这种情况发生时，存在一种风险，即它可能会建立并模糊视野。由于这个原因，在两个x个和年方向，以确保附近不会发生重新定位。
从最初的100×100μm面部，选择了一个较小的区域，测量范围为～30×30μm，无血管，未被细胞体完全遮挡，因此主要包含轴突、树突和星形细胞突起。使用30 keV的加速电压和1000 pA的电流对这个较小的表面进行铣削。每个铣削需要75秒才能完成。去除每一层后，以4 nm/像素的放大倍数从较小的子区域收集图像，总图像大小为2048×1768像素（～4 MB/图像）。这给出了8.2μm的水平场宽度。成像光束的加速电压为2 keV，电流在340和400 pA之间，停留时间为100μs/像素（除非另有说明）。对于采集的每个图像，对比度都会自动调整。在整个过程中，离子和电子束的入射位置保持在距离SEM柱的最终透镜5 mm处。
虽然SPI模式用于监控块面的创建，但在铣削完成后采集高分辨率图像。铣削和采集完全自动化，生成一系列几乎对齐的图像。使用Photoshop软件（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）手动完成最终校准。在单个文件中，单个图像作为单独的图像覆盖在前一个图像上。通过使顶部图像（层）部分透明并在x个和年直到它与下面的可见图像（层）对齐。序列图像的重新对齐在x个或年方向，对应0.16μm。图像的对比度也被反转，以使最终图像具有更熟悉的TEM外观。
因为这些图像是由后向散射的电子生成的，所以我们想估计它们穿透的深度。这种相互作用的体积是样品密度和加速电压的函数。加速电压越低，穿透电子束的次数越少，因此，在表面附近获得的信息越多(Denk和Horstmann，2004年). 这将对成像分辨率产生重大影响，因此较低的加速电压将提供更高的有效分辨率，这对于分辨膜和囊泡等小结构至关重要。因此，我们测试了不同的加速电压，以确定用于识别细胞膜和突触的合适电压。因为我们制作了40 nm的薄片，所以选择了一种电子束能量，它可以在小于薄片厚度的深度处产生背散射电子().
一神经膜区域的反向对比背散射电子显微照片，分辨率为4 nm/像素。电子束能量为5keV。图像显示染色膜和细胞间隙之间的对比度有限。这种效果会使图像模糊。b条，成像面部相同区域的反向对比显微照片一。除了电子束能量降低到2keV外，所有成像参数都相同。在这张图像中，薄膜对比度提高，成像深度降低。两张图片中的箭头都表示有髓鞘的轴突。两个面板中的插图都显示了树突棘头（sp），但只有在b条可以看到小泡簇以及突触前和突触后密度（箭头）吗。
2keV的加速电压使我们能够看到膜，包括轴突泡内的小泡。在较高电压（5keV）下，这些特征不太明显，深层结构模糊了图像。当位于表面下的有髓轴突在部分图像中显示为阴影时，这一点尤为明显(一). 当使用较低电压（2 keV）时，不会出现这种阴影(b条)，将交互体积减小到看起来小于切片厚度的程度。
我们试图用2keV的束流能量估算电子反向散射的深度。我们用小脑组织的树脂块成像分子层，检查单个不对称突触及其囊泡。我们使用了与之前相同的成像参数。面部在15纳米的深度进行研磨，在每个图像中都可以清楚地识别出囊泡。因为这些结构的直径在40到50纳米之间，当截面厚度为15纳米时，它们最多可以被切割四次。我们在我们的图像系列中看到，每个囊泡在三到四张图像中都是一个具有透明核心的圆形膜（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。然而，它们首先出现在前面的单个图像中，但没有一个清晰的中心，这表明成像光束穿透到表面以下的深度，在该深度处，囊泡发生反向散射。因为这种情况只发生过一次，然后才显示为空心结构，推测当它在表面成像时，它将表明穿透深度<30 nm。
在我们从新皮质拍摄的更大的成像序列中，我们从区块表面研磨了120层，每层40纳米厚。重复铣削和成像的整个过程没有操作员的干预。每幅图像为2048×1768像素，像素驻留时间为100μs；因此，每幅图像的采集时间为～4分钟。图像系列的子集显示为补充数据（补充电影1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），其中包含了部分视野(c，用虚线表示的区域）。这显示了碾磨和成像过程，使观众能够通过组织跟踪每个神经突。
a–c，每次研磨40 nm树脂时，从成像面上拍摄的连续扫描电子显微照片。束流电压为2keV，束流为0.4nA，驻留时间为100μs。放大倍数设置为4 nm/像素，场宽为8.4μm。在每张图片中，插图显示了一个数字放大的区域，该区域用白色方块表示，表示一个树冠形成不对称突触（白色箭头），一个树突形成对称突触（黑色箭头）。中的虚线c表示从补充电影1（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。
为了独立检查铣削厚度，我们使用了以下方法菲亚拉和哈里斯（2001）测量位于成像平面纵向的几个线粒体的直径，并计算该区域被切割的次数，使我们能够估计截面厚度，假设这些结构是圆柱形的。对于以40 nm间隔切割的系列，铣削厚度为48±8.6 nm（平均值±SD）；对于以15nm间隔切割的系列，铣削厚度测量为14.1±3.1nm（平均值±SD）。这在系列图像中很明显（补充电影1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），整个堆垛的铣削厚度并不完全一致，尽管不清楚为什么会出现这种情况。
神经连接的分析需要识别突触。我们选择收集这个图像序列的参数可以识别单个囊泡，从而可以看到神经元的连接。此外，已识别突触之间的形态学差异表明，不对称（假定谷氨酸能）和对称（假定GABA能）突触也可以区分(; 补充电影1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。对于不对称突触，小泡是圆形的，它们的管腔看起来清晰而不染色(). 这些存在于不对称接触的轴突泡中，突触后密度比突触前密度更厚。这与对称性突触形成对比，对称性突触体中的小泡是卵圆形的，比不对称型的小泡小，轴突泡显示突触前和突触后密度相似(). 在我们对新皮质这一区域的其他研究中，所有这些对称突触对GABA都是免疫阳性的(Knott等人，2002年).
讨论可视化神经电路中的完整接线和连接是当今EM技术面临的现实挑战。使用TEM，可以收集、染色和成像连续切片，并在任何放大倍数下多次重访切片(Harris等人，2006年). 目前，这一过程的大部分都需要手工完成，而且并非没有陷阱。串行块面扫描SEM方法(Denk和Horstmann，2004年)虽然删除了被丢弃的部分，但能够自动收集对齐的图像系列，并且具有当前可用TEM无法实现的大视场。金刚石刀非常适合切割这些大块的表面。然而，以适合观察突触的分辨率对该表面进行成像意味着大量能量被传递到阻塞面，导致树脂结构发生变化（即交联）；硬度的增加使得用刀继续切割过程变得困难(Denk和Horstmann，2004年).
这些技术局限性使我们探索了FIB研磨技术，目的是生成一系列图像，在这些图像中可以识别所有的神经突及其连接。生成的图像只需要有限的对齐。此外，我们还发现，以能够让我们看到轴突、树突和突触的分辨率成像，并没有改变树脂的特性，而这些特性会干扰研磨过程。这意味着，尽管离子束的切割面积有限，但无论成像光束的参数如何，都可以进行切割。嵌入树脂的过度交联似乎不会影响铣削梁，并且在最终图像序列中不明显。
我们能够研磨大于10000μm的表面积2，然后我们将其减少到900μm2当我们收集最终的图像系列时。然而，可以铣削的最大可能面积是有限的。离子束扫描的最大长度为800μm。成像窗口的这个理论宽度意味着光束将偏离垂直方向很远。外缘的离子不会局限于圆形斑点，而是一个具有较大表面积的椭圆，从而减少单位面积上影响树脂的离子，并降低其研磨效果。在这里，我们铣削了一个120μm宽的区域，在窗口边缘没有看到任何有害影响。铣削深度也有限。光束聚焦在块面的上边缘，在上部区域提供最佳成像表面。再往下看，光束的面就不那么聚焦了，减少了研磨效应，降低了离子将分子从块中喷射出来的可能性。
铣削最终900μm2脸用了75秒，这对于短系列的采集图像来说是微不足道的。然而，当需要在更大的表面上成像时，铣削时间将变得非常重要，并且成像表面上可能会积聚电荷。尽管初始块涂覆有铂，从而在成像区域周围提供导电层，但当制备大面积时，这可能变得不那么有效。
尽管铣削时间很长，但图像采集时间是大体积的主要限制因素。每个图像都是通过电子束扫描块表面生成的，需要在快速采集时间、高分辨率和足够的信号之间达到平衡，以生成具有适当对比度的图像。使用4 nm/像素的放大倍数和100μs/像素的驻留时间，每幅图像在4分钟内获得，总叠加时间大于12小时。虽然驻留时间的显著改进可以减少总成像时间，但我们无法实现这一点，并且在具有足够对比度的情况下保持图像质量。
这项技术使我们能够看到并跟踪图像序列中的所有神经突起，并识别它们的突触连接。然而，通过堆叠，图像之间的铣削深度存在一定的变化。当铣削较薄的层时，这种情况会大大减少，但原因尚不清楚，因此需要进一步研究。在这里拍摄的一系列图像中，铣削深度的不一致似乎不会导致通过神经膜追踪轴突的问题。我们还可以识别对称和非对称突触。然而，因为一些神经元突起，例如树突棘颈，可以薄到40纳米(索拉和哈里斯，2000年)，可能需要研磨较薄的层。15纳米的图层虽然可能，而且增加了自动分割所有结构的能力，也会增加所需的图像数量。
总之，本研究表明，离子束铣削结合块面扫描可以通过成年哺乳动物大脑中大量的神经膜生成序列图像。这些图像序列具有足够的对比度和分辨率，可以识别所有轴突和树突及其突触接触。然而，作为一种通过大量甚至可能包含完整神经回路的神经组织大规模收集图像的方法，这种块面扫描技术需要进一步改进。目前，扫描束技术在铣削大表面方面的能力有限，以高分辨率对这些区域进行成像需要相当长的时间。然而，该方法能够识别突触，铣削和图像采集的整个过程可以完全自动化，而无需依赖手动收集、染色和对大系列切片成像。
