口腔生物学Arch。作者手稿;PMC 2020年1月1日提供。
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NIHMSID公司:美国国立卫生研究院1511614
人类和牙龈卟啉单胞菌谷氨酰胺环化酶在牙周炎和类风湿关节炎中的初步研究
,一 ,一 ,b条 ,c(c) ,一 ,日期:,e(电子) ,(f) ,c(c)和a、,*
安德烈亚斯·艾格
一瑞士伯尔尼大学牙医学院牙周病学系
马丁·韦斯特曼
b条德国耶拿州耶拿大学医院电子显微镜中心
纳丁·陶特
c(c)德国哈雷/萨尔弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所IZI-WT
扬·波坦帕
d日波兰克拉科夫贾杰伦大学生物化学、生物物理和生物技术学院微生物系
e(电子)美国路易斯维尔大学口腔医学院口腔免疫与传染病系
伯克哈德·莫勒
(f)瑞士伯尔尼大学医院风湿病学、临床免疫学和变态反应学系
米尔科·布霍尔茨
c(c)德国哈雷/萨尔弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所IZI-WT
一瑞士伯尔尼大学牙医学院牙周病学系
b条德国耶拿大学医院电子显微镜中心
c(c)德国哈雷/萨尔弗劳恩霍夫细胞治疗和免疫学研究所IZI-WT
d日波兰克拉科夫贾杰伦大学生物化学、生物物理和生物技术学院微生物系
e(电子)美国路易斯维尔路易斯维尔大学牙科学院口腔免疫学和传染病系
(f)瑞士伯尔尼大学医院风湿病学、临床免疫学和变态反应学系
摘要
目标:
人谷氨酰胺环化酶(QC和isoQC)在维持炎症状态中发挥重要作用。同时,谷氨酰胺环化酶由牙龈卟啉单胞菌(PgQC)是牙周炎发病的关键病原体,也是牙周炎与类风湿关节炎(RA)的潜在联系。本研究旨在检测QC、isoQC和PgQC在慢性牙周炎(CP)和RA患者中的表达。
设计:
30名志愿者参加了一项试点研究,并分为3组(健康、CP和RA个体)。分析血样、生物膜和龈沟液(GCF)中QC、isoQC和牙龈假单胞菌质量控制。在龈下生物膜中量化与牙周病相关的主要细菌,并在GCF中测定单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、MCP-3和白细胞介素(IL)-1β的蛋白水平。PgQC在mRNA和蛋白质水平上的表达在两组中进行了评估牙龈假单胞菌菌株。
结果:
PgQC表示为牙龈假单胞菌菌株和蛋白质似乎主要位于塑性周隙。RA患者、健康受试者和CP患者外周血中QC的mRNA表达显著增加(分别为p=0.013和p=0.003)。RA患者GCF中QC mRNA的检测频率高于健康对照组(p=0.043)。在这些样本中,与来自牙周健康个体的GCF相比,IL-1β水平也升高(p=0.003)。13例中有8例检测到PgQC牙龈假单胞菌阳性生物膜样本。
结论:
QC的活性可能在维持RA的慢性牙周炎症和破坏中起支持作用。PgQC在体内表达,但需要进一步研究评估这种酶的生物学重要性,以及它是否构成牙周抗菌治疗的潜在靶点。
关键词:生物标志物,慢性炎症性疾病,牙缝液,外周血
2.材料和方法
2.1.的表达式牙龈假单胞菌质量控制
在数据库(登录号AE 015924.1)中搜索谷氨酰胺环转移酶相关蛋白。在鉴定了相应区域(2263083…2264084)后,设计了引物(5’-TGC ACA CAG AGA CCT TCG AC-3’,5’-TGA TCA TCT GTC AGA GCG CC-3’)。草地作为一种高表达酶,被用作最近描述的比较基因(引物:5′-AAT TCC ACC ACG GTA AGC AC-3′,5′-TTC TCG ATG GAC AGT TTG CC-3′)(Frohlich等人,2013年).
在初步实验中牙龈假单胞菌ATCC 33277(参考菌株)和牙龈假单胞菌包括J430-1(临床分离株)。菌株在Schaedler琼脂平板(Oxoid,Basingstoke,UK)上预先培养,添加5%的羊血和维生素K,在厌氧环境中培养24小时。然后,制备0.9%w/v NaCl(相当于McFarland 4)中的细菌悬浮液,并与添加5 mg/lβ-NAD的Wilkins-Chalgren肉汤(Oxiod)以1:50的比例混合。试管在37°C的厌氧环境中培养1 h、2 h、4 h和24 h。用0.9%w/v NaCl洗涤培养物后,使用innuPREP RNA迷你试剂盒(德国耶拿分析公司)纯化总RNA。然后使用RevertAid RT试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)从100ng总RNA合成cDNA。最后,使用GoTaq qPCR Master Mix(美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司)和7500实时PCR系统(美国福斯特市Applied Biosystems™)进行实时聚合酶链反应。所有程序均按照制造商的说明进行。
在第二系列初步实验中,使用Western blot技术鉴定QC蛋白表达。因此,首先使用表达的多克隆抗体(MWT-Ab-00001),通过兔子的5步免疫程序生成多克隆抗体(大肠杆菌)纯化不含His-Tag的全蛋白,然后亲和纯化抗血清。纯化的HisPgQC或不含37 KDa或34 KDa HisTag的PgQC的理论分子量可以得到批准。如前所述培养菌株。在相应的时间,将含有细菌的培养基(1小时、2小时、4小时和24小时)在10’000g,持续5分钟。通过离心和含有约2×10的颗粒收集细菌9将细菌悬浮在500µl样品缓冲液(0.125 M Tris–HCl,20%甘油,4%十二烷基硫酸钠)中,然后在还原条件下进行SDS–PAGE(10%聚丙烯酰胺,包括0.1%十二烷基磺酸钠)。接下来,将分解的蛋白质转移到硝化纤维素膜上(英国白金汉郡GE Healthcare)。在5%脱脂牛奶(新泽西州富兰克林湖BD)中隔夜封闭膜上的非特异性结合位点。然后用上述多克隆兔抗体MWT-Ab-00001对斑点进行检测牙龈卟啉单胞菌QC之后是山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶结合抗体(德国汉堡Dako Deutschland GmbH)。使用ECL Plus(GE Healthcare)底物试剂盒开发印迹,并使用凝胶文档系统(VWR®Imager CHEMI premium,VWR International,Radnor,PA,USA)进行可视化。所有实验都是在独立的副本中进行的。
对于冷冻断裂复制免疫标记(FRIL)电子显微镜牙龈假单胞菌菌株培养24小时,然后按照最近的描述进行制备和免疫金标记(Schlormann等人,2010年). 作为一种主要抗体,多克隆兔抗体MWT-Ab-00001牙龈假单胞菌再次使用,并使用具有10nm金的山羊抗兔IgG作为二级金缀合抗体(British Biocell International,Cardiff,UK)。初级和次级抗体按1:50稀释。
2.2. 研究参与者
本研究是根据世界医学会伦理规范(赫尔辛基宣言)进行的人体实验。伯尔尼州道德委员会批准了研究方案(KEK 326/2014)。全部30名研究参与者签署了知情同意书,并始终遵守他们的隐私权。从伯尔尼大学牙医学院牙周病学系推荐的患者中连续招募20名全身健康志愿者(10名牙周健康,10名患有CP)。伯尔尼大学医院风湿病学、免疫学和变态反应学诊所连续选择了另外10名风湿性关节炎门诊患者。
根据该组,纳入标准分别为CP、牙周健康和类风湿关节炎。根据Armitage标准诊断CP(阿米蒂奇,1999年). 在牙周炎中,必须至少在四个非相邻部位测量≥5 mm的探测深度(PD)。所有类风湿关节炎患者必须符合美国风湿病学会(ACR)/欧洲风湿病联盟(EULAR)2010年分类标准(Aletaha等人,2010年). 研究参与者的年龄必须在25至70岁之间。应考虑RA的种族差异(山本、冈田、铃木和高知,2015年)另一个纳入标准是种族背景;只包括白人。
排除标准为研究前3个月服用抗生素、任何类型的/或牙周治疗(例如洁治和牙根规划和/或牙周手术)。此外,排除了医学诊断为糖尿病或其他影响免疫系统的严重系统性疾病的患者(RA组中的RA除外)。此外,孕妇和哺乳期妇女未被纳入研究。
2.3. 数据和样本收集
记录人口统计学(性别、年龄、吸烟状况以及病史)和牙周临床数据。临床数据包括牙周筛查和记录指数(PSR)(Lo Frisco、Cutler和Bramson,1993年)患者被问及牙齿缺失的原因。此外,记录RA患者的DAS-CRP评分。
在同一次就诊时,将约2毫升外周血加入EDTA容器中。通过涂抹25µl 0.9%NaCl溶液收集牙龈沟液,并在4个位置的每个袋中抽吸两次,最后通过将无菌纸尖插入用于取样龈沟液体的相同袋中20 s来取样生物膜。将每个患者的样本合并。
2.5. 统计分析
使用软件SPSS®Statistics 24(美国纽约州纽约市IBM Corporation)进行统计分析。临床数据与ANOVA进行比较,然后进行事后Bonferroni测试。组间比较的非参数检验(分别为Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U检验)用于实验室数据的连续变量。相关分析采用Spearman检验。太极2-该测试比较了两分变量和McNemar-Bowker测试分类变量。
α≤0.05的水平被认为是显著的。所有统计测试的分析单位都是个人。
2.6. 最小化偏差的方法
样品分析在伯尔尼微生物实验室进行编码。调查人员不知道这些样本属于哪一组。
3.结果
3.1.QC表示为牙龈假单胞菌
在两个分析菌株中检测到mRNA表达。第一次表达较低,但在培养24小时后,其与草地(). 在培养上清中,在Western blot中未发现PgQC阳性信号(数据未显示)。使用高浓度的细菌,从培养1小时起就可以看到信号(). 冷冻断裂复制免疫标记(FRIL)电子显微镜显示了PgQC在细菌细胞中的位置。酶诱导金颗粒主要出现在膜破裂面,朝向周质空间。可以假设是细胞外分泌物,一些指示金颗粒的酶成群地放置在外膜的外破裂面和细胞外().
细菌谷氨酰胺环化酶(A:mRNA;B:蛋白质)在牙龈假单胞菌ATCC 33277和牙龈假单胞菌J430–厌氧培养1小时、2小时、4小时和24小时后培养1个
细菌谷氨酰胺环化酶的可视化牙龈假单胞菌ATCC 33277(A-C)和牙龈假单胞菌厌氧培养24小时后的J430-1(D)细菌细胞和冷冻断裂复制免疫标记(FRIL)电子显微镜。谷氨酰胺环化酶指示的金颗粒主要分布在面向细菌周质的膜破裂面(箭头)处,一些金颗粒也分布在外膜外破裂面和细胞外(箭头)。
OMo:外膜外破裂面(凹面,许多膜内小颗粒);OMp:外膜周质断裂面(膜内凸起少量颗粒);CMp:细胞质膜,周质破裂面(凹面,膜内颗粒少),CMc:细胞质薄膜,细胞质破裂面。棒材:100 nm
3.2. 人口统计学和牙周临床数据
研究包括30名患者(RA、CP和健康组各10名)。人口统计数据和牙周参数见研究时,RA患者的病程为11.2年(范围2–22年),DAS-CRP平均得分为2.43(范围1.1–3.9),所有患者均接受了抗炎治疗。与牙周炎组相比,对照组和RA组的吸烟者更少。RA患者的牙齿数量(20.6±6.4)明显少于健康对照组(28±0)和牙周炎患者(27.1±3)(p=0.001)。RA和牙周炎患者的牙齿脱落原因主要是牙周炎。与其他两组相比,牙周炎患者PD≥5 mm(51.2±39.8)的部位明显增多(p<0.001),PSR评分较高(3.80±0.23)().
表1。
变量 | 无线电高度表 | 牙周炎 | 控制 | P(P) |
---|
(n=10) | (n=10) | (n=10) |
---|
年龄(平均值±标准偏差) | 62.8±12.4 | 57.6±11.1 | 37.7±8.1 | <0.001 |
性别男/女 | 2/8 | 4/6 | 7/3 | 0.0610 |
吸烟者(否/是/曾吸烟者) | 8 / 1 / 1 | 4 / 6 / 0 | 9 / 1 / 0 | 0.0361 |
#齿数(平均值±SD) | 20.6±6.4 | 27.1±3.0 | 28±0 | 0.001 |
#PD≥5 mm的部位(平均值±SD) | 0.45±0.93 | 51.2±39.8 | 0±0 | <0.001 |
平均PSR(平均值±SD) | 2.29±0.40 | 3.80±0.23 | 1.72±0.42 | <0.001 |
3.3. 龈下生物膜中的细菌计数
牙龈假单胞菌和牙密螺旋体在RA中,10个样本中有5个样本的A.放线菌().
表2。
龈下生物膜样本中细菌的流行情况
(阳性结果总数(计数≥10的样本5)/分析样品总数)
| 无线电高度表 | 牙周炎 | 控制 | McNemar-Bowker试验 P(P) |
---|
牙龈卟啉单胞菌 | 3 (1) / 10 | 10 (6) / 10 | 0 (0) / 10 | 0.018 |
连翘 | 8 (6) / 10 | 10 (9) / 10 | 2 (1) / 10 | 不另说明。 |
牙密螺旋体 | 4 (2) / 10 | 9 (5) / 10 | 0 (0) / 10 | 0.026 |
中间P.intermedia | 7 (1) / 10 | 9 (3) / 10 | 1(0)/10 | 不另说明。 |
A.放线菌 | 5 (1) / 10 | 4 (3) / 10 | 1 (0) / 10 | 0.028 |
3.4. GCF中选定炎症标记物的水平
当分析炎症生物标志物的GCF水平时,各组间IL-1β水平存在显著差异(p=0.003)。具体而言,RA患者的GCF中IL-1β水平高于健康对照组(p=0.003)。尽管RA组MCP-3水平明显高于健康对照组(p=0.157),但各组之间MCP-1和MCP-3的水平没有显著差异(). 此外,与阳性样品相比,QC和isoQC阴性样品中的MCP-1和MCP-3水平升高,但差异无统计学意义(数据未显示)。
类风湿关节炎(RA)、牙周炎(n=10)和健康对照(n=100)患者龈沟液中白细胞介素-1β(A)、趋化蛋白(CMP)-1(B)和CMP-3(C)的水平
3.5. 人QC和isoQC的表达
EDTA血中QC-mRNA表达的定性分析()显示QC和isoQC阳性血样的可比比例(分别为p=0.371和p=0.866)。从数量上看,各组之间存在显著差异(p=0.007)。进一步分析显示,与CP患者(p=0.003)和健康对照组(p=0.013)相比,RA患者QC的mRNA表达增加(). 同一样本中isoQC-mRNA的表达没有达到统计学意义,但显示出类似的倾向,有利于RA EDTA血样().
与健康对照组相关的类风湿关节炎(RA,n=10)、牙周炎(n=10
mRNA表达始终与健康对照组相关。该组GAPDH(参考基因)相关值的中位数设置为1。
表3。
EDTA血液和龈沟液中人谷氨酰胺和异谷氨酰胺环化酶mRNA表达阳性结果(n/总数)
材料 | 基因 | 无线电高度表 | 牙周炎 | 控制 | X(X)2P(P) |
---|
EDTA血液 | 质量控制 | 9/9 | 8/9 | 8/10 | 0.371 |
EDTA血液 | isoQC公司 | 6/9 | 7/9 | 7/10 | 0.866 |
EDTA血液 | GAPDH公司 | 9/9 | 9/9 | 10/10 | |
全球合作框架 | 质量控制 | 2010年4月 | 1/10 | 0/10 | 0.044* |
全球合作框架 | isoQC公司 | 2/10 | 1/10 | 0/10 | 0.329 |
全球合作框架 | GAPDH公司 | 10/10 | 6/10 | 7/10 | 0.089 |
30份分析的GCF样本中,有5份QC表达阳性,而isoQC表达仅在3份样本中检测到。除一份样本外,所有QC阳性样本均来自RA患者。两组间QC差异显著(p=0.044)。RA患者的所有GCF样本,但并非所有CP和健康对照组的GCF样本均为参考对照基因GAPDH阳性。
mRNA QC在血液中的表达与GCF中的表达呈正相关(R=0.418;p=0.024);另一方面,仅分析RA患者,相关因素为R=0.642(p=0.045)。由于GCF中的阳性读数较少,因此isoQC不相关。
3.6.的表达式牙龈假单胞菌龈下生物膜中的质控
在13个生物膜样本中,有8个样本的牙龈假单胞菌,检测PgQC表达。这些样本中的表达中位数为0.442,最大值为38.13,与草地表达为看家基因。在任何情况下,通过Western blotting检测GCF中的蛋白质都失败。
对五个被阴性检测PgQC mRNA表达的样本进行PgQC的DNA分析。未获得阳性结果。
4.讨论
本研究的重点是细菌和两种人类谷氨酰胺环化酶与牙周病和类风湿关节炎的关系。虽然不是主要关注点,但很明显,RA患者的牙齿数量较少,PD≥5 mm的部位少于CP患者。较低的牙齿数量与其他一些研究一致(Ishi Ede、Bertolo、Rossa、Kirkwood和Onofre,2008年;Schmickler等人,2017年;山川等人,2002年). 但与我们相反,RA中报告了大量病理性PD增高的部位(Schmickler等人,2017). 我们研究中的RA患者已经接受了几年的抗风湿药物(DMARDs)治疗,这可能会影响临床牙周指数。例如用肿瘤坏死因子α抑制剂治疗RA对牙龈炎和牙周病有良好的疗效(小林、横山由纪夫等人,2014年). 另一方面,这些患者的总体口腔健康意识很高,大多数患者都参加了定期的支持性护理计划。
在这项初步研究中,关于RA中谷氨酰胺环化酶的唯一报告(Batliwalla等人,2005年)证实:RA患者EDTA血液中QC的表达高于其他组。在GCF中,主要RA患者的样本QC或isoQC的表达均呈阳性。对通过非侵入性方法获得的GCF洗涤液进行分析。使用牙周组织活检,细胞计数可能会更高,并且会显示更多的阳性结果,并有可能进行定量。此外,开发一种能够测量GCF中QC和isoQC蛋白水平的方法可能很有意义。A血中QC的mRNA表达与GCF中QC的表达相关,但总体而言,样本量较小,且两组样本中的mRNA QC定量表达排除了对全身炎症和局部炎症之间的相关性进行更详细分析的可能性。然而,可以假设这种关联。
由于QC和isoQC稳定了体内MCP-1和MCP-3的水平(Chen等人,2012年;Cynis等人,2011年),测定了这些分子的水平。在QC或isoQC阳性的样品中,MCP-1和MCP-3的水平有高于QC和isoQC阴性样品的趋势。在阳性样本中,IL-1β水平显著升高(p=0.007),即使在RA组也有明显的趋势。众所周知,IL-1β是受刺激单核细胞或巨噬细胞的产物(Krakauer,1986年). 阻断其活性可消除非感染性炎症(迪纳雷洛,2011年). 在牙周炎中,IL-1β是研究最深入的细胞因子之一。它的表达由与牙周病相关的细菌诱导,然后这种细胞因子驱动炎症介质和破坏性酶的分泌(普雷肖和泰勒,2011年). 最近,有报道称,IL-1β刺激内皮细胞可增加QC及其底物MCP-1和CX3CL1的表达,而N末端修饰的pGlu-CX3CL1诱导的炎症反应比未成熟的谷氨酸变体更强(Kehlen等人,2017年). 如果进一步研究证实QC或isoQC在RA患者牙周炎发病机制中的潜在作用,局部阻断QC和isoQC活性可能是牙周治疗中一种有趣的方法。目前,主要关注的是用于治疗阿尔茨海默病的QC抑制剂的开发(霍夫曼等人,2017年). 抑制剂基于咪唑结构(Buchholz等人。,2006)还有类黄酮(Li等人,2016年)或微藻的天然产物(Hielscher-Michael等人,2016年)代表潜在候选人。
第一个细菌质控已在牛链球菌在能源生产中发挥重要作用(Cook&Russell,1993年). 在这项研究中,重点是牙龈假单胞菌质量控制。牙龈假单胞菌在所有CP患者中检测到,但只有三名RA患者。与其他报告相比,这种低流行率(Schmickler等人,2017年)包括我们的(Laugisch等人,2016年)这可能与这项试点研究的参与者人数较少有关。收集GCF后的生物膜取样可能会影响生物膜样品中的细菌计数,这是我们方法的局限性。这排除了计算牙龈假单胞菌QC表达和RA。13个阳性中的5个。牙龈对样品进行QC阴性检测,其中两个(一个CP,一个RA)计数≥106
牙龈息肉龈下的具有生物膜。需要对更多的研究人群进行分析,以确定是否与牙周病活动有关。
使用两个牙龈卟啉单胞菌菌株表现出QC的表达,在稳定生长期似乎有所增加。该酶在浓缩细菌沉积物中可检测到,但在培养上清液和GCF样品中未检测到。这表明该酶主要位于细菌细胞中,不会释放到环境中。最近关于的更详细数据。牙龈QC已发布(Bochtler等人,2018年). 使用细胞提取物的几个组分,QC活性和QC的存在(通过组分的Western blotting测定)仅局限于内膜(Bochtler等人,2018年). 我们的FRIL电子显微镜照片证实了酶在周质中的位置。
人们对PgQC的重要性知之甚少。周质中的分组位置表明,在通过周质易位运输或修饰分子中发挥作用。例如。银杏蛋白酶通过IX型分泌系统(T9SS)通过外膜从周质转运,在那里发生酶的修饰(de Diego等人,2016年). 前面提到的最近的报告(Bochtler等人,2018年)在27种蛋白质中发现了N-末端pGlu,推测PgQC焦谷氨酸盐是由牙龈假单胞菌。所有这些带有N末端pGlu的蛋白质都是信号肽酶I的假定底物,信号肽酶是一种催化蛋白质从膜上释放的酶。然而,当使用不同的牙龈假单胞菌W83突变体(Bochtler等人,2018年). 的确切功能牙龈卟啉单胞菌质量控制应该是进一步研究的主题。
总之,人类谷氨酰胺环化酶可能在RA患者保持炎症和牙周组织破坏中发挥作用。需要更多的研究来验证人类谷氨酰胺环化酶是否可能是延缓这些患者牙周病进展的靶点。至于PgQC,进一步的研究应该明确这种酶作为生物膜形成和调节免疫反应的潜在毒力因子的重要性。此外,牙龈假单胞菌应在更大的研究组中分析与疾病临床参数相关的QC活动。在这里,开发一种更灵敏的蛋白质检测方法似乎很重要。所有这些分析可能有助于回答以下问题:牙龈假单胞菌QC可能是牙周病治疗的另一种辅助疗法。
致谢
我们感谢Fabiola Costanzo、Anna Magdon en和Ekaterina Volkova(伯尔尼大学牙周病学系口腔微生物学实验室)提供的技术援助。
基金:
本研究由欧盟委员会的拨款资助(FP7-HEALTH-F3–2012-306029“触发器”)。JP得到NIH NIDCR拨款DE 022597的支持。
词汇表
人物配对关系 | 慢性牙周炎 |
全球合作框架 | 龈沟液 |
伊利诺伊州 | 白细胞介素 |
isoQC公司 | 人谷氨酰胺环化酶 |
千克/加仑 | 牙龈卟啉单胞菌赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 |
MCP公司 | 单核细胞趋化蛋白 |
焦谷氨酸 | 焦谷氨酸 |
PgQC公司 | 牙龈卟啉单胞菌环化酶 |
PSR公司 | 牙周筛查和记录指数 |
质量控制 | 人谷氨酰胺环化酶 |
风险评估: | 类风湿关节炎 |
RgpA和RgpB | 牙龈卟啉单胞菌精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶A和B |
脚注
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