生物学报。作者手稿；2019年7月15日PMC发布。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院1001838
透明质酸组成的近红外荧光团优化了前列腺肿瘤异种移植物的手术成像
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约书亚·J·苏切克
一美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药物科学系68198
尼古拉斯·沃伊丁内克
b条美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所，邮编68198
威廉·佩恩
一美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
梅根·B·霍姆斯
一美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
萨米克山·杜塔
c（c）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系，邮编68198
鲍文奇（Bowen Qi）
一美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
考斯图布·达塔
c（c）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系，邮编68198
乍得A.拉格兰奇
d日美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心泌尿外科手术部，邮编68198
e（电子）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
亚伦·M·莫斯
一美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
c（c）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系68198
e（电子）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
一美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心药学系，邮编68198
b条美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心Eppley癌症及相关疾病研究所，邮编68198
c（c）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心生物化学和分子生物学系，邮编68198
d日美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心泌尿外科手术部，邮编68198
e（电子）美国内布拉斯加州奥马哈内布拉斯加大学医学中心弗雷德·巴菲特癌症中心，邮编68198
- 补充资料
仰卧位。
GUID:7CDB6115-2510-45E2-93C1-E68B1B2C0485
摘要
手术切缘阳性增加了前列腺癌根治术后患者生化复发的风险，并需要抢救治疗。使用近红外（NIR）荧光造影剂的图像引导手术是检测残留癌组织的潜在方法。本研究的目的是评估三种透明质酸（HA）纳米粒（NP）制剂与NIR荧光团的对比增强前列腺癌的能力。HA通过和疏水配体氨基丙基-1-芘丁酰胺偶联来驱动纳米粒子自组装。吲哚菁绿（ICG）被物理化学地包埋在HA-NP中，称为纳米ICG。或者，Cy7.5直接偶联到两亲性HA，称为NanoCy7.5。用两个HA分子量合成了NanoCy7.5，以确定HA大小对PC3前列腺肿瘤异种移植物转运的贡献。通过一系列荧光成像、光谱图像引导手术和显微技术评估肿瘤的对比增强和相对生物分布。静脉注射NanoICG后24小时肿瘤信噪比（SNR）比ICG提高了2.9倍。含10kDa和100kDa HA的NanoCy7.5分别比Cy7.5提高了6.6倍和3.1倍。与周围组织相比，与NanoICG和NanoCy7.5（含10kDa HA）相比，通过图像引导系统可以清楚地确定PC3异种移植物的对比度增强。NIR荧光显微镜显示，含10kDa HA的NP中的Cy7.5分布在整个肿瘤中，而含100kDa HA或NanoICG的NanoCy7.5主要将染料传递到肿瘤边缘。CD31染色提示PC3肿瘤血管化不良。这些研究证明了一组HA衍生NP在识别前列腺肿瘤方面的功效体内，并建议通过调整这些NP的结构特性，可以实现对血管化不良肿瘤的优化输送。
关键词：聚合物共轭物、自组装、纳米粒子、术中成像、ICG、Cy7.5
重要性声明
我们已经证明了一组近红外荧光（NIRF）纳米颗粒（NP）在前列腺癌异种移植模型中用于图像引导手术的潜力。图像引导手术和器官成像离体当给小鼠注射共价偶联到（NanoCy7.5）的NIRF染料时，显示出更大的肿瘤信号和对比度10k-PBA)或物理化学包裹在（NanoICGPBA公司)透明质酸（HA）NP。这些结果显示了利用这些NP作为工具检测肿瘤边缘并在手术中区分健康组织和肿瘤组织的潜力。此外，该项目为选择血管化不良肿瘤的最佳配方策略提供了见解。
1 介绍
前列腺癌是男性中确诊率最高的癌症，约占新诊断癌症的五分之一，是美国男性癌症死亡的第三大原因[1]. 近80%的前列腺癌新诊断为局限性疾病[1]最常见的干预措施是手术、放射治疗和监测。基于人群的数据集显示，40-50%的新诊断患有局部疾病的男性接受了根治性前列腺切除术[2,三]，使其成为这种情况下最常见的治疗方法。然而，前列腺癌的治疗可能对尿、肠或性功能产生不利影响。
在10–15年的随访中，多达40%的男性在根治性前列腺切除术后出现生化复发[4]. 在一项研究中，超过30%的接受开放性根治性前列腺切除术的男性有阳性切缘，阳性切缘的存在与生化复发、局部复发和需要补救治疗的风险增加有关[5]. 前列腺癌手术已经发展，开放性根治性前列腺切除术已被机器人辅助根治性前列腺切除术（RARP）所取代[6]，2003-13年期间，美国的RARP数量从1.8%增加到85%[7]. 一项荟萃分析报告称，RARP的阳性手术切缘在6.5%至32%之间（平均15%）[8]. 荟萃分析显示，RARP的阳性手术切缘率至少与耻骨后前列腺根治术相当[9]，一项随机、对照的第3阶段研究显示，耻骨后前列腺根治术与RARP之间的手术切缘阳性率无统计学差异[10].
荧光图像引导手术（FIGS）有可能区分正常组织和病变组织，并为切除标本的病理学提供实时指导。FIGS方法通常使用“NIR窗口”，允许以大约700–1000 nm的波长进行成像，其中由于水和血红蛋白对光的组织吸收相对较低，光在组织中的穿透深度最大[11]. FDA和EMA批准的NIR荧光团吲哚青绿（ICG）已用于数万名副作用率较低（<0.15%）的患者[12]. ICG主要反映最初的血管分布（通过与白蛋白和其他血浆蛋白结合）和随后的肝胆排泄，因此被用于心输出量、肝功能和肝血流量的测试，以及眼底血管造影[12].
荧光成像也已在许多癌症手术中得到临床验证，使用荧光团，如ICG、亚甲基蓝和5-氨基乙酰丙酸[13]. 使用ICG直接注入患者前列腺的荧光增强RARP已用于前哨淋巴结定位[14–16]. 此外，直接注入多模ICG-99百万将Tc-NanoColl注入前列腺进行前哨淋巴结定位[17]. 这些研究表明荧光手术是可行和安全的，但在检测淋巴结转移方面显示出不同程度的特异性和敏感性。
靶向近红外染料和纳米粒子（NP）正被开发为IGS的新型造影剂。已开发出几种荧光NP用于细胞成像和生物医学应用[18,19]. 荧光NP利用肿瘤增强的通透性和滞留（EPR）效应，可以针对肿瘤，并且可以进行修饰以避免清除[20]. 在这项研究中，我们评估了使用透明质酸（HA）基纳米颗粒的近红外染料的输送。HA是一种遍及全身的糖胺聚糖，可由β（1,4）D-葡萄糖醛酸和β（1,3）N-乙酰-D-葡萄糖胺的重复单元组成多种大小，并能与许多受体结合，包括CD44、LYVE1和Stabilin-2（HARE）[21,22]. HA具有生物相容性、非免疫原性特点，并有可能靶向某些肿瘤上过度表达的CD44或通过EPR被动积累，因此已被用于合成许多用于成像和药物输送的NP[23–28]. NP配方的一种常见方法是用疏水配体修饰亲水性HA主链以驱动自组装[29–31].
在本研究中，我们报告了体内使用物理化学包埋ICG或共价共轭Cy7.5对三组HA-衍生近红外荧光（NIRF）NP进行成像评估。“NanoICG”配方使用10kDa HA聚合物，“NanoCy7.5”配方使用10 kDa和100 kDa HA聚合物。将NP交付给携带PC3肿瘤的裸鼠，并在24小时后进行检查。分析图像引导手术、肿瘤对比度、生物分布以及通过肿瘤的分布。
2 材料和方法
2.1. 材料
透明质酸钠（10kDa和100kDa）购自Lifecore Biomedical（美国明尼苏达州查斯卡）。1-芘丁酸、1,3-二氨基丙烷和ICG来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Cy7.5-胺购自Lumiprobe公司（美国佛罗里达州哈兰代尔海滩）。1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇和透析膜（3500 MWCO和6000–8000 MWCO）购自赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。乙醇是从华纳-格雷厄姆公司（美国马里兰州科基维尔）或内布拉斯加州大学医学中心总供应处购买的。脱盐PD10色谱柱购自GE Health-care Bio-Sciences（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。D类2O[99.9%D]和DMSO-D6[99.8%D]购自EMD Millipore。所有水均来自Barnstead NANOpure Diamond或Barnstead-GenPure系统（Thermo Fisher Scientific），产生18.2 MX水。
2.2. 细胞系和培养
PC3前列腺癌细胞系取自美国型培养物收集中心（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。PC3细胞保存在添加10%胎牛血清、100 I.U.青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。细胞在含5%CO的加湿培养箱中于37°C下培养2.
2.3. HA-PBA纳米粒子的制备
HA纳米粒子（NP）的合成如前所述[29]. 简单地说，以1-芘丁酸为原料，在60℃甲醇中回流6 h，合成了氨丙基-1-芘丁酰胺（PBA），然后在135℃的1,3-二氨基丙烷中纯化和回流6 h。首先在50:50 h中溶解HA，用10kDa或100kDa HA聚合物与10wt%PBA偶联，合成了HA-PBA偶联物2O： 含有10倍摩尔过量EDC/NHS的DMF，然后在DMF中滴加PBA并搅拌24小时。在50:50 h中通过透析（3500Da MWCO，Fisher Scientific）纯化每个聚合物缀合物2O： EtOH 24小时，然后在纯h中透析2使用NHS/EDC化学将Cy7.5-胺与HA-PBA偶联48 h[30]，而ICG按照前面所述进行物理加载() [29]. 将反应混合物置于含有3500 MWCO（10 kDa HA-PBA衍生物）或6000–8000 Da（100 kDa HA-PBA衍生品）的透析袋中，并用水透析24小时，换4–6次水。以超纯水为流动相，通过PD10脱盐柱去除HA结合物中残留的未结合Cy7.5染料。然后将NP冷冻、冻干并储存在−20°C下。
用于NIR染料包封或偶联的两亲性HA聚合物偶联物的结构。用10kDa或100kDa HA聚合物（黑色结构）与10wt%PBA（红色结构）共轭，合成了HA-PBA共轭物。（A） ICG（绿色结构）被物理包裹在HA-PBA中，而（B）Cy7.5-胺（绿色结构的）被EDC/NHS化学偶联到HA-PBA。Cy7.5，氰化物7.5；吲哚菁绿；透明质酸；PBA，氨丙基-1-芘丁酰胺。（C） ICG和Cy7.5的归一化荧光与相关组织的有效衰减系数光谱的比较[39].经Springer Nature许可改编：纳米技术《生物成像：活体成像的第二个窗口》，AM Smith，MC Mancini，S Nie，©2009。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
2.4. 纳米粒子表征
溶解在水中并在0.45μm注射器过滤器中过滤的NP的流体动力学直径（HD）和zeta电位在ZetaSizer NanoZS90上测定（英国马尔文仪器公司）。NP在1:1 H中分解后，用紫外-可见分光光度法测定含氟量2O： DMSO使用Evolution 220分光光度计（Thermo Fisher Scientific，威斯康星州麦迪逊，美国），在1:1 H2O/DMSO中使用ICG或Cy7.5的标准曲线。哈10公里-负载ICG的PBA共轭物称为NanoICGPBA公司由10kDa HA和PBA组成的NanoCy7.5共轭物被鉴定为NanoCy7.510k-PBA，而由100kDa HA和PBA组成的那些被鉴定为NanoCy7.5100k-多溴联苯选择ICG和Cy7.5是因为它们在近红外窗口中具有优化的荧光，从而使组织散射和吸收最小化[11]，并与近红外成像系统进行了优化集成().
使用配备Waters Ultrahydrogel 1000和250柱的Waters 1515 HPLC泵、Waters 2998光电二极管阵列检测器、Waters2414折射率检测器（Waters Corporation；Milford，MA）和Wyatt miniDAWN TREOS多角度光散射检测器（Wyatt Technology Corporation；加州圣巴巴拉）。使用Astra 6.1.7（Wyatt Technology Corporation；加州圣巴巴拉）对数据进行分析。使用两个流动相以4.0 mg/mL的浓度制备样品；pH值为7.0的0.1 M水磷酸盐缓冲液，或对于拆卸缓冲液，pH值为7的0.1 M水中磷酸盐缓冲液中50%二甲基亚砜的溶液().
HA和HA共轭物的尺寸排除色谱报告为dRI光谱。HA、HA-PBA和HA-PBA-Cy7.5样品使用10 kDa HA（A，B）或100 kDa HA（C，D）制备，并在水缓冲液（B，D）或50:50水缓冲液DMSO（“拆卸缓冲液”，A，C）中制备。（A） 显示了拆开的HA缀合物之间的差异，比较了10kDa HA的三个样品之间的尺寸差异。与（B）相比，（B）显示了组装的缀合物的SEC轮廓，由于形成自组装纳米颗粒的聚合物链之间的缔合，样品看起来略大。100kDa HA样品也有同样的趋势，其中组装（D）样品略大于拆卸（C）样品。
纳米Cy7.510k-PBA和NanoCy7.5100k-多溴联苯在室温下使用5 mm探针在Bruker Avance 500 MHz核磁共振波谱仪上分析NP。纳米Cy7.510k-PBA和NanoCy7.5100k-多溴联苯NP在50/50 D内进行分析2O/二甲基亚砜-D6.1HA-PBA的核磁共振氢谱在我们之前的出版物中提供[29]. 使用UNMC电子显微镜核心设施中提供的FEI Tecnai G2 Spirit TEM（FEI；俄勒冈州希尔斯波罗）获得了透射电子显微镜（TEM）图像。在TEM成像之前，将NP（PBS中的浓度为1.0 mg/mL）放置在涂有甲醛/氧化硅涂层的200目铜网格上，并允许其粘附约5分钟，应用NanoVan阴性染色30秒，并对样品进行吸墨剂处理，以去除多余的溶剂或材料。NanoICG和NanoCy7.5的TEM图像10k-PBA我们以前的出版物中也提供了NP[23,32,33]. NanoICG的稳定性PBA公司报道了在含有牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液中[23]显示ICG通过透析膜迅速释放到含白蛋白的溶液中。还表明，以氨丙基-5β-胆酰胺作为共轭疏水部分的NanoCy7.5变体，NanoCy7.5100k-5βCA，显示在6小时内有限地分解为含蛋白溶液，然后在接下来的72小时内逐渐分解[23]. 纳米ICG的细胞毒性PBA公司以前的研究表明在培养细胞中可以忽略不计[29]，NanoCy7.5也有报道10k-PBA[33].
通过混合磷酸二钠、磷酸单钠和磷酸溶液，将pH调节至4、5、6、7和8，同时保持离子强度恒定，研究了不同pH值下磷酸盐缓冲溶液中NP的荧光稳定性。样品首先在每个pH溶液中溶解至100μM的染料（Cy7.5或ICG）浓度，然后进一步稀释至10μM的染色浓度并培养1 h。培养后，通过添加DMSO（50/50缓冲液：DMSO final）分解NP，使最终染料浓度为5μM，并读取吸光度和荧光读数。由于之前的报告显示NP在H2O可以淬灭ICG和Cy7.5荧光[29,30]. 荧光光谱是在配备NIR扩展范围PMT（Horiba Jobin Yvon；Edison，NJ，USA）的FluoroMax-4荧光光谱仪上获得的，激发波长为785 nm，发射波长范围为800至900 nm。纳米Cy7.5100k-多溴联苯具有较低的溶解度并且被稀释到相同的最终浓度。作为对照，将NP直接溶解在50/50缓冲液中：二甲基亚砜溶液（pH调节）至5μM的最终染料浓度，并读取吸光度和荧光读数。
2.5. 肿瘤植入
所有动物工作均按照内布拉斯加州大学医学中心动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。PC3细胞（3×106细胞）悬浮在100μL 1:1培养基中：将基质凝胶（基质凝胶#354234，来自美国纽约州科宁市科宁市）皮下注射在4-5周龄雄性裸鼠（菌株：J:NU，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA）的侧面。肿瘤至少可以生长三周。
2.6. 近红外荧光造影剂输送、图像引导手术和相关器官分布
当肿瘤达到150毫米以上时三，小鼠通过尾静脉静脉注射（200μL）ICG或NanoICGPBA公司，Cy7.5-胺，纳米Cy7.510k-PBA，或NanoCy7.5100k-多溴联苯ICG和NanoICG的ICG数量相等PBA公司（10 nmol[7.75μg]ICG/小鼠），Cy7.5在Cy7.5-胺、NanoCy7.5中的数量相等10k-PBA和NanoCy7.5100k-多溴联苯（1.2 nmol[984 ng]Cy7.5/只小鼠）。注射24小时后对小鼠实施安乐死。使用一个定制设计的图像引导手术系统进行模拟图像引导手术，该系统集成了局部NIR光谱和广域成像[34]. 利用该系统，通过拍摄快照和视频来确定肿瘤相对于周围组织的对比度增强。对尸检组织进行额外的光谱分析。用距离组织表面1 cm的激光尖端获得组织光谱，激光功率为30 mW或80 mW，并将结果归一化，这与我们之前报道的方法一致[23,29,32,34].
尸检后，使用Pearl Trilogy小型动物荧光成像系统（LI-COR；Lincoln，NE，USA）对小鼠器官进行成像，以检测ICG或Cy7.5（800 nm通道）。使用LI-COR Image Studio 5.0软件对图像进行分析，以手动绘制肿瘤和器官周围的感兴趣区域，并使用平均像素强度计算信噪比（SNR）。SNR=（感兴趣区域中每像素的平均组织强度）/（感兴趣背景区域的标准偏差）。
2.7. 组织学分析和荧光显微镜
图像引导手术研究中的肿瘤组织立即放置在O.C.T.包埋介质凝胶中（Fisher Healthcare），并在液氮中快速冷冻。这些样本随后由UNMC组织科学设施切割和处理。用苏木精和伊红（H&E）对每个样品的切片进行染色，或者在NIR荧光显微镜下不染色。代表性肿瘤切片也用Masson三色染色或抗体染色，包括抗mCD31、内皮标记物（1:100，ab28364 Abcam，Cambridge，MA，USA）；抗hKi67，增殖标记物（1:200，ab16667 Abcam）；和抗hCD44（1:500，#3570 Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA），HA的细胞表面受体。这些图像是用带有氙激发源的奥林巴斯（日本东京）IX73倒置显微镜拍摄的，并用奥林巴斯DP80数字相机和cellSens Dimension软件拍摄。使用FITC滤光片立方体对未染色的载玻片进行自体荧光成像，使用能够同时成像ICG和Cy7.5荧光发射的ICG滤光片立方进行NIR荧光成像。使用相同的处理参数，利用图像J（NIH）进一步分析显微照片。
2.8. 统计分析
数据在Prism 7软件（Graphpad，La Jolla，CA，USA）中进行分析。NanoCy偶联物在器官中的生物分布使用双向方差分析和Tukey的多重比较检验进行分析；采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验分析肿瘤的SNR比较；使用多重t检验分析NanoICG的生物分布。图表标题中提到了统计测试。所有数据均显示为平均值±标准偏差（SD）。
三。 结果
3.1. 纳米粒子表征
HA与PBA或PBA和Cy7.5偶联。PBA结合被证实1先前报道的10 kDa HA的核磁共振氢谱[29]，同时110和100 kDa HA与PBA和Cy7.5共轭物的H NMR报告于补充图1其特征是存在芳香芘基团、Cy7.5部分上的piconjugated系统和HA上的N-乙酰甲基。纳米Cy7.510k-PBA流体动力学直径（HD）为195±13 nm，PDI为0.431±0.116，zeta电位为−18.5±0.9 mV。NanoCy7.5100k-多溴联苯HD为144±4 nm，PDI为0.174±0.052，zeta电位为−13.2±2.1 mV。NanoCy7.5相对较小的HD100k-多溴联苯与NanoCy7.5相比10k-PBA很可能是由于Cy7.5共轭程度较高，从而促进了NanoCy7.5的更大堆积100k-多溴联苯在含水条件下，与我们之前的结果一致[30]. TEM图像同样显示NanoCy7.5100k-多溴联苯小于NanoCy7.510公里PBA(补充图2)。纳米ICGPBA公司HD为84±11 nm，PDI为0.244±0.016。对于NanoCy7.5，Cy7.5的最终重量百分比为1.4 wt%10k-PBA和11.2 wt%（对于NanoCy7.5）100k-多溴联苯先前报告称，NanoICG中ICG的最终重量百分比为9.4 wt%PBA公司[29].
未改性HA的尺寸排除色谱10公里-PBA和分解的NanoCy7.510k-PBA显示了10 kDa HA的三个样品之间的大小差异，其中NanoCy7.510公里PBA洗脱得更快()。与相比时，它显示了组装共轭物的SEC剖面由于形成自组装NP的聚合物链之间的关联，显示稍大（即洗脱更快）。在100 kDa HA样品中观察到相同的趋势，其中组装的()样品略大于拆卸的样品()样品。
NPs在生物pH下显示出高荧光稳定性，其中NanoCy7.5100k-多溴联苯在高（pH8）和低（pH4）pH下，荧光降低(补充图3)。NanoCy7.5的吸收光谱也出现了展宽100k-多溴联苯pH值为8时，可能是由于散射和较高pH值下Cy7.5溶解度降低(补充图4).
3.2、。相对生物分布
使用LI-COR Pearl Trilogy成像系统评估NIRF NP制剂和游离染料的相对生物分布。静脉注射24小时后采集的组织的典型图像如所示.将所有小鼠器官的荧光强度量化为信噪比（SNR）值，并根据面积进行校正()。与基于ICG的NP相比，基于Cy7.5的药物的整体荧光信号（包括PC3肿瘤发出的荧光信号）更高()。在肝脏和脾脏中观察到NanoCy7.5的最高SNR10k-PBA和NanoCy7.5100k-多溴联苯Cy7.5、ICG和NanoICG的最高SNR来自肝脏和肾脏PBA。纳米Cy7.5100k-多溴联苯在脾脏中显示非常高的信号（比NanoCy7.5高3.2倍10k-PBA)与之前在乳腺癌模型中使用100kDa HA衍生NP的研究一致[23]. 来自Cy7.5的NPs与HA共价结合，增加了对PC3肿瘤的传递。NanoCy7.5的管理10k-PBA与Cy7.5胺相比，肿瘤信号增加了6.6倍。纳米Cy7.5100k-多溴联苯与Cy7.5-胺相比，其信号高3.1倍，但有趣的是，其信号低于NanoCy7.510公里PBA.纳米ICGPBA公司在PC3肿瘤中显示出比游离ICG高2.9倍的近红外信号().
给药后对比剂在PC3荷瘤裸鼠体内的生物分布。（A-C）代表性NIR荧光图像离体静脉注射指定的造影剂（1.2 nmol[984 ng]Cy7.5/小鼠用于Cy7.5-胺，NanoCy7.5）24小时后收获的器官10k-PBA，或NanoCy7.5100k-多溴联苯)。所有图像都是“800 nm”通道，覆盖在珍珠三部曲成像系统的亮场照片上。器官标签：T，肿瘤；H、 心脏；卢、龙；Sp，脾脏；P、 胰腺；李，肝脏；M、 肌肉（即股四头肌）；B、 骨（即股骨）；K、 肾脏；F、 肿瘤旁脂肪组织伴潜在淋巴；I.LN，皮肤附着的腹股沟淋巴结。（D） 静脉注射NanoCy7.5共轭物和Cy7.5-胺对照物24小时后收集的器官荧光强度的定量总结，其中条形代表N=4小鼠的平均像素信噪比（SNR；平均值±s.D），一些肿瘤有两部分。****p<0.0001，采用Tukey多重比较试验进行双向方差分析。（E，F）的代表性NIR荧光图像离体静脉注射指定的造影剂（ICG和NanoICG用10 nmol[7.75μg]ICG/小鼠）24小时后收获的器官PBA公司)。（G） NanoICG中荧光强度的定量总结PBA公司和ICG对照组，其中条形表示ICG的N=3只小鼠和NanoICG的N=4只小鼠的平均像素SNR（平均值±SD）PBA公司，有些肿瘤有两个部分*p<0.05，**p<0.01，未配对t吨-测试。（H） 肿瘤SNR用缩放到相同水平的肿瘤的代表性NIR荧光图片显示，以更好地显示组间差异，#p<0.05，##p<0.01，####p<0.0001，使用Tukey多重比较测试对Cy7.5组进行单因素方差分析，以及##ICG组的Mann-Whitney检验p<0.01。
为了检测NP提供的NIR信号的图像对比度和生物分布变化，将肿瘤的SNR与周围肌肉和高背景组织进行比较。NanoCy7.5的肿瘤与肌肉比率10k-PBA与Cy7.5-胺（3.0倍，)，而NanoCy7.5的肿瘤与肾脏比率10公里PBA显著高于Cy7.5-胺（5.4倍）、NanoCy7.5100k-多溴联苯（1.9倍）和ICG（2.4倍）()。与ICG、NanoICG相比PBA公司肿瘤与肌肉的比率（2.2倍）、肿瘤与肾脏的比率（2.3倍）和肿瘤与脾脏的比率（1.7倍）显著增加()。纳米ICGPBA公司与所有Cy7.5药物相比，肿瘤与肝脏和肿瘤与脾脏的比率显著升高，与Cy7.5-胺和NanoCy7.5相比，肿瘤对肌肉和肿瘤对肾脏的比率增加100k-多溴联苯().
PC3荷瘤裸鼠的肿瘤器官比率。（A） 肿瘤对肌肉，（B）肿瘤对肝脏，（C）肿瘤对肾脏，以及（D）肿瘤对脾脏SNR比率，从离体在中成像.*p＜0.05，**p<0.01，***p<0.001，****使用Tukey多重比较测试进行p<0.0001单因素方差分析。
3.3、。图像引导手术
纳米ICGPBA公司，纳米Cy7.510k-PBA，或NanoCy7.5100k-多溴联苯并对其各自的染料克隆对照物进行检查，以用于图像引导手术。FIGS提供的术中成像显示，在给药NanoCy7.5的小鼠进行手术期间，可以在皮下PC3肿瘤中检测到NIR荧光10公里PBA（1.2 nmol Cy7.5/小鼠），而相邻肌肉的增强程度最小()。保持宽场成像参数恒定，NanoCy7.5100k-多溴联苯在具有80mW激发功率的肿瘤中很容易检测到，但在肿瘤周围的邻近肌肉区域也可以看到。纳米ICGPBA公司肿瘤中可见（10 nmol/小鼠），但使用80 mW激发功率时强度较低，在邻近肌肉组织中未见。Cy7.5-胺和ICG以相同的激发功率和广域成像参数进行控制，导致手术期间没有或很少检测到肿瘤()。在所有造影剂的肠道区域观察到NIR荧光。
皮下PC3前列腺肿瘤小鼠的图像引导手术。（A） 静脉注射指定的造影剂（1.2 nmol Cy7.5-胺，NanoCy7.5）24小时后，使用代表性小鼠的FIGSS进行肿瘤手术检测10公里PBA，或NanoCy7.5100k-多溴联苯; ICG和NanoICG用10 nmol ICG/小鼠PBA公司)。当激光照射肿瘤和切除肿瘤时，拍摄图像。对3只ICG小鼠和4只其他组小鼠进行模拟图像引导手术。（B） 来自（a）所示各组中代表性小鼠的切除肿瘤和肌肉（即股四头肌）的光谱信号。所有组的积分时间为1s，NanoCy7.5的激发功率设置为30 mW10k-PBA所有其他组为80 mW。将曲线归一化为80 mW激励功率。（C） 基于强度-波长曲线AUC的切除肿瘤和肌肉光谱信号总结。数值表示为平均值±SD（对于NanoCy7.5，n=210k-PBA，ICG肌肉n=3，所有其他组n=4）*p<0.05，**p＜0.01；通过双向方差分析和Tukey方法进行多重比较确定。#p<0.05；由未成对确定t吨-测试。
光谱分析表明，与所有对比剂的切除肌肉（即股四头肌）相比，切除肿瘤中的NIR荧光更强()，使用ICG和NanoICGPBA公司肿瘤和NanoCy7.5的水平在统计学上较高10k-PBA接近显著性（p=0.08）。注射NanoICG的小鼠肿瘤的AUC较高PBA公司与ICG相比（1.6倍），但无统计学意义。注射NanoCy7.5的小鼠肿瘤中AUC较高10k-PBA和NanoCy7.5100k-多溴联苯与Cy7.5胺（分别为2.2倍和2.5倍）相比，NanoCy7.5100k-多溴联苯实现意义。
3.4. 红外染料在肿瘤内的分布
PC3肿瘤的组织学分析用于确定红外染料在整个肿瘤中的分布。NIR荧光显微镜显示NanoCy7.510公里PBA分布在整个肿瘤中，而来自NanoCy7.5的NIR信号100-k-PBA和NanoICGPBA公司主要见于肿瘤边缘，肿瘤内有少量信号区()。CD31染色显示PC3肿瘤血管化不良。用抗hKi67对PC3肿瘤进行染色显示，增殖的癌细胞分布在整个肿瘤中，约30-40%的肿瘤细胞Ki67染色阳性。Masson’s三色染色显示肿瘤内胶原水平较低，向肿瘤周边增加。肿瘤细胞CD44表达高度阳性()，已知与HA结合的蛋白质[35].
近红外染料在肿瘤中的分布。（A） 冷冻切片后显示的NIR纳米粒子的NIR通道中肿瘤的代表性荧光显微照片。比例尺=100μm。（B） 用指示的染料（Masson三色）或抗体（抗mCD31，内皮标记物；抗hKi67，增殖标记物；以及抗hCD44，HA的细胞表面受体）对代表性肿瘤切片进行染色。用抗体染色的切片（显示为棕色）用苏木精复染（显示为蓝色）。CD31-阳性血管用黄色箭头标记。比例尺=50μm。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）
4 讨论
基于我们之前描述的方法，我们合成了三种来源于HA的NP制剂[23,29,30]，以评估前列腺癌异种移植模型中近红外荧光团Cy7.5和ICG的传递。我们之前的研究使用PBA作为与HA偶联的疏水配体，以驱动自组装成NP用于NIR染料负载。我们最近还报道了使用含有减肥药和脂肪酸合成酶（FASN）抑制剂奥利司他（orlistat）的HAPBA NPs治疗培养中的乳腺癌和耐紫杉醇前列腺癌细胞系[24,31]. 因此，先前和当前的成像研究预测PBA-HA纳米粒将增强染料和疏水药物对肿瘤的传递体内.
尽管ICG和NanoICGPBA公司与Cy7.5制剂（1.2 nmol Cy7.5/小鼠）相比，以更高的剂量（10 nmol ICG/小鼠）给药，Cy7.5剂型在给药24小时后在所有组织中显示出更高的SNR()。这在一定程度上是由于Cy7.5比ICG具有更高的量子产率，并且因为Cy7.5直接共轭于HA，而ICG仅被物理包裹。预计，我们之前的研究显示速度较慢在体外与来自NanoICG的ICG相比，来自NanoCy7.5制剂的Cy7.5的释放/分解[23]. 尽管如此，NanoICGPBA公司与其他测试的NP相比，肿瘤与肌肉、肿瘤与肝脏和肿瘤与脾脏的比率最高，肿瘤与肾脏的比率第二高()。因此，即使Cy7.5比ICG亮，使用ICG获得的NP在某些情况下也会产生更高的对比度。纳米Cy7.510k-PBA与所有测试药物相比，肿瘤的信噪比最高()，与游离Cy7.5-胺相比，肿瘤与肌肉的比率显著增加()。纳米Cy7.510k-PBA在FIGS期间肿瘤也有高信号()与肌肉相比，频谱AUC趋向于，但没有达到显著性()。这些结果表明，具有10kDa HA的NP为向PC3肿瘤递送ICG和Cy7.5提供了优势。
在目前的工作中，NanoICGPBA公司24小时时，肿瘤对肌肉的SNR显著增加（2.2倍）。在乳腺癌肿瘤中，NanoICGPBA公司MDA-MB-231肿瘤中肿瘤与肌肉的对比噪声比（CNR）增加2.3倍[29]24小时时，4T1肿瘤的肿瘤-肌肉CNR增加了近2.2倍[23]. 在胰腺肿瘤中，NanoICGPBA公司信号是ICG组的2.0倍[32]. 因此，与肌肉相比，NanoICG的对比度始终高出约2倍PBA公司然而，目前研究中NanoICG的肿瘤SNR值要低得多PBA公司与我们之前的研究相比，PC3前列腺肿瘤中的前列腺癌患者。与其他前列腺癌异种移植瘤相比，经CD31染色评估，PC3异种移植肿瘤的血管较少[36]经低CD31染色证实()。低血管染色和高增殖染色（Ki67，)可能是SNR值较低的一个促成因素，因为其他研究表明，增殖的癌细胞会导致肿瘤内血管受压和塌陷[39].
令人惊讶的是，NanoCy7.510k-PBA与NanoCy7.5相比，信噪比明显更高100k-多溴联苯PC3肿瘤()，因为100 kDa HA NPs在乳腺癌肿瘤中显示较高的信噪比[23]与10 kDa HA NP相比，100 kDa HANP与CD44表达细胞的结合更为特异在体外抑制试验[30]. 其他研究表明，高分子量HA与CD44形成更紧密的多价相互作用[37]在PC3细胞中高度表达[38]，并在此处确认NanoCy7.5的信噪比越高10k-PBA可以用几个潜在的原因来解释。首先，NanoCy7.5100k-多溴联苯脾脏中的SNR非常高（比NanoCy7.5高3.2倍10k-PBA)与之前在乳腺癌模型中使用100kDa HA衍生NP的研究一致[23]. 这种在脾脏中的优先积累可以限制NanoCy7.5的数量100k-多溴联苯可用于肿瘤。此外，肿瘤分布的差异可能是由于穿透行为。为此，一旦本文研究的NP由于血管渗漏而从血管系统中逃逸，则根据HA主链的MW，NP的扩散可能受到限制[23].
总之，我们观察到，即使基于HA的NP被PC3肿瘤吸收，它们也不会均匀地增强肿瘤，也不会均匀地增强整个肿瘤（总结于和)。在图像引导手术应用中，肿瘤的边缘/表面很重要，CD44的表达可能对基于HA的NP结合很重要，但似乎对肿瘤的分布没有作用。未来的研究需要评估NIR信号与肿瘤细胞的CD44表达或巨噬细胞和基质细胞的其他标记物的相关性，以确定为什么NanoCy7.510k-PBA与NanoCy7.5相比具有更高的信噪比100k-多溴联苯。未来的研究将评估NIRF NP在更动态肿瘤模型中的传递，包括原位肿瘤模型。未来的研究还将评估正常前列腺、膀胱或精囊对NIR染料的吸收，这些是前列腺手术中重要的背景组织。
纳米颗粒-NIR染料在肿瘤中分布的观察总结。在测试的纳米颗粒中，NanoCy7.510k-PBA化学偶联Cy7.5具有最高的信噪比（SNR），在图像引导手术中具有高信号，在显微镜下，NIR信号分布在整个肿瘤中。纳米Cy7.5100k-多溴联苯与游离Cy7.5-胺相比，信噪比增加，但肿瘤与器官的分布较低，在图像引导手术期间对比度较低，因为背景组织中的信号较高，肿瘤渗透性较低。自NanoICG以来PBA公司我们假设染料在到达肿瘤之前从NP中释放出来。纳米ICGPBA公司具有较低的信噪比值，但由于背景组织信号较低，肿瘤-器官分布值较大，在图像引导手术中具有暗淡但肿瘤特异性的信号，释放的ICG对肿瘤的渗透性较低。纳米颗粒不会按比例绘制。
表1
| 观察 | 订单 |
|---|
| 生物分布：肿瘤信噪比 | 纳米Cy7.510k-PBA>纳米Cy7–5100k-多溴联苯>纳米CGPBA公司 |
| 生物分布：肿瘤与器官的比率 | 纳米CGPBA公司=纳米Cy7.510k-PBA>纳米Cy7.5100k-多溴联苯 |
| 图像引导手术：亮度 | 纳米Cy7.510k-PBA=纳米Cy7.510万PBA>纳米CGPBA公司 |
| 图像引导手术：对比 | 纳米Cy7.510k-PBA=纳米CGPBA公司>纳米Cy7.5100k-多溴联苯 |
5 结论
我们已经证明了NIRF NP小组在前列腺癌模型的图像引导手术中的潜力。模拟图像引导手术和器官成像离体当给小鼠注射共价偶联到（即NanoCy7.5）的NIRF染料时，显示出更大的肿瘤信号和对比度10k-PBA)或物理化学包裹在（即NanoICGPBA公司)HA NP。这些结果显示了利用这些NP作为工具检测肿瘤边缘并在手术中区分健康组织和肿瘤组织的潜力。与物理化学包埋染料的NP相比，化学偶联到HA的NP具有更高的肿瘤信号，这表明较长的稳定性特征允许NP通过被动积累或HA-binding蛋白的主动靶向积累更高。未来的疗效研究需要检查使用这些对比剂对肿瘤切除后复发和生存的影响。
致谢
我们感谢蒋江博士和孙丽君博士为联合国儿童基金会组织科学设施提供的技术援助。这项工作由国家普通医学科学研究所（P20 GM103480）、国家生物医学成像和生物工程研究所（R01 EB019449）、UNMC的弗雷德·巴菲特癌症中心（P30 CA036727）、戴维斯慈善组织和内布拉斯加州研究计划资助。
缩写：
| AUC公司 | 曲线下面积 |
| 图 | 荧光图像引导手术 |
| ICG公司 | 吲哚菁绿 |
| IGS公司 | 图像引导手术 |
| 哈 | 透明质酸 |
| 近红外光谱 | 近红外 |
| 近红外光谱 | 近红外荧光 |
| NP（个） | 纳米粒子 |
| PBA公司 | 氨丙基-1-芘丁酰胺 |
| RARP公司 | 机器人辅助前列腺癌根治术 |
工具书类
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