伤口修复再生。作者手稿；PMC 2019年11月8日提供。
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预防性维修识别码：PMC6398939型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院1008873
颅骨干细胞参与愈合：大型颅骨缺损的区域分析
，文学硕士。，1 ，博士，1 ，1 ，1 ，1 ，1 、DDS、，2 ，博士，三，4 ，博士，5和，博士1,三，5,6
艾米丽·达勒姆
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
丽贝卡·霍伊
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
里德·霍克
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
布雷登橡树
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
扎卡里灰
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
萨拉·罗斯大厅
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
马丁·斯特德
2南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔颌面外科
阿曼达·拉鲁
三南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC病理和实验医学部
4Ralph H.Johnson VA医疗中心，南卡罗来纳州查尔斯顿
罗宾·穆伊斯·赫默里克
5MUSC再生医学和细胞生物学系，南卡罗来纳州查尔斯顿
詹姆斯·克雷
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
三南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC病理和实验医学部
5MUSC再生医学和细胞生物学系，南卡罗来纳州查尔斯顿
6俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学医学院解剖科
1南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔健康科学系
2南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC口腔颌面外科
三南卡罗来纳州查尔斯顿市MUSC病理和实验医学部
4Ralph H.Johnson VA医疗中心，南卡罗来纳州查尔斯顿
5MUSC再生医学和细胞生物学系，南卡罗来纳州查尔斯顿
6俄亥俄州哥伦布俄亥俄州立大学医学院解剖科
通讯作者：James Cray Jr.，博士，副教授，俄亥俄州立大学医学院解剖科，1645 Neil Ave.，279 Hamilton Hall，Columbus，OH 43210，614-292-4831，ude.uso@03.yarc公司 摘要
大型颅面缺损是一项重大的临床挑战，通常需要使用骨传导基质和骨诱导线索（即骨形态发生蛋白（BMP2））来促进愈合。虽然这些方法改善了临床结果，但更好地了解缺损周围的成骨前缘、潜在的硬脑膜和颅骨缝合区如何促进愈合，可能会导致更具针对性的治疗，以增强骨再生。我们假设，大骨缺损内的愈合将从毗邻小鼠临界大小缺损边缘的剩余或可用缝合间质内的细胞中沉淀出来。为了研究这一假设，39只成年野生型小鼠被随机分为组（每组9或10只），按时间（4周和8周）和治疗（对照组、单用脱细胞胶原海绵（ACS）或ACS加载临床相关剂量的BMP2）。然后对颅骨进行µCT和组织学分析，以评估缺损区域内相关区域的骨再生。一项区域性愈合评估表明，BMP2比对照组更能促进愈合，愈合来自手术边缘，尤其是与未破裂的缝合间质相关的边缘。尽管BMP2治疗使愈合缺损内的细胞增多，但颅面干细胞或血管没有区域性定向。总的来说，这些数据证实，骨传导基质与骨诱导肽结合能够更好地愈合颅骨大缺损。这种愈合的特点是来自手术边缘，那里有丰富的血管和祖细胞供应。
关键词：干细胞，骨创伤，颅骨缺损
简介：
骨骼是一种动态的、高度血管化的组织，在整个生命周期中不断重塑，具有损伤后愈合的先天能力。然而，创伤或医源性（如肿瘤切除）来源引起的骨损伤和缺损是颅颌面外科的一个主要问题，因为再生过程经常失败，需要手术干预以增强自然骨创伤修复(1). 对于临床医生来说，了解哪些解剖组织在愈合中起关键作用有助于制定治疗计划。虽然自体骨移植由于其一致的临床结果仍然是标准的治疗方法(2)，其使用受到供应短缺和与收获相关的大量供体部位发病率的严重阻碍(三，4). 骨组织工程领域提供了替代治疗方案；(5)然而，关于缺陷无法自然愈合的机制以及工程支架如何增强愈合过程的知识仍然存在差距。
颅骨缺损周围的复合组织环境有助于形成级联效应，以实现骨骼固有的再生能力。围绕缺损的成骨前缘可能通过捐献祖细胞和内源性血液供应来帮助愈合(6–8). 在缺损区附近保留颅面部缝合线也有助于更好的愈合。这可能是由于缝合线中含有某些间充质细胞类型，如Gli1+被假设有助于颅骨愈合的细胞(9，10). 此外，覆盖在颅骨上的骨膜和颅骨下的硬脑膜含有参与骨再生的关键细胞群和生长因子(11，12).
研究表明，骨传导基质的使用可以通过在骨边缘之间创建一个人工间隙来增加骨缺损的愈合，骨边缘可以缓慢翻转以模拟间接愈合(13–15). 目前在整形外科和颅面外科领域广泛使用的一种增强骨愈合的选择是使用无细胞胶原海绵（ACS）(16)结合FDA批准的骨形态发生蛋白2（BMP2）（INFUSE®骨移植（明尼苏达州门尼阿波利斯市美敦力）。BMP2是一种与内源性成骨信号具有协同作用的成骨肽(17–19). 在这项研究中，我们旨在通过对用骨传导支架（ASC）和临床相关剂量的BMP2治疗的小鼠临界大小缺损进行区域分析，确定在愈合过程中起作用的因素(20，21). 由于颅骨缝合线衍生的干细胞被假设有助于骨伤口愈合，我们假设愈合将更接近于缺损边缘未受干扰的缝合线间质，并且干细胞将在愈合过程中发挥重要作用。
材料和方法：
动物
成年（8周龄）C57BL6野生型雄性和雌性小鼠随机分为2个治疗组，每组5只：A）对照组，植入含有PBS的ACS基质，B）BMP2，植入含有325 ng BMP2的ACS基体浸泡液。这种亚临床剂量的骨形态发生蛋白2被使用，因为它以前已经被确定在这个模型中促进高质量的骨再生(22，23). 根据既定方案制作了5mm临界大小的颅骨缺损(22–24). 简单地说，使用异氟醚（美国宾夕法尼亚州伯利恒）对小鼠进行麻醉，剃去头皮，用低速手钻钻取中线5 mm颅骨切除缺损。注意保持硬脑膜完整，但缺损部位的骨膜必须切除。然后按照上述详细说明对手术部位进行处理，并用6×0聚丙烯缝合线闭合切口。术后48小时内，对小鼠进行炎症和痛苦症状监测，包括过度修饰、改变饮水量和伤口裂开。一半的小鼠（n=10个对照组，n=9个BMP）在术后4周被安乐死，其余的小鼠（n=10个控制组，n=10 BMP）则在术后8周用CO安乐死2随后是颈椎脱位。牺牲后，收集颅骨，从枕骨隆起处到鼻梁处一分为二，并对手术部位进行显微计算机断层扫描（µCT）分析。
动物使用协议由南卡罗来纳医科大学动物护理和使用委员会批准（AR#3452）。所有程序均在国际实验动物护理评估和认证协会认可的设施中进行，该设施由实验动物资源部提供畜牧业和相关服务。程序和报告符合动物研究：活体实验报告（ARRIVE）指南(25).
显微计算机断层扫描分析
缺陷的µCT图像通过体外Skyscan 1176（Skyscan，Aartlesaar，Belgium）使用0.5 mm厚的铝过滤器，电压50 kV，电流500µa。数据采集分辨率为18µm各向同性体素，旋转步长为0.5°，旋转180°。代表性图像是使用CTvol软件v 2.3.2.0 r810（Skyscan）创建的。测定所有样品的标准形态计量参数(26). 使用5 mm缺损部位内四个不同区域的标准感兴趣体积的骨体积/组织体积：边缘；与颅骨缝合无关的手术边缘，后部；与前矢状缝和人字缝基台相关的手术边缘；分析了与矢状缝和冠状缝基台相关的手术边缘，以及中心：矢状缝切除处手术缺损的中线().
愈合和细胞存在及类型评估区域的方法示意图。A.具有代表性的µCT重建，在前面邻接冠状缝、后面邻接人字缝、5mm颅骨缺损边缘和中心（大圆圈）确定感兴趣区域（小圆圈）。B.缺陷的代表性组织学切片，感兴趣的区域（方框）显示在切除的矢状缝合线上方的缺陷中心，中间非缝合线或边缘相关区域，以及包含约50%天然骨的缺陷边缘。
组织染色和细胞计数
在进行µCT扫描后，在每个时间点，来自对照组和BMP2治疗组的代表性样本（n=4/次/组）在冠状面上通过手术缺损中心进行二等分，并准备进行石蜡切片。简言之，将样品置于3.7%甲醛中两天，然后在pH 7.4的0.25M EDTA中脱钙21天。然后清洗样品，在分级乙醇（70-100%）中脱水，在二甲苯中清除，并嵌入石蜡中。在每次分析中，每个样品的冠状面上至少间隔40µm，对3、7µm的切片进行组织学和免疫组化。Harris苏木精（VWR，Radnor，PA，10143–606）和曙红（VWR，95057–848）（H&E）染色按照标准方案进行。H&E染色缺陷的图像是使用带有摄像头的Motic倒置显微镜（加拿大不列颠哥伦比亚省Motic）获得的，并使用NIH ImageJ软件进行分析以计数细胞核。为每张图像创建一个掩模，以计数确定的感兴趣区域中的紫色染色细胞核：位于切除的矢状缝合线上的缺陷中心；中间非缝合或边缘相关区域；含约50%天然骨的缺损边缘().
对于免疫组织化学，玻片在二甲苯中脱蜡，并在分级乙醇（100–0%）中重新水化。用3%过氧化氢阻断内源过氧化物酶活性，然后清洗。切片用1%的山羊血清和1%的牛血清白蛋白封闭。在4°C下用一级抗体（Gli1，NBP1–78259，1:500，Novus Biologicals Littleton，CO；CD44，Ab157107，1:1000，AbCam；PECAM，Ab28364，1:50，AbCam）孵育切片过夜，然后在室温下用HRP结合二级抗体（ab6721，AbCam）洗涤和孵育1小时。二氨基联苯胺（DAB；Vector Laboratories，Bulingame，CA）色谱用于识别免疫反应性结构。使用Image J Software和IHC Profiler开源插件对切片进行分析，以自动评分感兴趣区域内的阳性百分比() (27).
统计
在适当的情况下进行标准双向方差分析和事后Bonferroni分析。必要时进行数据转换，以纠正方差或正态性同质性的违反。如果p≤0.05，则认为差异显著。数据以平均值±SE表示。
结果：
在标准体积内以骨体积/组织体积（BV/TV）形式进行的区域性愈合评估表明，BMP2在4周和8周时促进了更大的愈合（p<0.001，). 通过µCT对缺陷内愈合情况的分析表明，随着时间的推移，愈合情况会更好。此外，在4周和8周时，缺损中心（覆盖已切除的矢状缝）的愈合速度分别低于与冠状缝和人字缝间质残余物相关的缺损前部和后部（p<0.01）。4周时，与缺损前部冠状缝相关的区域相比，与现有缝合线无关的边缘愈合较少（p<0.05）。到8周时，边缘比缺损中心愈合更快（p<0.001）。
骨愈合的区域评估。答：。4周和8周5 mm临界大小颅骨缺损愈合的典型µCT重建，记录原始缺损边缘（圆形）。注意BMP2的整体愈合效果更好（右）。B–C类。术后4（b）周和8（c）周的区域愈合评估证实，在这两个时间点，BMP2治疗的所有区域缺陷的骨体积（骨体积/组织体积；BV/TV）都更大。按区域评估愈合情况表明，沿缺损边缘的愈合情况更好，尤其是与缝合间质相关的区域（前部和后部）*p≤0.05，**p≤0.01***p≤0.001 n=9（4周）或10（8周）
组织学上，在4周时，两组均出现无组织再生，遍及缺损部位。在术后4周评估组织学细胞计数时，BMP处理的缺损包含的细胞多于对照缺损（p<0.01）。到了8周，这种关系被逆转了(). 细胞密度的区域评估没有显示出任何区域差异。
愈合缺陷中细胞存在的区域评估。答：。中心（左）和边缘（右）具有代表性的H&E染色愈合缺陷的高倍图像表明，随着时间的推移，缺损区域发生重塑。箭头表示高细胞区域，低倍率图像上的方框区域表示用于高倍率的区域。B–C类。术后4（b）周和8（c）周对愈合缺损内细胞浸润的区域评估表明，BMP2在整个缺损内促使更多的初始细胞浸润，然后在8周内解决**p≤0.01 n=每组4人/次x每个人至少间隔40µm的3个切片。
由于缺损每个区域中存在的细胞数量没有差异，我们调查了每个区域的干细胞，以阐明每个区域中的细胞类型是否驱动观察到的愈合模式。对缝合线衍生干细胞标记物Gli1的研究表明，在任何一个时间点，与手术缘、切除的矢状缝合线或与缝合线或手术缘无关的中间区域相关的区域内，干细胞的比例在统计学上均无显著差异。此外，对CD44阳性细胞的评估也显示，不同地区、时间或治疗之间没有统计学上的显著差异().
愈合缺陷中细胞类型的区域评估。答：。利用中央（左）和边缘（右）区域的高倍图像对愈合缺陷中的Gli1（左）与CD44（右）进行代表性免疫组织学染色，表明随着时间的推移，缺损区域发生重塑。箭头表示阳性（棕色）染色，低倍图像上的方框区域表示用于高倍的区域。B–C类。术后4（b）周和8（c）周对愈合缺陷内Gli1阳性（干细胞）的区域评估表明，干细胞的分布在统计学上没有显著差异，与愈合中的显著区域差异相关。D–E。术后4（d）周和8（e）周对额外干细胞标记物（CD44）的评估再次表明，没有区域性干细胞浓度。n=每组每次4个个体x每个个体间隔至少30µm的3个切片。
由于在该愈合模型中未观察到不同部位的干细胞活性差异，我们评估了在手术边缘观察到的愈合增加是否与血管增加相关。PECAM是一种与血管和血管生成相关的标记物，其染色表明，经BMP2治疗后，PECAM染色增加（p<0.001），且随着时间的延长（p<00.001）。然而，我们对这种染色的区域评估并没有显示出不同位置的统计显著差异().
愈合缺陷血管的区域评估。答：。利用中央（左）和边缘（右）区域的高倍图像对愈合缺陷中的PECAM进行代表性免疫组织学染色，表明随着时间的推移，缺损区域发生了重塑。箭头表示阳性（棕色）染色，低倍图像上的方框区域表示用于高倍的区域。B–C类。术后第4（b）周和第8（c）周对愈合缺损内PECAM阳性染色的区域评估表明，血管分布无统计学意义上的差异，与愈合的显著区域差异相关。n=每组每次4个个体x每个个体间隔至少30µm的3个切片。
讨论：
结果证实了这样的假设，即沿着与未受干扰的缝合间质相关的成骨前缘，缺损处的愈合比缺损中心处的愈合更大。然而，我们的推测是，这种愈合的增加是由于缝合线间质中干细胞的增加而引起的，这一推测并不成立。这一结果支持了以下假设：血管系统和/或其他必要的信号级联（例如基质蛋白）的可用性可能是颅骨缺损愈合的原因(6). 对缺损内PECAM染色的评估也支持了这一假设，即与固有二倍体相关的缺损边缘和与未受干扰的下矢状窦相关的中心PECAM增加。当考虑到缺损边缘时，我们发现BMP2治疗可以极大地促进愈合，特别是在这个区域，这强化了BMP2干预是沿着成骨前沿有力促进愈合的主要因素这一原则(28).
对缺损部位内孤立区域的调查显示，缺损中央部分的愈合可能只受下面硬脑膜的影响，并且在边缘随着时间的推移重新接近以实现更直接的愈合之前，缺乏成骨前缘的作用(8). 有趣的是，我们的数据表明，在切除的矢状缝上方的缺损中心，干细胞（Gli1）的存在可能增加。该标记物在整个缺损区域的存在可能是Gli1细胞在一般愈合中作用的证据(9，29). 此外，尽管我们的评估没有显示愈合缺陷中干细胞位置的统计学显著差异，但我们观察到的特定分布可能与愈合过程具有生物学相关性(30，31). 我们的研究结果表明，BMP2可以促进缺损中心的愈合，增强“异位骨”，而异位骨可以在以后被合并和重塑。然而，如果没有这种强大的肽的增强，几乎不会发生愈合，这表明矢状缝合线的先前存在（潜在的信号印在下面的硬脑膜内）对该模型的愈合作用很小(11，12).
在本实验中，使用骨诱导肽（BMP2）和骨传导基质（ACS）促进了最大量的骨生长，加强了先前的研究(22–24，28，32). 此外，这种治疗方式在4周时表现出最大的细胞浸润量。通过研究细胞计数以及相应的µCT分析，似乎术后4周细胞浸润量越大，愈合越快，这并非出乎意料。8周的组织切片，尤其是BMP组的组织切片比4周的切片更薄，更有组织性，这表明骨传导支架退化和原始骨重塑。这些数据表明，在骨愈合过程中，尽可能多地向缺损部位募集再生细胞的能力至关重要。此外，可能是在受损的愈合过程中，可用于愈合的细胞存在缺陷。有趣的是，我们发现BMP治疗组在4周时招募到缺陷部位的CD44干细胞相对较少。这可能表明骨愈合过程的逐步时间发生了变化，表明干细胞可能在愈合过程的早期起作用，从而在4周时观察到大量分化细胞(33–35). 我们关于干细胞参与这一愈合过程的假设目前还没有得到验证。
总的来说，将骨传导基质与骨诱导肽结合使用可以更好地愈合颅骨的大骨缺损。这种愈合似乎来自手术边缘，那里有丰富的血管系统以及造血和间充质祖细胞。
致谢
资金来源：
这项工作得到了AO基金会[S-16–108C（JC）]的支持；NIH/NIDCR[5T32DE017551]；[F31DE026684至ELD]；美国国立卫生研究院/美国国立医学院【P30GM103331】；本研究的研究支持由Medtronic Sofamor Danek USA F31DE026684提供给ELD。本研究利用了MUSC口腔健康研究中心（COHR）的设施和资源。
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