一氧化氮。作者手稿；可在PMC 2020年6月1日获得。
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运动训练增强慢性心力衰竭大鼠室旁核神经元一氧化氮合酶二聚化
美国NE 68198-5850奥马哈UNMC细胞和综合生理学系
*通讯作者。内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，地址：985850 Nebraska Medical Center，Omaha，NE 68198-5850，USA。ude.cmnu@amrahsn（N.M.Sharma）。 摘要
运动训练（ExT）是一种公认的非药物疗法，可改善慢性心力衰竭（CHF）患者的健康和生活质量。由于自主神经系统的不平衡，交感冲动过度是CHF的特征。室旁核（PVN）中的神经元一氧化氮合酶（nNOS）产生一氧化氮（NO•），众所周知，一氧化氮调节交感神经张力。之前我们已经证明，在CHF期间，nNOS的催化活性二聚体形式显著降低，同时nNOS（PIN）表达的蛋白抑制剂增加，PIN是一种将二聚nNOS分解为单体并促进其降解的蛋白。nNOS的二聚还需要（6R）-5,6,7,8-四氢生物蝶呤（BH4）来保持稳定性和活性。以前，我们已经证明ExT可以改善PVN中NO介导的交感神经抑制；然而，其分子机制尚不明确。我们假设；ExT通过消除CHF大鼠PVN中PIN的变化，增加nNOS的水平和催化活性形式，从而恢复交感驱动。通过冠状动脉结扎在成年雄性Sprague-Dawley大鼠中诱导CHF，该方法可靠地模拟心肌梗死患者的CHF。手术4周后，Sham和CHF大鼠接受3周的渐进式平板运动。ExT显著降低CHF大鼠PVN中PIN的表达，增加nNOS的二聚体/单体比率（p<0.05）。此外，我们发现GTP环水解酶1（GCH1）表达降低：CHF大鼠PVN中BH4生物合成的一种速率限制酶，这表明BH4可用性降低可能也有助于nNOS二聚体降低。有趣的是，CHF诱导的GCH1表达的降低随着ExT的增加而增加。我们的研究结果表明，ExT纠正了PIN和GCH1表达的降低，并增加了PVN中nNOS的二聚体/单体比例，这可能导致NO•生物利用度的增加，从而改善CHF期间激活的交感神经驱动。
关键词：nNOS、PIN、BH4、运动训练、室旁核
1.简介
慢性心力衰竭（CHF）的一个特征是神经体液驱动力增强，肾素-血管紧张素系统和交感神经系统过度激活[1]. 交感神经信号增强可直接加剧心脏应激，也可通过增加肾交感神经活动（RSNA）刺激肾脏液体潴留，尽管治疗有显著改善，但这是发病率和死亡率的重要原因。运动训练（ExT）是一种公认的非药物疗法，可改善CHF患者的健康和生活质量。根据美国心脏协会（American Heart Association）最近发布的《全面心血管健康指南》，建议每周至少5天进行30分钟中等强度的有氧运动，为了降低血压和胆固醇，每周进行3到4次中等强度到高强度的有功运动，平均40分钟[2].
CHF时下丘脑室旁核（PVN）被激活，PVN是整合交感神经流出的关键区域[三–8]. PVN包含前自主神经元，这些神经元通过投射到脊髓中间外侧细胞柱或通过头端腹外侧髓质直接影响交感神经流出，并与参与心血管功能控制的大脑其他区域相互连接[三,9–11]. 许多不同的神经递质会影响PVN神经元的活动[三,12,13]PVN内抑制（一氧化氮/GABA）和兴奋（谷氨酸/血管紧张素II）机制的改变在高血压和CHF等病理条件下诱导过度的交感兴奋反应[6,14,15]. 在PVN中，一氧化氮（NO•）作为一种逆行抑制性神经递质，调节突触效能并调节神经元活动，也被认为在调节交感神经流出中发挥重要作用[16,17]导致交感神经活动的变化。降低NO水平•减少GABA释放及其抑制作用[18]并增强CHF大鼠的谷氨酸能作用[19].
此前，我们报道了ExT改善心力衰竭大鼠PVN内内源性钝化NO•的机制[20]. 这一现象的监管细节和可能机制在很大程度上仍不清楚。在我们最近的研究中，我们证明了神经元一氧化氮合酶（nNOS）的蛋白抑制剂，简称为PIN介导的翻译后机制，影响CHF大鼠PVN内nNOS水平[21]. 据报道，PIN与nNOS的Met-228到His-244的17残基肽片段结合[22]并破坏nNOS二聚体的稳定性[23]，酶活性所需的构象[24]. 泛素蛋白酶体系统降解功能受阻的单体酶。我们的研究表明，CHF期间PVN中nNOS的下调是由于泛素介导的蛋白水解降解，涉及nNOS和PIN之间通过Ang II介导的信号通路相互作用。二聚nNOS水平的降低可能导致NO•介导的交感神经抑制降低。本研究旨在确定ExT是否通过降低CHF大鼠PVN中PIN的水平来恢复二聚nNOS水平。
2.方法
2.1. 充血性心力衰竭动物模型
雄性Sprague-Dawley大鼠体重220-240克，购自东北奥马哈Sasco育种实验室。根据内布拉斯加州大学医学中心批准的指南，大鼠被安置在室温（24-26°C）下12小时光暗循环室中，并可自由获取食物和水，机构动物护理和使用委员会（IACUC）。IACUC遵循美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（国家学术出版社，2011年）中建议的指南。内布拉斯加州大学医学中心IACUC委员会根据动物福利保障（A3294-01）的规定提交、审查并批准了用于这些研究的所有方案。如前所述，CHF是由冠状动脉结扎引起的[5,25–27]. 简单地说，大鼠被随机分为两组：CHF和Sham。在手术过程中，用2–3%的异氟醚以60次/分钟的速度给大鼠通气。在肺动脉流出道和左心房之间结扎左冠状动脉前降支。假手术大鼠以相同方式制备，不结扎冠状动脉。实验前，允许大鼠恢复4周。在每个实验结束时（7周），通过血流动力学和解剖参数评估左心室功能障碍和衰竭[28]. 超声心动图测量左心室收缩末期（LVESD）、左心室舒张末期（LVEDD）尺寸、缩短分数（FS）和射血分数（EF）。使用经右颈动脉插入左心室的Mikro Tip导管（Millar Instruments，Houston，TX）测量左心室舒张末压（LVEDP）。为了测量梗死面积，心脏被解剖，没有邻近组织，心房和右心室被切除，左心室的数字图像被柯达DC290数码相机拍摄下来（柯达，罗切斯特，纽约州）。使用Sigma Scan Pro定量梗死面积和左心室总面积。梗死面积的大小除以左心室的总大小来确定梗死面积（%）。LVEDP升高（≥15 mmHg）和梗死面积（>30%左室总壁）的大鼠被认为患有CHF。排除冠状动脉手术后不符合上述标准的大鼠。冠状动脉结扎诱导的心力衰竭模型已被广泛应用[5,14,25,26,29]并在大鼠体内产生一种类似于人类最常见的心力衰竭原因的心力衰竭模型[25–27].
2.2. 运动训练协议
结扎术后4周，Sham和CHF大鼠随机分为两组，每组进行3周的渐进式平板运动。在训练期间，大鼠以10 m/min至0%的初始跑步机速度在5至15 min/天之间运动五天。为了确保显著的耐力ExT方案，跑步机等级和速度分别逐渐增加到10%和25 m/min，运动持续时间增加到60 min/天。只有那些在跑步机上稳定奔跑，很少或没有刺激（电刺激）的动物才被纳入研究。其余的Sham和CHF大鼠每天进行治疗，治疗方法与ExT大鼠类似，但跑步机跑步除外。这些动物被称为久坐动物。所用的四组大鼠如下：1）Sham SED；2） Sham-ExT；3） CHF-Sed；4） CHF-ExT.公司。
2.3. PVN区域的微穿孔
用戊巴比妥（65 mg/kg/ip）对大鼠实施安乐死，取出大脑并迅速冷冻在干冰上。使用经二乙基焦碳酸酯处理的18号钝针，将PVN双侧打孔，该针连接到使用Palkovit和Brownstein的注射器上[30]之前记录的技术[21,26,28,31].
2.4. 蛋白质印迹分析
在裂解缓冲液（10 mM Tris.l mM EDTA，1%SDS，0.1%Triton X-100，含完整蛋白酶抑制剂混合物）中裂解穿孔PVN组织。在还原条件下，通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对PIN（20μg）和10%SDS-PAGE对GCH1（30μg）和nNOS（20μg）分离等量的蛋白质裂解物，然后电泳转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上。使用TBST（10 mM Tris，150 mM NaCl，0.05%吐温-20）中的脱脂干乳（5%w/v）在室温下封闭膜1 h。用针对PIN的抗体检测斑点（Santa Cruz，sc-13969[21,32–34]，1:500稀释），nNOS[21,28,32,35,36]（圣克鲁斯，sc-302,1:500稀释），GCH1[37]（Origene，TA323417，1:1000稀释）、微管蛋白（Sigma，T4026，1:1500稀释）或β-肌动蛋白（Santa Cruz，sc-4778,1:2000稀释）。磷酸化nNOS Ser847[38,39]（Abeam，ab-16650,1:1000稀释）和nNOS Ser1417[40,41]使用5%BSA作为阻断缓冲液检测PVN中的（Thermo Fisher，PA1-032，1:1000稀释）。然后在室温下将膜与辣根过氧化物酶偶联的相应二级抗体孵育40分钟，最后使用增强化学发光（ECL）试剂（皮尔斯化学公司，罗克福德，IL）进行开发。图像J（NIH）用于量化信号。
2.5. 抗SDS的nNOS二聚体和单体的测定
在还原条件下，使用低温SDS-PAGE（LT-PAGE）分析耐SDS的nNOS二聚体和单体[42]如前所述[21]. 简言之，在使用5%分离凝胶进行分级之前，将标准莱姆利缓冲液中的40μg蛋白质在4°C下孵育30分钟。电泳在50V的冷室中进行，电泳前将凝胶和缓冲液预平衡至4°C，以保持凝胶温度低于15°C。LT-PAGE后，将凝胶转移到PVDF膜上，在30V的冷室中过夜，并按照常规的Western blot分析，用nNOS抗体检测印迹。
2.6. 免疫荧光染色
对四组大鼠包括PVN在内的冠状脑切片进行PIN染色。麻醉大鼠（戊巴比妥，65 mg/kg）经心灌注150 ml肝素化生理盐水，然后在0.1 M磷酸钠缓冲液中灌注250 ml 4%多聚甲醛[28]. 大脑在4°C的4%多聚甲醛溶液中固定4小时，然后放置在30%蔗糖中72小时。用10%正常山羊血清、0.02%Triton X-100磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下封闭自由漂浮切片（30μm）1小时，然后用PIN（sc-13969，1:200）孵育一级抗体过夜。用PBS清洗后，在黑暗中室温下用Cy3-共轭山羊抗兔二级抗体（1:500）孵育切片4小时。用PBS洗涤后，用荧光贴装G（Southern Biotech，AL）将切片安装在载玻片上。使用Leica-DMR显微镜和相应的滤镜观察载玻片，并使用Image J软件（NIH）定量免疫荧光。分析三个代表PVN的交替切片（前角后方2.0±0.2 mm）。
2.7. 四氢生物蝶呤和二氢生物蝶素ELISA
使用MyBioSource的ELISA试剂盒测量PVN裂解物中四氢生物蝶呤（BH4）和二氢生物蝶苷（BH2）的组织水平；加利福尼亚州圣地亚哥，遵循制造商说明一式四份。BH4 ELISA试剂盒使用单克隆抗BH4抗体和BH4-HRP结合物，BH2 ELISA试剂箱在固相载体上预先包被了大鼠BH2。分光光度数据用微孔板阅读器在450 nm波长下测量。根据该标准曲线对每个样品中的BH4和BH2浓度进行插值，并表示为PVN蛋白的pg/μg。
2.8. 肾交感神经活动（RSNA）记录
对于用于血液动力学和RSNA测量的普通外科手术，用氨基甲酸乙酯（0.75 g/kg IP）和α-氯醛糖（70 mg/kg I）麻醉大鼠，并将其放置在立体定向仪中（美国加利福尼亚州图荣加市David Kopf Instruments）。通过加热阶段，体温保持在36–38°C。气管用聚乙烯管（PE-240）插管，左股静脉用PE-50插管以注射补充麻醉。如前所述，在四组大鼠中监测RSNA[28,43–45]. 简单地说，在麻醉下，通过腹膜后侧翼切口暴露左肾。分离肾神经，将其置于双极铂电极上，并用WACKER SilGel混合物（604和601）固定。来自电极的电信号用高低频截止频率分别为1000 Hz和100 Hz的格拉斯放大器放大。用PowerLab记录信号。实验结束时（切断近端后）记录的RSNA被定义为背景噪声。通过从实际记录值中减去背景噪声来计算基础RSNA的值。用PE-50插管的左股动脉通过压力传感器（Gould P23 ID）连接到基于计算机的数据记录和分析程序（PowerLab），以通过先前建立的方法记录平均动脉血压（MAP）和心率（HR）[28,44].
2.9. 7-硝基咪唑（7-NI）微量注射
将麻醉大鼠放置在立体定向装置中（David Kopf Instruments，Tujunga，CA，USA）。在PVN内进行微注射时，在头部做一个纵向切口后暴露前角，并在颅骨上钻一个小钻孔，以便进入PVN放置微注射套管。根据Paxinos和Watson图谱确定的PVN坐标为前角后方1.5 mm，中线外侧0.4 mm，硬脑膜腹侧7.8 mm。将连接至0.5 mL微量注射器（美国内华达州里诺市汉密尔顿）的细针（外径0.2 mm）放入PVN中。使用含有7-NI的同一吸管，将7-NI随机分为三个剂量（50pmol/50 nl、100pmol/100 nl和200pmol/200 nl）注入PVN。在前一剂量后至少20分钟进行后续注射，以使MAP、HR和RSNA恢复到基础水平。实验期间，RSNA对PVN给药的峰值反应（平均20–30秒）随后表示为与基线相比的百分比变化。
2.10. 心脏功能评估
在麻醉大鼠牺牲前或终止实验时，在RSNA记录和向PVN微量注射7-NI后，评估LVEDP和左心室压力变化率（dP/dt）。用氨基甲酸乙酯（0.75 g/kg ip）和α-氯醛糖（70 mg/kg ip）麻醉大鼠，并通过右颈动脉将含有压力传感器的Mikro-Tip导管（Millar Instruments，德克萨斯州休斯顿）引入左心室，以测量LVEDP和dP/dt。PowerLab数据采集系统用于采集数据。
2.11. 统计分析
数据以平均值±SEM表示。RSNA、MAP和HR的分析通过双向重复测量ANOVA进行多重比较。所有其他结果通过单向方差分析进行分析，然后使用Prism 7进行Bonferroni分析；GraphPad软件。在p值<0.05时，所有差异均被视为显著。
3.结果
3.1. CHF模型的特点
总结了本研究中使用的四组大鼠Sham-Sed、CHF-Sed、Sham-ExT和CHF-ExT的基线特征。CHF组（冠状动脉结扎后6-8周）的梗死面积约为左心室心内膜表面的34%。Sham大鼠心肌无明显损伤。与Sham组相比，CHF组LVEDP显著增加。与Sham组相比，CHF组的dP/dt最大值和最小值显著降低，表明心脏收缩和舒张功能降低。总的来说，>30%的梗死面积、LVEDP升高和dP/dt降低表明CHF组大鼠出现了心脏功能障碍。与假手术组相比，CHF-Sed和CHF-ExT大鼠的LVEDP均显著升高，ExT使LVEDP部分正常化。虽然ExT仅使LVEDP部分正常化，但CHF-ExT组的值仍显著高于假手术组。此外，CHF-Sed大鼠的压力随时间变化显著降低；dP/dt与假手术组大鼠相比，ExT使其部分改善。正如我们之前的研究所记录的那样，尽管ExT使假手术组和CHF组的HR降低，但在四组之间，我们没有观察到基础MAP和HR的统计显著性差异。CHF大鼠的基础RSNA显著升高，ExT降低了静息基础RSNA水平(和). 这些数据证实CHF组大鼠出现了心脏功能障碍，ExT本身使心脏功能障碍恢复正常。此外，考虑到ExT相关肌肉活动增加，我们使用比目鱼肌中柠檬酸合酶的活性作为评估氧化和呼吸能力的代谢标记物。在当前的研究中，与久坐动物（11.5±1.5μmol/g/min Sham-Sed和12.8±0.7μmol/g/min CHF-Sed）相比，ExT动物的柠檬酸合成酶活性增加（Sham-ExT为18.2±2.9μmol/g/min，CHF-ExT为16.3±1.8μmol/g/min），表明ExT的显著作用。Sham-ExT和CH-ExT大鼠比目鱼肌中柠檬酸合成酶活性水平没有显著差异，表明两组动物的ExT水平（中等水平）相当().
四组大鼠的基线肾交感神经活动（RSNA）、平均动脉压（MAP）和心率。（A） 每个实验组（B）单个大鼠的原始记录片段平均为基础RSNA*与Sham相比，P<0.05，#与CHF相比P<0.05。
表1
四组大鼠的形态学和血液动力学特征：Sham-SED、Sham-ExT、CHF SED和CHF-ExT。
| Sham-Sed（n=5） | CHF-Sed（n=5） | 假ExT（n=5） | CHF-ExT（n=5 |
|---|
| 体重（g） | 404.6 ± 14.2 | 401.4 ± 15.8 | 372.4 ± 11.2 | 359.0 ± 6.9 |
| 梗死面积（左心室百分比） | 0 | 38.2 ± 2.0* | 0 | 31.5 ± 1.8# |
| 左心室舒张末期压力（mmHg） | 4.5 ± 0.4 | 29.6 ± 2.5* | 4.0 ± 0.8 | 18.1 ± 3.5# |
| dP/dt最大值（毫米汞柱/秒） | 9265.2 ± 752.8 | 4859.4 ± 401.2* | 8888.4 ± 383.4 | 6888.4 ± 572.8# |
| dP/dt最小值（mmHg/秒） | −10455.8 ± 560.8 | −4117.2 ± 586.0* | −11603.4 ± 477.4 | −7798.2 ± 1254.8# |
| MAP（毫米汞柱） | 119.0 ± 3.9 | 113.8 ± 3.5 | 123.73 ± 4.8 | 116.5 ± 4.3 |
| 人力资源（bpm） | 371.2 ± 12.7 | 379.7 ± 5.7 | 365.2 ± 7.3 | 348.8 ± 18.0 |
| 柠檬酸合成酶的致病性（μmol/g/min） | 11.5 ± 1.5 | 12.8 ± 0.7 | 18.2 ± 2.9* | 16.3 ± 1.8# |
3.2. CHF患者PVN的中枢抑制NO•机制
催化活性nNOS二聚体[21]因此，NO•介导的交感神经抑制在CHF大鼠的PVN中减少[20,45].表示通过向PVN中单侧微量注射7-NI（50、100和200 pmol）获得的RSNA、MAP和HR变化的组数据。7-NI使假手术组和CHF组的RSNA、MAP和HR显著增加，且呈剂量依赖性。然而，与Sham相比，CHF组的RSNA对7-NI反应的增加在所有三个剂量下都显著减弱(). 200 pmol时，CHF组RSNA的变化（9.51±0.78）显著低于Sham组（17.49±2.53）（p<0.05）。值得注意的是，尽管CHF大鼠的基础RSNA趋于增加，但CHF大白鼠的RSNA至7-NI的绝对增加显著减少，这表明心力衰竭期间PVN中的催化活性功能二聚体减少。MAP中观察到类似的趋势()和人力资源()7-NI的抑制作用与CHF组内源性NO•生成减少一致，因为nNOS不能合成NO•作为单体。此外，我们测定了磷酸化nNOS-Ser的表达847（nNOS-pS847，抑制nNOS活性）和磷酸化nNOS-Ser1417（nNOS-pS1417激活nNOS活性）。nNOSpS的绝对量847（0.47±0.09 CHF vs.0.28±0.04 Sham）以及nNOS的比值847/CHF大鼠PVN中总nNOS（1.02±0.15 CHF vs.0.24±0.03 Sham）显著增加(和)这表明nNOS失活池增加，NO•可用性可能降低。与此相反，我们没有发现nNOS-pS的磷酸化状态有任何变化1417CHF组与Sham的绝对量（0.45±0.05 CHF vs.0.58±0.09 Sham）和nNOSpS比率1417/总nNOS（0.72±0.10 CHF vs.0.54±0.11 Sham）(和).
Sham和CHF大鼠PVN中对7-NI微注射的RSNA、MAP和HR反应。（A） 在PVN中微量注射不同剂量的7-NI后，RSNA、（B）MAP和（C）HR的平均变化*与相同剂量7-NI的假手术组相比，P<0.05。六个独立实验的数值为平均值±SE。血清nNOS磷酸化的Western blot分析847和Ser1417在Sham和CHF大鼠的PVN中。nNOSpS的（D，F）代表性Western blot（E，G）密度分析847和nNOSpS1412归一化为PVN中的Actin和总nNOS。数值为SEM平均值（每组5-6只大鼠）*与Sham相比P<0.05。
3.3. CHF ExT后PVN内PIN表达降低
和显示CHF大鼠PVN中PIN的表达增加（0.68±0.10 CHF vs.0.38±0.07 Sham），ExT显著改善这种增加的表达（0.48±0.05 CHF-ExT vs.0.68±0.1 CHF）。为了支持生化数据，对PVN切片进行PIN免疫染色现场，在四组大鼠中(). 与Sham相比，CHF大鼠腹内侧副细胞亚核和PVN大细胞部分的PIN免疫染色增加，而ExT降低CHF-ExT组PIN的表达，如累积数据所示().
ExT恢复CHF PVN中的PIN表达。四组大鼠PVN中PIN的Western blot分析：Sham-SED、Sham-ExT、CHF-SED和CHF-ExT。数值为平均值±SEM（每组5只大鼠）*P<0.05 vs.Sham，#与CHF相比P<0.05。（C） PIN PVN染色的代表性免疫荧光显微照片。绿色：PIN，比例尺：100μm。（D） PVN中PIN免疫荧光染色的定量。数值为平均值±SEM（每组3只大鼠）*P<0.05 vs.Sham，#与CHF相比P<0.05。
3.4. ExT通过恢复CHF PVN内GCH1的表达增加BH4水平
在本实验中，我们检测了PVN裂解物中BH4的水平，BH4是nNOS活性和NO•合成的主要辅因子，GCH1是BH4生物合成途径中的速率限制酶。与Sham（Fi 4A和B）相比，CHF大鼠PVN中的BH4水平显著降低（约1.41倍），而氧化型BH2相应增加（约3.5倍）。此外，GCH1在CHF大鼠PVN中的表达也降低（0.49±0.03 CHF vs.0.74±0.06 Sham）(和)表明GCH1表达减少限制了BH4的可用性，从而促进了PVN中nNOS的解耦联。有趣的是，ExT增加PVN中BH4的含量（437.2±24.94 CHF-Sed vs.577.2±38.21 CHF-ExT，pg/ug蛋白）以及GCH1的表达（0.49±0.01 CHF-Sedvs.0.70±0.05 CHF-ExT），并降低PVN中的BH2的含量（3.24±0.43 CHF-Sed-vs.1.40±0.32 CHF-ExT-，pg/g蛋白）().
ExT恢复CHF PVN中BH4、BH2水平和GCH1表达。（A） 用ELISA测定PVN裂解物中BH4（B）BH2的水平，并以μg蛋白质表示*与Sham相比，P<0.05，#P<0.05 vs.CHF值为平均值±SEM（每组n=5-7只大鼠，*P<0.05）四组大鼠PVN中GCH1的蛋白质印迹分析（C）标准化为肌动蛋白的GCH1的代表性蛋白质印迹（D）密度分析。数值为平均值±SEM（每组4只大鼠）*P<0.05 vs.Sham，#与CHF相比P<0.05。
3.5. CHF ExT后PVN内nNOS水平的二聚体形式增加
接下来，我们使用LT-PAGE检测PVN裂解物中nNOS单体和二聚体的水平，以便可以测量nNOS的抗SDS二聚体(和). 在正常变性条件下，nNOS在SDS-PAGE上以155 kDa（非活性形式）的单一条带迁移，而使用LT-PAGE的非煮沸组织匀浆分离为310-kDa二聚体（活性形式）和155-kDa-单体（非活性）。二聚体和单体带的比率决定了nNOS的相对活性水平[24]. 与我们之前的调查结果一致[21]我们观察到，与Sham大鼠（1.12±0.04）相比，CHF大鼠PVN中nNOS的二聚体/单体比率降低（0.67±0.13），并且在ExT后，CHF组的二聚物/单体比例恢复到与Sham鼠相当的水平（0.89±0.04 CHF-ExT vs.1.01±0.06 Sham-ExT）。
ExT恢复CHF PVN中nNOS的催化活性形式。（A） 四组大鼠PVN中nNOS单体和二聚体的估算：Sham-SED、Sham-ExT、CHF-SED和CHF-ExT。LT-PAGE在冷藏室中分离出二聚体和单体nNOS，并使用抗nNOS抗体进行免疫印迹观察。（A） 单体和二聚体蛋白水平的代表性LT-PAGE印迹（B）密度测定分析表示为二聚体与单体的比率。数值为平均值±SEM（每组4-6只大鼠）*与Sham相比，P<0.05，#与CHF相比P<0.05。
4.讨论
本研究的新发现是，ExT通过调节参与nNOS翻译后调节的细胞内因子水平，增加CHF大鼠PVN中的二聚nNOS。由于ExT是在冠状动脉结扎三周后开始的，因此ExT可能通过改变这些细胞内因子的可用性来预防或减少CHF中二聚nNOS的变化，而不是逆转这种变化。PIN是nNOS的内源性抑制剂，与神经元中的nNOS共定位，并且与nNOS在物理上相互作用，正如我们的共同免疫沉淀研究所证明的那样[21]. PIN结合的功能尚不完全清楚，但最初有报道称其会破坏nNOS二聚体的稳定性[23]导致催化损伤单体。在我们之前的研究中，我们报告了nNOS的绝对水平[20,28]CHF患者的nNOS表达以及催化活性二聚体表达减少[21]. NO的生物合成取决于NOS辅因子的可用性：即还原黄素、血红素铁、BH4以及作为电子源的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。同二聚体和辅因子结合对NOS的酶活性至关重要[46]因为电子从一个单体的加氧酶域转移到另一个单体内的还原酶域，需要形成同二聚体，这是酶催化活性的先决条件[47]. 伯克希尔哈撒韦4在nNOS二聚体形成后需要稳定它[48,49]. nNOS在没有适当BH的情况下激活4结合使标准电子转移解偶联，产生超氧物。因此，BH4耗尽和添加有利于nNOS二聚体/单体比率变化的二聚抑制剂（如PIN）等条件将影响nNOS的蛋白水解降解。CHF中的nNOS规定不仅限于BH4可用性或PIN过度表达。PVN中nNOS的翻译后调控和激活涉及许多翻译后分子机制，如磷酸化、泛素化、琥珀酰化等。以前我们已经证明，在CHF大鼠PVN中nNOS的泛素化增加，其机制依赖于角度，导致蛋白酶体降解，从而限制NO的生物利用度[21]. 在本研究中，磷酸化nNOS-Ser的相对增加847提出了降低nNOS活性的另一种可能机制，从而限制了CHF期间PVN中NO•的生成。
我们在研究中使用了CHF的冠状动脉结扎模型，该模型模拟了可靠且一致的CHF状况模拟[25–27,45]与心室起搏等其他模式的CHF相比具有优势。冠状动脉结扎模拟了CHF患者常见的动脉阻塞。使用该模型和三周的ExT方案，我们之前已经证明ExT可以恢复CHF中钝化的NO•机制，正如nNOS的恢复表达所证明的那样[45]. 然而；ExT有益作用的分子机制尚不完全清楚。在本研究中，我们观察到ExT后CHF大鼠PVN中PIN蛋白表达减少，nNOS二聚体/单体比率随之增加。这些发现以及目前对PIN功能的理解表明，NO•生物利用度的降低是由于PIN表达增加，通过破坏二聚体的稳定性使nNOS失活，而ExT通过改善增强的PIN水平而发挥有益作用。神经元细胞中PIN的沉默导致nNOS的积累以及二聚体/单体比率随NO•生成增加而增加[21]，表明PIN影响nNOS的表达和催化活性，因此，在nNOS调控中发挥着重要作用，为CHF和其他心血管疾病的治疗提供了新的靶点。
之前我们描述了催化活性的二聚体nNOS[21]以及nNOS的绝对水平[20,28]，CHF减少。在目前的研究中，我们证明7-NI介导的RSNA变化在CHF中减弱，表明nNOS二聚化有助于交感神经兴奋增加。与eNOS相比，7-NI优先（尽管不是唯一）抑制nNOS[50–52]并已被广泛用作nNOS的选择性抑制剂。在PVN中，eNOS相对于nNOS的相对水平非常低，因此我们认为CHF中观察到的功能变化可能是由于nNOS引起的。7-NI与底物结合位点结合，与精氨酸和BH4竞争，精氨酸是nNOS二聚体形成的必要辅因子，可能干扰酶的二聚化[53].
在本研究中，我们进一步发现GCH1的表达减少导致BH4的PVN水平降低，CHF中BH2水平增加，这为nNOS解偶联提供了另一个可能的原因。因此，通过参与催化活性nNOS二聚化的细胞内因子的失调重新调节nNOS的单体化导致泛素介导的蛋白水解降解，从而降低CHF中nNOS水平。有趣的是，ExT诱导的GCH1上调与BH4水平的增加和BH2水平的降低有关，nNOS二聚化表明GCH1和BH4的生物利用度在调节nNOS活性和偶联方面起着关键作用。ExT后GCH1表达的增加以及nNOS二聚体的稳定可能是通过减少血管紧张素机制实现的，因为ExT已被证明可以降低CHF中Ang II的水平[26]. 有趣的是，Couto GK等人证明，运动训练导致GCH1蛋白表达增加，这与CHF大鼠冠状动脉eNOS表达和偶联增加有关[54].
血管紧张素能增强[55]和谷氨酸能[56]PVN内的机制与CHF有关，我们已经描述过ExT使这些改变正常化[26,31]. 之前我们已经证明，尽管ExT没有显著改善心功能，但整体交感驱动力减弱，CHF-ExT组尿去甲肾上腺素排泄减少就表明了这一点。在这方面，值得注意的是，血浆去甲肾上腺素水平较低的CHF患者预后较好。本研究在PVN水平上揭示了ExT在CHF期间的积极作用的分子机制。迄今为止，CHF期间ExT使交感神经流出正常化的机制尚未阐明。在这里，我们发现ExT增加了二聚体nNOS的水平，可能是通过Ang II依赖性机制，因为NG108细胞中的Ang II处理增强了PIN的表达，同时nNOS的表达减少，并且Ang II处理后PIN与nNOS的结合增加，表明Ang II介导的这两种蛋白之间存在显著的功能性相互作用[21]. Ang II介导的机制也调节GCH1表达的可能性尚待探索。
我们以前的研究表明，在血管紧张素Ⅱ的影响下，PVN中的nNOS在翻译后受到nNOS-PIN相互作用的调节[21]总结如下我们认为PIN的表达上调，可能是由于CHF患者PVN中Ang II水平增加所致。PIN与nNOS的结合导致nNOS二聚体失稳，这是酶催化活性所需的构象。非活性单体状态是使nNOS易受泛素化和随后蛋白酶体降解影响的触发因素[57]. nNOS活性水平的降低导致NO•的生成减少，从而降低对PVN神经元的抑制作用，从而增强CHF中观察到的交感神经兴奋。此外，在BH4浓度未达到饱和的情况下，nNOS二聚作用解偶联标准电子转移以产生超氧物。超氧化物对NO•的破坏形成过氧亚硝酸盐，进一步限制了NO•的生物利用度。综上所述，这些观察结果对PVN内导致CHF期间交感驱动过度激活的可能机制提供了重要的见解，并提供运动训练作为非药物治疗，以治疗CHF和其他心血管疾病中增强的交感兴奋。
ExT后PVN中NO生物利用度增加的拟议分子机制。在CHF中，PIN因Ang II水平和AT增加而过度表达1PVN中的受体。CHF中PIN与nNOS的结合会破坏nNOS二聚体的稳定性，这会通过干扰组装或有利于单体化的二聚体稳定性使nNOS催化失活。进一步降低GCH1表达降低BH4水平。这导致CHF大鼠PVN中nNOS催化活性水平降低。nNOS水平降低会降低CHF期间PVN中NO•的生成，从而导致交感神经活动增加。ExT可改善CHF大鼠PVN中PIN水平升高、GCH1和BH4水平降低以及血管紧张素原机制降低，从而恢复活性nNOS二聚体。
致谢
这项工作得到了美国心脏协会国家中心拨款14SDG19980007（给N.Sharma）和国家健康、心脏、肺和血液研究所拨款HL62222（给K.P.Patel）的支持。
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