神经科学杂志。1997年5月15日；17(10): 3623–3633.
TrkB信号是中枢神经系统神经元出生后存活所必需的，并保护海马和运动神经元免受轴索霉素诱导的细胞死亡
,1 ,2 ,1 ,1 ,2和2
阿尔坎塔拉太阳
1西班牙巴塞罗那08028巴塞罗那大学生物学院细胞生物学系
乔纳斯·弗里森
2新泽西州普林斯顿市布里斯托尔-迈尔斯施贵宝制药研究所分子肿瘤学系08543-4000
何塞·安东尼奥·德尔·里奥
1西班牙巴塞罗那08028巴塞罗那大学生物学院细胞生物学系
爱德华多·索里亚诺
1西班牙巴塞罗那08028巴塞罗那大学生物学院细胞生物学系
马里亚诺·巴巴西德
2新泽西州普林斯顿市布里斯托尔-迈尔斯施贵宝制药研究所分子肿瘤学系08543-4000
Inmaculada Silos圣地亚哥
2新泽西州普林斯顿市布里斯托尔-迈尔斯施贵宝制药研究所分子肿瘤学系08543-4000
1西班牙巴塞罗那08028巴塞罗那大学生物学院细胞生物学系
2新泽西州普林斯顿市布里斯托尔-迈尔斯施贵宝制药研究所分子肿瘤学系08543-4000
1996年10月29日收到；1997年2月18日修订；1997年2月24日接受。
摘要
携带神经营养素编码基因或其信号转导Trk受体靶向突变的新生小鼠在外周神经系统中表现出严重的神经元缺陷，但在中枢神经系统中没有。在本研究中，我们表明trk公司出生后早期，B（−/−）小鼠大脑不同区域的凋亡细胞死亡显著增加。大脑中受影响最严重的区域是海马的齿状回，尽管在皮质层II、III、V和VI、纹状体和丘脑中也检测到固缩核水平升高。此外，轴切海马和运动神经元trk公司B（−/−）小鼠的存活率明显低于野生型同窝小鼠。这些结果表明，通过TrkB受体的神经营养素信号在出生后发育期间CNS神经元的存活中起着作用。此外，他们还表明TrkB受体信号传递可保护CNS神经元亚群免受损伤和轴索霉素诱导的细胞死亡。
关键词：TrkB、CNS、细胞死亡、轴切断、海马、运动神经元
神经营养素，包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素-3（NT-3）、NT-4/5和NT-6，已被证明能促进多种神经元群的神经元存活(Fariñas和Reichardt，1996年). 缺乏编码这些神经营养素或其受体的基因的突变小鼠表明，在胚胎发育期间，外周神经系统中不同神经元种群的存活对神经营养素信号的精细需求(斯奈德，1994年;巴比特，1995年;Fariñas和Reichardt，1996年). 然而，在这些突变小鼠的中枢神经系统中很少检测到缺陷。
有人建议(斯奈德，1994;Fariñas和Reichardt，1996年)这些动物没有中枢神经系统缺陷可能是因为中枢神经细胞中TrkB和TrkC受体的模式有明显重叠(Ernfors等人，1992年;梅利奥等人，1992年). 然而，这种假设似乎不太可能，因为缺乏这两种Trk受体的双突变小鼠在中枢神经系统中没有任何明显的缺陷，至少在胚胎发育期间是这样的(Silos-Santiago等人，1997年). 这些观察结果表明，中枢神经系统神经元对生长因子的需求比外围神经元更为复杂。另一种可能性是，中枢神经系统神经元在出生后的发育过程中，甚至在成年动物中，只需要神经营养素的支持。另外，神经营养素在中枢神经系统中的作用可能涉及神经元功能而非生存。事实上，神经营养素信号转导与神经活性物质的合成等生理事件有关(Lindsay和Harmar，1989年;Ip等人，1993年;Nawa等人，1993年,1994;Jones等人，1994年;Marty等人，1996年)、突触效能和重排(Lohof等人，1993年;Cabelli等人，1995年;Kang和Schuman，1995年;Korte等人，1995年;Lesser和Lo，1995年;Levine等人，1995年;Lo，1995年;Thoenen，1995年;Patterson等人，1996年)树突和轴突生长的调节(Diamond等人，1992年;Schnell等人，1994年; 科恩·科里和弗雷泽，1995年；McAllister等人，1995年).
神经营养素信号也可能在保护CNS神经元在出生后的生活中免受伤害方面发挥主要作用。事实上，有大量证据支持神经营养素及其受体在损伤后对许多神经元群体具有保护作用的概念(Sendtner等人，1992年;Yan等人，1992年,1993;Koliatsos等人，1993年;Arenas和Persson，1994年;Li等人，1994年). 例如，已有研究表明，轴切断导致神经营养素、p75和Trk受体在神经元、胶质细胞和靶组织中的表达发生变化(Heumann等人，1987年;Ernfors等人，1989年;Frisén等人，1992年,1993;Meyer等人，1992年;Beck等人，1993年;Funakoshi等人，1993年;Koliatsos等人，1993年;Mearow等人，1993年;梅利奥等人，1993年;Piehl等人，1994年;小林等，1996年). 此外，外源性给药的神经营养因子可以在轴切断术模式中从损伤诱导的细胞死亡中拯救神经元(Sendtner等人，1992年;Yan等人，1992年;Koliatsos等人，1993年,1994;Yan等人，1993年;Arenas和Persson，1994年).
在本研究中，我们分析了TrkB酪氨酸激酶受体缺陷小鼠的中枢神经系统神经元。大多数老鼠在出生后的第一周内死亡(Klein等人，1993年). 然而，一些动物存活了2-3周。我们在这里报告这些“老”trk公司B（−/−）突变小鼠在自然发生的细胞死亡后，新皮质和海马的固缩核水平增加。此外，我们发现，在缺乏TrkB受体的情况下，轴切断会导致海马和面部运动神经元存活率降低。这些数据首次证明了TrkB受体在出生后CNS神经元亚群存活中的作用，并为TrkB信号保护CNS神经元免受损伤和轴浆诱导的细胞死亡的概念提供了遗传支持。
材料和方法
老鼠
trk公司在编码TrkB信号受体酪氨酸激酶结构域的序列中携带靶向突变的B（−/−）小鼠已被描述(Klein等人，1993年). 将出生后的小鼠固定在PBS中4%的多聚甲醛中，pH7.4，或0.12中1%的多聚醛和1%的戊二醛中米磷酸盐缓冲液，pH 7.4。所有小鼠经心灌注，在新鲜固定液中固定过夜，然后分别进行石蜡包埋、免疫组织化学、末端脱氧转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）或电子显微镜检查。在出生后第5天（P5）至第8天的不同发育阶段对小鼠进行分析(n个=8），P10和P11(n个=13），以及P13–P18(n个= 21).
免疫组织化学
固定在4%多聚甲醛中的小鼠大脑在新鲜固定剂中后固定，并在30%蔗糖中冷冻保护。冷冻或振动脑冠状切片的切割厚度为50μm。用甲醇和过氧化氢处理游离切片以抑制内源性过氧化物酶，并在10%的正常山羊血清中阻断。用针对钙结合蛋白（1:4000稀释）、小白蛋白（1:400稀释）或钙视网膜蛋白（1:2000稀释；瑞士贝林佐纳的Swant抗体）和降钙素基因相关肽（1:750稀释；加州贝尔蒙特半岛）、P物质（1:500稀释；加州旧金山的Zymed）、，TrkA和p75受体（1:5000稀释；来自L.Reichardt的礼物）、GAP-43（1:2000稀释；印第安纳波利斯Boehringer Mannheim）和c-Jun（1:1000稀释；加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）。按照制造商的指示，使用亲和素-生物素复合物方法检测初级抗体（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Laboratories）。在用3,3′-二氨基联苯胺（DAB；0.25 mg/ml；Sigma，St.Louis，MO）和过氧化氢显影后，切片在Zeiss Axiopot显微镜下观察之前用甲酚紫染色。
隧道
如前所述，对冷冻切片或振动切片进行DNA缺口末端标记(Gavrielli等人，1992年). 简单地说，将切片安装在载玻片上，在30°C下干燥过夜，用蛋白酶K（20μ米/ml），并与末端转移酶（TdT；0.3酶单位/μl）和生物素化脱氧尿苷三磷酸在TdT（Boehringer Mannheim）中37°C培养90分钟。切片与2%牛血清白蛋白（BSA）和亲和素-生物素复合物（1:100稀释）孵育1小时。用3,3′-DAB、过氧化氢和0.2%硫酸镍铵培养过氧化物酶活性。
电子显微镜
用1%多聚甲醛和1%戊二醛灌注小鼠的振动切片，用2%四氧化锇进行后固定，用2%水乙酸铀酰整体染色，在乙醇中脱水，平包埋在Araldite中。在用电子显微镜观察之前，将薄切片安装在用乙酸铀酰和柠檬酸铅后染色的Formvar涂层槽栅上。
形态分析
神经元计数。固定后，将大脑包埋在琼脂中，并在振捣器中进行冠状切片（50μm厚）。使用40倍物镜和毫米目镜分析Nissl染色切片。计算齿状回、CA1和CA3海马区、体感皮层（第一顶叶）、纹状体（尾壳核）和丘脑（腹后内侧核和网状丘脑核）的颗粒上（II和III）和颗粒下（V和VI）新皮质层中固缩核的数量。对每只动物（2只大脑100000μm）的6至8个切片进行计数2每个区域或层的每个节的字段）。将去轴小鼠的脑干包埋在石蜡中，在8μm处进行冠状切片，并用甲酚紫染色。使用40倍物镜计数面部运动神经元。神经元总数是通过仅计算每五个部分中显示明显细胞核和核仁的细胞来确定的。使用截面厚度和平均核直径的倍增因子校正分裂核仁的原始神经元计数。运动神经元存活率是通过比较损伤侧和未损伤侧剩余神经元的百分比来估计的。使用未配对的Student’st吨测试。
神经元大小。用于测定神经元横截面积、第V层（体感新皮质）、trk公司B（−/−）和野生型小鼠（P13–P18，每只4只动物，每只动物40–50个神经元）在一个数字化平板电脑上进行追踪，该平板电脑与设计用于计算面积的计算机软件接口（SigmaPlot，Jandel Scientific，San Rafael，CA）。还测量了切除的面部运动神经元的面积（每个基因型三只动物，每只动物100个细胞）。使用未配对学生的t吨测试。
海马切片培养
如其他地方所述，从新生小鼠制备海马切片培养物(Stoppini等人，1991年;Del Río等人，1996年). 简单地说，动物被低温麻醉，大脑被无菌切除，海马体在解剖显微镜下被解剖出来。使用组织切碎器将组织块切成横向切片（400μm厚），并使用膜间期技术进行培养。将组织切片放置在30mm无菌膜上（Millicell-CM，Millipore，Bedford，MA），并转移到六孔组织培养托盘中。培养物保存在0.8 ml培养基中（50%最低基本培养基和25%马血清），其中含有2 m米谷氨酰胺和0.044%NaHCO三调节至pH值7.3。在另一组实验中，用BDNF（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）、NT-4（马萨诸塞州坎布里奇Genzyme）、NGF（波辛格-曼海姆Boerhinger Mannheim）、重组NT-3（新泽西州普林斯顿Bristol-Myers Squibb）或溶媒溶液（每组9-10个培养物）处理野生型新生小鼠的培养物3天。神经营养素（25–50 ng/μl）在PBS（0.1）中稀释米pH7.4），含0.2%BSA（Sigma），并从外植那天起每天直接添加在每个切片培养物上（100 ng/培养物）(Marty等人，1996年). 培养物在3或5天后用4%多聚甲醛固定在0.1米PBS公司。振动切片（50μm厚）用甲酚紫染色。如上所述，计算CA3、CA1和泡下区齿状颗粒细胞层和锥体层中的致密核（4-6海马25000μm2每个区域的每个区域的字段）。
面部轴切开术
P5小鼠被低温麻醉，左侧面神经在通过柄乳突孔离开后被切断。小鼠被允许存活到P10。此时，他们被阿维汀（200 mg/kg）麻醉，并经心灌注PBS，然后再灌注Bouin’s固定剂（Polysciences，Warrington，PA）。解剖脑干并将其埋入石蜡中进行神经元计数。P7动物的脑干在低温恒温器中切割，并进行免疫组织化学（见上文）或乙酰胆碱酯酶组织化学处理，如前所述(Hedreen等人，1985年).
结果
缺乏TrkB受体的出生后小鼠的有限形态学改变
缺乏TrkB酪氨酸激酶受体的小鼠出生后可存活3周。出生后晚期的脑切片（P10–P18）trk公司与野生型同窝小鼠相比，B（−/−）小鼠表现出正常的细胞结构，如Nissl染色和几种神经元标记物的免疫标记所示（图。). 例如，突变动物大脑皮层和海马体的典型分层结构保存完好（图。B、 D、G). 同样，嗅球以及丘脑、基底神经节和其他前脑区域的不同核团也没有表现出明显的形态缺陷（数据未显示）。然而，大多数神经元种群trk公司B（−/−）小鼠的体细胞明显小于其对照窝鼠，这可能是由于这些突变小鼠的整体尺寸较小。例如，海马的肺门神经元和体感皮层第五层的锥体神经元的体面积分别为233±5.4和195±4.1μm2分别在野生型小鼠中对160±4.1和146±3.2μm2在里面trk公司B（−/−）小鼠(第页< 0.001). 此外，一些最古老的幸存者trk公司B（−/−）小鼠（P13–P18）在灰质中显示出缺乏神经元的小而空的区域。这些区域在新皮层更为突出，在那里它们似乎是随机分布的（图。E类).
出生后大脑结构的细胞构筑trk公司B（−/−）突变小鼠。A–D，野生型大脑的低倍显微照片(A、 C类)和trk公司B（−/−）(B、 D类)老鼠。注意P13的Nissl染色脑切片的正常外观(B类)和第16页(D类)trk公司B（−/−）小鼠与其同龄对照鼠的比较(A、 C、，分别）。E、 F、，P16野生型新皮质的高倍放大(E类)和trk公司B（−/−）(如果)老鼠。请注意，在trk公司B（−/−）小鼠(如果)（来自D、 插入).G、 H、，P10野生型大脑皮层钙调素免疫反应(G公司)和trk公司B（−/−）(H（H）)老鼠。皮质层表示为罗马数字.北卡罗来纳州，新皮质；H、，海马；T、，丘脑。放大倍数：A–D，2.5×;E、 F、，40×;G、 H、，10×.
表达不同钙结合蛋白的前脑神经元的分布，包括钙视网膜蛋白（图。F、 G公司)calbindin和parvalbumin（未显示）未显示野生型和trk公司B（−/−）小鼠。然而，小白蛋白在大脑皮层和海马的表达似乎延迟了trk公司B（−/−）突变小鼠（数据未显示）。以前在缺乏BDNF的小鼠中也报告过类似的结果(Jones等人，1994年).
凋亡细胞死亡增加trk公司B（−/−）缺陷小鼠
大脑中自然发生的细胞死亡主要发生在出生后的第一周，此后显著减少(Gould等人，1991年;Ferrer等人，1992年). 为了确定TrkB酪氨酸激酶受体的缺失是否影响出生后CNS神经元的存活，我们分析了P5–P18的Nissl染色切片trk公司B（−/−）小鼠出现核固缩。如图所示,trk公司B（−/−）小鼠在所分析的大多数大脑区域，包括新皮质、齿状回、纹状体、隔、丘脑和嗅球，表现出固缩核的数量显著增加。这些固缩的细胞核极度萎缩、深色，周围几乎没有细胞质，表明它们对应于凋亡细胞。在新皮质中，固缩核分布在所有皮质层（图。A、 B类)，尽管在不同的皮质区域之间观察到固缩细胞核的数量存在一些差异（见下文）。在海马体中，它们存在于海马CA1和CA3亚区，在齿状回颗粒细胞层的深层尤其丰富（图。C、 D类).
细胞死亡增加trk公司B（−/−）小鼠。A–D，新皮质的甲酚紫染色切片(A、 B类)和齿状回(C、 D类)P16控制的(A、 C类)和trk公司B（−/−）(B、 D类)老鼠。注意在新皮质的第二层和第三层中有固缩核(B、 箭头)齿状回的颗粒层(D类)在中trk公司B（−/−）突变小鼠。德国劳埃德船级社，颗粒层；H、，门；毫升，分子层。放大倍数，40倍。
确定观察到的前脑细胞死亡的性质trk公司对B（−/−）小鼠、这些突变小鼠及其野生型同窝小鼠的切片进行c-Jun免疫组织化学、TUNEL染色和电子显微镜检查。用c-Jun抗体染色，c-Jun是死亡神经元中上调的原癌基因产物(Ferrer等人，1996年)，显示免疫阳性细胞数量增加trk公司B（−/−）小鼠。大多数c-Jun阳性细胞表现出凋亡细胞的形态学特征（图。A类). 然而，在其他情况下，c-Jun-免疫活性神经元表现出一些类似神经元树突和胞体大小的过程（图。B类)因此提示c-Jun上调可能先于细胞凋亡的发生。类似地，大脑切片来源于trk公司经过TUNEL染色处理的B（−/−）小鼠显示凋亡细胞数量增加（图。D–G型). TUNEL阳性神经元的数量与Nissl染色观察到的固缩核的数量密切相关。最后，通过电子显微镜证实存在凋亡细胞。如图所示C类新皮层和海马体的垂死神经元表现出高度的染色质和细胞质浓缩，并经常被相邻细胞吞噬。
神经元trk公司B（−/−）小鼠死于凋亡。A、 B、，c-Jun抗体免疫标记显示第II层和第III层中存在固缩细胞(A类)和梨状皮层的退化神经元(B类)在第10页trk公司B（−/−）小鼠。C、，电子显微照片显示齿状回中凋亡细胞的特征性形态，该细胞被齿状回的相邻细胞吞噬trk公司B（−/−）鼠标。D–G，新皮质TUNEL染色（第II层和第III层）(D、 E类)和海马(F、 G公司); P13控制段(D、 F类)和trk公司B（−/−）(E、 G公司)老鼠。请注意trk公司B（−/−）小鼠。箭头在里面A类表示致密核。这个箭头表示c-Jun染色阴性的固缩细胞核。中的节A类和B类用甲酚紫复染。德国劳埃德船级社，颗粒层；H、，门；毫升，分子层。放大倍数：A、 B、，30×;C、，15,000×;D–G，40×.
要确定trk公司B（−/−）小鼠对应于特定的神经元群体，我们检测了几种钙结合蛋白的表达，包括钙结合蛋白、钙视网膜蛋白和小白蛋白。我们观察到，一些免疫反应细胞有萎缩的周核和极为珠状的萎缩树突，这些特征也与神经元的死亡有关（图。A、 B类). 这种萎缩免疫反应细胞存在于trk公司B（−/−）小鼠，但在野生型小鼠中很少观察到。此外，我们还检测到对小白蛋白（数据未显示）、钙结合蛋白或钙视网膜蛋白（图。C–E类). 这些观察强烈表明，中枢神经系统中的大多数死亡细胞trk公司B（−/−）小鼠是神经元。
钙结合蛋白在神经元变性中的表达trk公司B（−/−）突变小鼠。A–D，新皮质第二层和第三层钙调素免疫反应性(A、 B、D)和海马的定向层(C类)第10页，共页trk公司B（−/−）突变小鼠。推测，具有萎缩躯体和串珠树突的退化神经元对钙调素染色具有免疫反应性(A、 B，箭头).E、，P13新皮质第二层和第三层钙结合蛋白的表达trk公司B（−/−）小鼠。箭头在里面C–E类表示对不同钙结合蛋白免疫反应的固缩细胞。箭头表示未标记的固缩细胞。切片用甲酚紫复染。放大倍数：A、 B、，35×;C、 D、，40×;E类, 45×.
小鼠中枢神经系统细胞死亡的发育模式trk公司B（−/−）小鼠
接下来，我们分析了海马、纹状体、丘脑和顶叶新皮质中细胞死亡的发育过程trk公司B（−/−）小鼠，通过量化出生后不同发育阶段的固缩核数量。P5和P8之间的固缩核数量没有显著差异trk公司B（−/−）和它们的对照窝友（图。A类)大脑中分析的大部分区域。然而，出生后第一周，纹状体和丘脑网状核的固缩核数量显著增加。trk公司出生后第一周（P10–P12）存活的B（−/−）动物显示，在我们分析的大多数大脑区域中，固缩细胞核显著增加。齿状回的这种增加更为显著。在这些突变小鼠的新皮质、纹状体和丘脑网状核中也观察到较温和的增加（图。B类). 对照组和对照组之间固缩核数量的差异trk公司B（−/−）动物在存活第二周的动物中变得更加明显（P13–P18）。例如，这些动物的海马CA3区、新皮质和腹后内侧丘脑核中的固缩核是其对照窝的两到四倍。这种差异更为显著，齿状回中的差异增加了九倍（图。C类). 有趣的是，出生后第二周，纹状体和丘脑网状核的细胞死亡没有显著差异（图。C类). 这些观察结果表明，在所有皮质层和海马亚区内，致密核的数量从P10逐渐增加到P18trk公司B（−/−）小鼠，这些前脑区域自然发生细胞死亡后的一段时间。此外，我们的结果表明trk公司B（−/−）小鼠在CNS的不同区域遵循特定的时间模式。
在几个发育阶段，大脑不同区域的固缩核数量（表示为每100000μm的数量2).A、，P5–P8小鼠（对照小鼠，n个= 4;trk公司B（−/−）小鼠，n个= 4).B、，P10–P12小鼠（对照小鼠，n个=6；trk公司B（−/−）小鼠，n个=7）。C、，P13–P18小鼠（对照小鼠，n个= 10;trk公司B（−/−）小鼠，n个= 11).黑色条，对照小鼠；白色条，trkB（−/−）突变小鼠。DG、，齿状回；CA3、，CA3海马区；II–III类和V–VI，皮质层II和III以及V和VI；VPM、，丘脑腹后内侧核；房地产税，丘脑网状核；STR、，纹状体。误差条表示SEM；星号表明控制和trk公司B（−/−）突变小鼠(*第页< 0.01; **第页< 0.001).
器官型切片培养中神经元细胞死亡增加trk公司B（−/−）小鼠
为了研究TrkB受体是否在中枢神经系统神经元损伤后的存活中起到调节作用，我们测量了海马薄片制备中神经元细胞的死亡率。从新生小鼠制备器官型切片培养物，并在培养3或5天后进行检查。此外，为了诱导损伤，新生儿海马的冠状横断也会导致已经到达靶区的投射神经元（如CA3区和室下区）被切断(拜耳，1980年; 苏佩尔和索里亚诺，1994年）。3天后，从野生型切片，trk公司B（+/-），或trk公司B（−/−）新生小鼠表现出保存完好的细胞结构模式，其中所有主要的海马亚区和层均可识别（图。). 然而，在所有海马亚区都观察到大量的固缩细胞核，这表明神经元细胞死亡是由于在制备这些器官型切片过程中造成的损伤。定量分析致密核的数量显示海马CA3区和海马CA3下区显著增加trk公司将B（−/−）小鼠与来自杂合或野生型动物的培养物中的小鼠进行比较（图。).
海马切片培养中细胞死亡增加trk公司B（−/−）小鼠。A、 B、，甲酚紫染色切片显示两个对照组海马脑片的正常结构(A、 C类)和trk公司B（−/−）小鼠(B、 D类)培养3d后。C、 D、，高倍显微照片显示trk公司B（−/−）突变小鼠(D类)与对照小鼠相比(C类).CA1、，金字塔层CA1；CA3、，锥体层CA3；DG、，齿状回；某人，副心室。放大倍数：A、 B、，10×;C、 D、，40×.
3天后海马不同区域的固缩核数量(A类)和5(B类)培养基中的d（表示为每25000μm的数量2).黑色条，对照小鼠(n个=每组文化中为8）；白条，trkB（−/−）突变小鼠(n个每组培养物中=8个）。DG、，齿状回；CA1公司和CA3、，CA1和CA3海马区；某人，副心室。误差条表示SEM；星号表明控制和trk公司B（−/−）突变小鼠(*第页< 0.001; **第页< 0.0001).
相反，我们没有观察到海马其他区域死亡细胞的数量增加trk公司B（−/−）小鼠，如该培养模型中的CA1区和齿状回。这些观察结果可能归因于这样一个事实，即齿状回中的神经元在这种范式中没有轴切。同样，大多数CA1神经元仍在新生小鼠中迁移，可能尚未达到其目标（Supér和Soriano，1994）。这些结果表明TrkB受体在轴切断后发生细胞死亡的海马神经元中具有保护作用。培养5d后，对照培养物中的固缩核数量显著减少。此时，从突变体中提取的切片中未观察到细胞死亡的显著增加trk公司B（−/−）小鼠（图。)这表明，在这种范式中，那些抵抗细胞死亡的神经元并不受TrkB受体缺失的影响。
为了确定在这种范式中诱导的细胞死亡是否可以用不同的神经营养素来挽救，我们用NGF、BDNF、NT-3、NT-4或载体溶液处理对照海马切片培养物。BDNF和NT-4都挽救了在对照培养物中观察到的副心室和CA3中的细胞死亡(第页< 0.01; 图。). 有趣的是，NT-3和NGF能够挽救CA3中观察到的细胞死亡(第页< 0.01; 图。). 然而，没有一种神经营养素能够挽救齿状回或CA1海马区的细胞死亡。
培养中神经营养素治疗3d后海马不同区域的固缩核数（以每25000μm的数量表示2).黑色条，车辆；虚线条，BDNF；灰色条，NT-3；白色条，NT-4；条纹条，NGF公司(n个=每组8或9个培养基）。DG、，齿状回；CA1公司和CA3、，CA1和CA3海马区；某人，副心室。误差条表示SEM；星号表明不同处理之间存在显著差异(*第页<0.01，方差分析，Fisher保护最小显著差异事后（post-hoc）比较）。
TrkB信号支持轴切断术后运动神经元的存活体内
胚胎发育期间面部或脊髓运动神经元的存活不需要TrkB或TrkC受体(Silos-Santiago等人，1997年). 运动神经元轴切断后，周围神经和失神经肌肉中的神经营养素表达水平升高(Heumann等人，1987年;Meyer等人，1992年;Funakoshi等人，1993年;Koliatsos等人，1993年). 此外，轴切运动神经元中p75和TrkB受体的表达增加(Ernfors等人，1989年;Piehl等人，1994年;小林等，1996年). 这些观察表明，神经营养素受体信号可能介导运动神经元的存活或促进损伤后轴突再生。
为了阐明TrkB信号在促进损伤后出生后运动神经元存活方面的作用，我们量化了野生型轴切术后面部运动神经元的数量，trk公司B（+/-），和trk公司B（−/−）小鼠。因为大多数trk公司B（−/−）小鼠不能存活到2周以上，在P5切断左侧面神经，并允许动物存活到P10。存活的运动神经元trk公司B（−/−）小鼠在形态学上与野生型小鼠无明显区别（图。A–F). 此外，这些轴切运动神经元中TrkB受体的缺失对多种标记物的表达没有影响，包括p75、降钙素基因相关肽、GAP-43免疫反应性（未显示）以及乙酰胆碱酯酶活性（图。G、 H（H）). 虽然这些运动神经元的胞体区(第页<0.02）更小（250±3.4μm2)英寸trk公司B（−/−）小鼠与其野生型同窝小鼠相比（261±3.9μm2)，size–频率直方图trk公司B（−/−）动物似乎与野生型小鼠相似（数据未显示）。此外，手术侧存活的面部运动神经元的百分比在trk公司B（−/−）小鼠（27%）与其野生型窝友（53%；表). 与我们最近的研究一致(Silos-Santiago等人，1997年)，野生型和非手术侧的面部运动神经元数量没有差异trk公司B（−/−）动物（表). 这些结果进一步支持了TrkB受体信号传递保护出生后中枢神经系统神经元免受轴索霉素诱导死亡的概念。
手术后面部运动神经元数量减少trk公司B（−/−）小鼠。A–F，甲酚紫染色切片显示轴切的面部运动核的尺寸减小(B类)但幸存运动神经元的正常外观(E类)在第10页trk公司B（−/−）小鼠。A、 C、D、，野生型小鼠。B、 E、F、trkB（−/−）小鼠。G、 H、，P7野生型的乙酰胆碱酯酶活性(G公司)和trk公司B（−/−）(H（H）)老鼠。在trk公司与野生型小鼠相比，B（−/−）突变小鼠。放大倍数：A、 B、G、H、，2.5×;C–F，100×.
表1。
| 野生型 | trk公司B（+/-） | trk公司B（−/−） |
|---|
| 对侧 | 2260 ± 142 | 2518 ± 72 | 2484 ± 128 |
| 同侧的 | 1209 ± 134 | 1282 ± 47 | 680 ± 90 |
| 存活率（%） | 53 ± 4 | 52 ± 2 | 27 ± 3 |
| n个 | 7 | 4 | 7 |
脚注
这项工作得到了西班牙教育和卫生部SAF94-743和PM95-102的支持。J.F.得到了Wenner-Gren基金会的支持。我们感谢M.Garber、J.Gullo-Brown、L.Long和J.Wolf提供的出色技术援助。
通信地址：Inmaculada Silos-Santiago，Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute，H24-09，P.O.Box 4000，Princeton，NJ 08543-4000。
弗里森博士目前的地址：瑞典斯德哥尔摩s-17177卡罗林斯卡研究所神经科学部。
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