实验-治疗-医学。2019年7月；18(1): 133–138.
葛根素通过抑制硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化中ERK1/2信号通路减轻肝纤维化
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李秀清
1中国江苏省连云港市连云港东方医院消化内科，邮编：222042
张慧（音）
2中国江苏省连云港市连云港第二医院消化内科
潘丽娟
1中国江苏省连云港市连云港东方医院消化内科，邮编：222042
邹海鸥
1中国江苏省连云港市连云港东方医院消化内科，邮编：222042
苗小南
1中国江苏省连云港市连云港东方医院消化内科，邮编：222042
景成
1中华人民共和国江苏省连云港市连云港东方医院胃肠肝科222042
吴友山
1中国江苏省连云港市连云港东方医院消化内科，邮编：222042
1中国江苏省连云港市连云港东方医院消化内科，邮编：222042
2中国江苏省连云港市连云港第二医院消化内科
2017年10月13日收到；2019年3月21日验收。
- 数据可用性声明
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
摘要
肝纤维化是一个复杂的病理过程，是肝硬化发展的早期阶段，最终可能发展为肝细胞癌。目前，还没有有效的治疗肝纤维化的方法。葛根素是一种传统中草药，常用于治疗各种疾病。此外，它还被认为对肝纤维化有治疗作用。然而，葛根素是否通过ERK1/2信号通路减少肝纤维化，从而抑制肝星状细胞（HSC）的激活和肝纤维化中过度胶原沉积，目前尚不清楚。当前研究的目的是建立肝纤维化体内通过腹腔注射硫代乙酰胺（TAA）建立模型，观察葛根素对肝纤维化的治疗作用。苏木精、伊红和Van Gieson染色用于检查与肝纤维化相关的组织病理学变化。检测肝脏羟脯氨酸含量以确定肝脏中胶原蛋白的总量。western blot分析测定转化生长因子β1（TGFβ1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原、纤维连接蛋白、ERK1/2和p-ERK1/2的相对蛋白表达水平。与对照组相比，TAA组大鼠肝组织标本的组织病理学变化和胶原纤维含量显著增加（P<0.05）。此外，葛根素治疗可显著降低大鼠肝组织样本的组织病理学变化和胶原纤维含量（P<0.05）。与对照组相比，TAA组TGFβ1、α-SMA、I型胶原、纤维连接蛋白和p-ERK1/2的相对蛋白表达水平显著上调（p<0.05），而葛根素治疗逆转了这些变化。这些结果表明，葛根素治疗可通过抑制肝纤维化中TGF-β/ERK1/2通路，减少HSC活化，减轻细胞外基质蛋白表达水平。
关键词：葛根素、肝纤维化、肝星状细胞、细胞外基质、ERK1/2通路
介绍
各种形式的慢性肝病可导致肝星状细胞（HSC）活化并诱导肝纤维化，这是肝硬化进展的早期步骤，最终可能发展为肝细胞癌。值得注意的是，这些类型的肝病被认为是全球主要的健康问题(1). 肝纤维化是一种常见的病理过程，最终可能导致肝衰竭(2). 肝纤维化是指肝细胞外基质（ECM）蛋白的重塑和过度沉积(3). HSC的激活是肝纤维化过程中的一个重要事件(4). 活化的HSC通常被认为是纤维化ECM蛋白的主要产生者(5)，包括I型胶原和纤连蛋白。转化生长因子β1（TGFβ1）被认为是肝纤维化中最强的效应器，它作为主要的促纤维化细胞因子，促进成纤维细胞的募集、增殖和分化为产生ECM的肌成纤维细胞(6). 有几个已知的信号通路参与肝纤维化的进展。TGFβ1通过Smad依赖和Smad依赖途径诱导肝纤维化(7)，包括TGFβ1/ERK1/2信号通路(8). 据报道，ERK1/2通路通过与其他信号通路的串扰在HSC增殖和激活中起重要作用(9). 值得注意的是，先前的一项研究表明，ERK1/2信号通路的抑制增强了大鼠的肝纤维化(10). 此外，已经证明肝纤维化的进展是可逆的(11–14). 有几种治疗药物，包括奥利司他、二甲双胍和坎地沙坦，通常用于抗纤维化治疗(15,16). 然而，主要的局限性是缺乏有效的肝纤维化治疗策略(17,18). 因此，治疗肝纤维化需要新的、有效的治疗靶点。
葛根素是一种中草药，已知其具有多种生理活性，包括抗氧化和抗炎活性(19,20). 葛根素已广泛用于治疗各种疾病，包括缺血性中风(21)、肾纤维化(22)心肌缺血与高血压(23). 此外，葛根素也被认为对肝纤维化有治疗作用。先前的研究表明，葛根素可以通过调节TGFβ1的表达和抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/核因子κB亚单位1（NF-κB）来减轻肝纤维化(24)，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）/Akt(25)和TGFβ1/Smad(26)信号通路。然而，葛根素是否通过ERK1/2信号通路减少肝纤维化，从而抑制HSC的激活和肝纤维化中过度胶原沉积，目前尚不清楚。
硫代乙酰胺（TAA）是一种含硫化合物，广泛用于诱导大鼠肝纤维化，以研究潜在抗纤维化药物的潜在机制和治疗效果(27). 因此，本研究的目的是研究葛根素在TAA诱导的大鼠肝纤维化中的抗纤维化作用及其潜在机制。此外，还分析了TGFβ1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原、纤维连接蛋白、p-ERK1/2和ERK1/2的相对蛋白表达水平的变化。
材料和方法
实验动物和治疗
从山西医科大学实验动物中心（中国太原）获得36只雄性Sprague-Dawley大鼠（年龄6~8周，体重180~200g），用于建立肝纤维化模型体内通过腹腔注射200 mg/kg硫代乙酰胺（TAA:Sigma-Aldrich；Merck KGaA）建立模型。大鼠被安置在环境控制的繁殖室（12小时黑暗/光照周期；温度25±1°C；湿度55±5%），并喂食啮齿动物实验室的食物和无菌水。大鼠随机分为三组：对照组、TAA组和葛根素/TAA组。对照组大鼠每天服用相同剂量的PBS一次（n=12）。TAA组大鼠每周注射200 mg/kg TAA 3次，共8周（n=12）。葛根素/TAA组大鼠与TAA组大鼠一样注射TAA，但在第5周，在给予TAA的同时，它们也每天服用0.1 ml/10 g葛根素（n=12）。通过腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉所有大鼠，并于第8周处死。采集肝组织并将其储存在−80°C下，以供进一步分析。本研究中使用的所有动物实验方案均遵循国际公认的原则，并得到了山西医科大学（中国太原）动物护理与使用委员会的批准。
免疫组织化学
将肝组织在25–27°C的10%中性缓冲福尔马林中固定一周，在70–100%乙醇梯度中脱水，在二甲苯中洗涤并嵌入石蜡中。将石蜡包埋的肝组织样本切割成4-5µm厚的切片。对于一般组织学，组织切片随后在室温下用苏木精染色5分钟，然后在室温下伊红染色5分钟。在室温下通过Van Gieson（VG）染色2分钟来观察形态学变化。在光学显微镜下观察病理变化（放大倍数×200）。使用Image-Pro Plus分析软件（6.0版；美国马里兰州Rockville Media Cybernetics，Inc.）分析胶原蛋白含量。
肝脏羟脯氨酸含量分析
根据制造商的方案，使用羟脯氨酸检测试剂盒（目录号02140R1；南京建成生物工程研究所，中国南京）测定肝脏中的羟脯氨酸含量，作为胶原蛋白含量的间接指标。简单地说，将肝组织样品水解、冷冻干燥，并在分光光度计上以550 nm的波长测量羟脯氨酸含量（Molecular Devices，LLC，Sunnyvale，CA，USA）。
蛋白质印迹分析
肝组织样品均化，并使用HEPES提取缓冲液（Sangon Biotech，Co.，Ltd.）提取总蛋白。使用双钦尼克酸测定法（美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司）对总蛋白进行定量，并通过SDS-PAGE在10%凝胶上分离等量的总蛋白（40µg蛋白质/车道）。随后将分离的蛋白质转移到聚二氟乙烯膜上，并在室温下用3%脱脂牛奶封闭2小时。用TGFβ1（1:1000；类别号ab92486）、α-SMA（1:1000，类别号ab5694）、I型胶原（1:1000、类别号ab34710）、纤维连接蛋白（1:1000）、磷酸化（p-）ERK1/2（1:1000；所有Abcam）在4°C下过夜。在初步培养后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔二级抗体（1:5000；目录号D110066；Sangon Biotech，Co.，Ltd.）培养2小时。使用Super ECL检测试剂盒（美国加利福尼亚州Hercules Bio-Rad Laboratories，Inc.）对蛋白质条带进行可视化。使用Bio-Rad Quantity One软件（4.6.2版；Bio-RadLaboratories，Inc.）量化蛋白质表达，以β-actin作为负荷控制。
统计分析
数据表示为平均值±标准偏差。所有统计分析均使用SPSS软件（版本16.0；SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行。采用单因素方差分析和Student-Newman-Keuls检验分析治疗组间的差异。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
葛根素减轻TAA诱导大鼠肝纤维化的炎症和纤维化
所有大鼠均在实验过程中存活。使用H&E和VG对每个实验组大鼠的肝组织样本进行染色，以检查与肝纤维化相关的组织病理学变化。H&E染色显示，与对照组相比，TAA组肝细胞明显变性坏死，炎症细胞浸润。此外，与对照组相比，TAA组肝脏的正常结构发生改变，纤维间隔组织明显形成。然而，与TAA组相比，葛根素/TAA组的病理变化不太严重(). VG染色观察肝组织中I型胶原的存在。与对照组相比，TAA组肝小叶周围形成纤维间隔，胶原纤维水平显著增加(). 此外，与TAA组相比，葛根素/TAA组的胶原沉积较少()。
肝纤维化的组织病理学改变体内模型。（A） 苏木精-伊红染色检测对照组、TAA组和葛根素/TAA组大鼠肝组织标本的病理变化。黑色箭头突出显示肝细胞的变性和坏死以及纤维间隔组织的形成。（B） Van Gieson染色用于检查大鼠肝组织样本中是否存在I型胶原。比例尺，50µm。（C） 检测肝脏羟脯氨酸含量。（D） 通过western blot分析测定大鼠肝组织样品中I型胶原和纤维连接蛋白的相对蛋白表达水平。β-actin作为负荷对照（n=12）*与对照组相比，P<0.05。#与TAA组相比P＜0.05。硫代乙酰胺。
与对照组相比，TAA组肝羟脯氨酸含量显著增加（P<0.05；). 此外，与TAA组相比，葛根素/TAA组的肝脏羟脯氨酸含量显著降低（P<0.05；). 同样，western blot分析显示，与对照组相比，TAA组大鼠肝脏I型胶原和纤维连接蛋白的相对蛋白表达水平显著上调（P<0.05；). 然而，与TAA组相比，葛根素/TAA组I型胶原和纤维连接蛋白的蛋白表达水平显著下调（P<0.05；). 这些结果表明，葛根素治疗可以减轻肝纤维化的炎症和纤维化。
葛根素减轻TAA诱导大鼠肝纤维化TGFb1表达和HSC活化
进一步研究葛根素对肝纤维化和HSC活化的影响体内TAA诱导肝纤维化后，检测TGFβ1和α-SMA的相对表达水平。TGFβ1被认为是肝纤维化最强的效应剂，而α-SMA是HSC活化的标志物(28,29). 与对照组相比，TAA组TGFβ1和α-SMA的相对蛋白表达水平显著升高，而葛根素/TAA组TGFα1和α-SMA的表达水平显著降低（P<0.05；). 这些结果表明，葛根素可能降低TGFβ1的生成和HSC的活化。
TGFβ1和α-SMA蛋白表达。通过western blot分析测定大鼠肝组织中（A）TGFβ1和（B）α-SMA的相对蛋白表达水平。β-actin作为负荷对照（n=12）*与对照组相比，P<0.05。#与TAA组相比，P<0.05。转化生长因子β1；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；硫代乙酰胺。
葛根素抑制ERK1/2信号通路
ERK1/2信号通路在肝纤维化中起重要作用(10,30). 因此，为了研究葛根素是否参与调节ERK1/2减少HSC活化和ECM沉积，我们检测了ERK1/2和活化形式p-ERK1/2的相对表达水平。与对照组相比，TAA组p-ERK1/2的相对蛋白表达水平显著增加(). 相反，与TAA组相比，葛根素/TAA组p-ERK1/2的相对蛋白表达水平显著降低(). 与TAA组相比，葛根素/TAA组p-ERK1/2与ERK1/2的比值也显著降低（p<0.05；). 实验组间ERK1/2蛋白表达水平无显著差异(). 这些结果表明，葛根素在肝纤维化中可能抑制ERK1/2磷酸化。
ERK1/2和p-ERK1/2表达。（A） 通过western blot分析测定大鼠肝组织中ERK1/2和p-ERK1/2的相对蛋白表达水平。（B） ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的定量。β-actin作为负荷对照（n=12）*与对照组相比，P<0.05。#与TAA组相比，P<0.05。硫代乙酰胺。
讨论
肝纤维化是一个重大的全球公共卫生问题(31)是由几种慢性肝病引起的(32). 肝纤维化的发病机制是复杂的，其特征是ECM生成增强和ECM蛋白沉积改变。值得注意的是，不受控制的肝纤维化可发展为肝硬化(33). 目前可用的肝纤维化治疗方案并不十分有效(34). 因此，需要对肝纤维化进行更有效的治疗。
TAA可以干扰肝脏中的蛋白质合成和酶代谢，从而导致慢性肝损伤(35,36). 以前的研究表明，TAA可以诱导大鼠肝纤维化(37,38). 在当前研究中，H&E和VG染色显示坏死肝细胞和浸润性炎性细胞数量显著增加，TAA组胶原纤维沉积明显增加，直接观察到肝纤维化。此外，与对照组相比，TAA组的肝脏羟脯氨酸含量显著增加。这些结果表明肝纤维化体内在大鼠体内成功建立模型。
包括葛根素在内的中草药可以对肝纤维化产生良好的效果，因此ECM成分可以从正常基底基质（包括IV型胶原）转变为纤维化基底基质（包含I型胶原）(39). 在以前的研究中，葛根素显著降低了肝纤维化中羟脯氨酸和I型胶原的水平(25,26). 在目前的研究中，葛根素治疗后，肝脏炎症以及I型胶原和纤连蛋白的表达水平显著减轻，这与之前的报道一致(40,41). 目前的研究结果表明，葛根素可能对肝纤维化有抗纤维化作用。然而，葛根素在肝纤维化中的潜在机制尚不清楚。
HSC被广泛认为是协调肝脏ECM形成的关键成纤维细胞(5). HSC的激活在肝纤维化过程中起着重要作用(4). TGFβ1是HSC的有效激活剂(42)和I型胶原蛋白生成的有效诱导剂(43). α-SMA是广泛接受的活化HSC标志物(44). 先前的研究表明，葛根素治疗可减少TGF-βl和α-SMA的生成(24,45). 在当前的研究中，葛根素治疗后TGFβ1和α-SMA的蛋白表达水平显著降低，这与以前的报告类似(26,40,45). 综上所述，这些结果表明葛根素可能减少TGFβ1的生成和HSC的激活，从而减轻肝纤维化中ECM蛋白的表达。
以往研究表明，葛根素通过抑制TNF-α/NF-κB，调节血清酶，减少TGF-β1的生成，抑制过度胶原沉积，从而减轻肝纤维化(24)，PI3K/Akt(25)和TGFβ1/Smad(46)信号通路。然而，葛根素是否通过ERK1/2信号通路减轻肝纤维化尚不清楚。因此，目前的研究假设葛根素可能通过ERK1/2信号通路减轻肝纤维化。在当前研究中，与TAA组相比，葛根素/TAA组p-ERK1/2与ERK1/2蛋白表达水平的比值显著下调，这表明葛根素在肝纤维化中的抗纤维化作用可能通过ERK1/2信号通路发生。这些结果表明，葛根素可能通过抑制ERK1/2通路来减少HSC活化和ECM沉积，从而改善肝纤维化。线路接口单元等(47)据报道，葛根素抑制乳腺癌细胞中ERK磷酸化。因此，葛根素可能参与调节ERK1/2磷酸化，从而抑制肝纤维化中ERK1/2信号传导。然而，葛根素是否与ERK1/2的其他功能域结合尚需进一步研究。
总之，目前的研究表明，葛根素可能通过抑制TGF-β/ERK1/2信号通路来减少HSC激活，从而减轻肝纤维化中ECM蛋白的表达。因此，葛根素可能是治疗肝纤维化的潜在候选治疗药物。然而，还需要进一步的研究来验证葛根素对肝纤维化的潜在治疗作用。
基金
本研究得到连云港东方医院基金会（批准号：2016-12）的资助。
数据和材料的可用性
本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。
作者的贡献
YW设计了实验。HaZ、LP、HuZ、XM和JC进行了实验。XL分析了数据并准备了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
道德批准和参与同意
本研究获得了山西医科大学伦理委员会（SCXK2009-0001）的批准。
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