胶质母细胞瘤相关免疫细胞的放射基因组分析揭示CD49d表达与MRI参数和预后的相关性

GBM中免疫细胞RNA的表达水平

图中总结了每个患者中CD11b、CD68、CSF1R、CD163、CD33、CD123、CD83、CD63、CD49d、CD117、CD4、CD3e、CD25和CD8的标准化表达水平1我们发现髓系免疫细胞标记物比淋巴系标记物更占优势。在髓系免疫细胞标记物中，CD163、CD63、CD83和CD49d的RNA表达水平超过10%。

在单独的窗口中打开

图1

说明每个患者的年龄、性别、肿瘤位置、遗传信息和免疫细胞标记物的标准化RNA表达水平。

TAM和T细胞标记物与nCBV、ADC、体积和坏死值相关

我们进行了皮尔逊相关分析，以确定免疫细胞标记物和MRI参数之间的关联，图2安培，补充图¹和表2总结相关性。根据FLAIR和CE T1WI的感兴趣区域（ROI），CD68、CSF1R、CD33和CD4的表达水平与nCBV值均呈显著正相关，而CD11b的表达水平仅与CE T1W的nCBV数值呈显著正相关性（图2B型; 案例1和案例2）。我们发现，FLAIR和CE T1WI中CD49d和CD3e的表达水平与ADC值之间存在显著的负相关，CD33和CD123以及CD25的表达水平分别与FLAIR和CET1WI的ADC值呈负相关（图2B型; 案例3和案例4）。基于FLAIR或CE T1WI的肿瘤体积与CD123、CD49d和CD117的表达水平呈显著负相关，但没有免疫细胞标记物与肿瘤坏死或坏死率呈显著相关。

在单独的窗口中打开

图2

MRI参数与免疫细胞标记物的相关性说明(一个)，以及具有代表性的案例(B类). (一个)病例1和病例2分别显示CD68、CSF1R、CD33和CD4的高表达和低表达，与nCBV值显著相关。在病例3和病例4中，CD33、CD123、CD49d和CD3e的高表达和低表达水平与ADC值显著相关。

患者人数

2012年8月至2015年12月，我们连续招募了258名最初在我们机构被诊断患有GBM的患者。纳入标准如下：患者（a）根据世界卫生组织2016年标准，组织病理学诊断为GBM，无其他细胞成分；（b） 接受常规扩散加权成像（DWI）和DSC灌注MR成像24-48 手术前小时；（c） 在我院脑肿瘤库中有可用的肿瘤样本；和（d）接受了标准治疗，包括近全切除术、同步放化疗（CCRT）和辅助替莫唑胺药物治疗。根据这些纳入标准，我们的研究纳入了60名患者。本研究中使用的所有肿瘤样本在手术期间尽快在液氮中进行snap冷冻，并储存在−80 摄氏度。

RNA分离和实时PCR

根据制造商的说明，使用QIAquick RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）分离每个组织样品的总RNA，并使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技）验证RNA的质量。使用RevertAid H Minus逆转录酶（Thermo）进行逆转录。简单地说，逆转录是在100卷中进行的 2.0μl μg RNA，15 寡脱氧胸腺嘧啶引物的pmol，20 µl 5μRT缓冲液和20 μl，每个2.5 mM dNTP混合物、核糖核酸酶抑制剂和逆转录酶。RT条件如下：10 65分钟 摄氏度，60 42分钟 摄氏度，10 25分钟 °C和10 70分钟 摄氏度。

根据制造商的说明，使用Rotor-Genes SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）在Rotor-Genes Q循环机（Qiangen）中进行实时PCR，总体积为20 µl。免疫细胞标记物和GAPDH的循环条件为10 95分钟 °C，40次循环10次 95秒 摄氏度，15 最佳Tm下的秒数，以及20 72秒 摄氏度。引物序列如下：

CD11b；5′-caactatggaatgtcctaagct-3′/5'-tgtccagtcgctcttctcttct-3′，CSF1R；5′-tttggggctagacagactgg-3′/5′-cctgactgagtgtgtgctg-3′，CD123；5′-ggggg tctgcctcaatct-3′/5′-cacacccgtagagatatgtc-3′，CD33；5′-tttaacacccacacaggcaat-3′/5′-gcacacagatttgatcacaga-3′，CD3e；5′-tcctaccaaccctatac-3′/5′-tacggagatgcaataccata-3′，CD25；5′-agtttcaggtccaga-3′/5′-ggggagagtgcagag-3′，CD8；5′-ctgcctctgctcaactagc-3′/5′-gaagtgcatgttggacag-3′，CD68；5′-aaagttcctgccccagt-3′/5′-gcagaagcaataagcacca-3′，CD163；5′-tgagcacatgaaaggaa-3′/5′-gctccatcaatagtccagtc-3′，CD83；5′-caggtccaggtcttctt-3′/5′-cttcgtgaagtctctcc-3′，CD63；5′-ttttgtcgaggtgaat-3′/5′-cagatgaggtgaggag-3′，CD49d；5′-tacaagaatgcgtgcag-3′/5′-gagcatcaacttcccttgg-3′，CD117；5′-ccagaagctccataggtgg-3′/5′-agtgcttaaggtggaa-3′，CD4；5′-ggctctcaccagtgtagt-3′/5′-cctctgctcgtaaa-3′和GAPDH；5′-ggcatgctcaatgacaa-3′/5′-atgtagccatgcaca-3′。生成标准曲线，并在每次分析中运行非模板对照，以将扩增图中的阈值（Ct）与拷贝数相关联。所有样品一式两份，并使用平均值。

我们通过每个患者中最高表达的标记物对免疫细胞标记物进行标准化。

MRI协议

所有患者均使用3 T扫描仪（Verio；Siemens Healthcare Sector），带有32通道磁头线圈。常规MRI包括T1加权成像（T1WI），如横向自旋回波成像，增强前后或多平面重建横向、冠状面成像，在增强前后使用矢状面三维磁化制备的快速采集梯度回波（3D-MPRAGE）序列，以及使用涡轮自旋回波序列和FLAIR图像的横向T2加权成像（T2WI）。静脉注射浓度为0.1的gadobutrol（Gadovist®，Bayer Schering Pharma）后获得对比增强型（CE）T1WI mmol/kg体重。横向自旋回波T1加权成像通过以下参数获得：重复时间（TR），558 毫秒；回波时间（TE），9.8 毫秒；翻转角（FA），70°；矩阵，384 × 187; 视野（FOV），175 × 220 毫米；截面厚度，5 毫米；和激发次数（NEX），1。我们使用以下参数获得了3D-MPRAGE序列：TR，1500 毫秒；TE，1.9 毫秒；FA，9°；矩阵，256× 232; 视野，220 × 250; 截面厚度，1 毫米；和NEX，1。横向T2加权成像参数如下：TR，5160 毫秒；TE，91岁 毫秒；FA，124-130°；矩阵，640 × 510–580; 视野，175-199 × 220; 截面厚度，5 毫米；和NEX，3。横向FLAIR的参数为TR 9000 毫秒，TE为97 毫秒，TI为2500 ms，FA为130°，矩阵为384 × 348，视野199 × 220，截面厚度为5 mm，NEX为1。

在注射b值分别为0和1000的对比剂之前，采用单次激发、自旋回波、轴平面回波成像（EPI）序列进行DWI检查 秒/毫米²，TR为6300 毫秒，TE为92 ms，FA为180°，矩阵为240 × 240，视野240 × 240，截面厚度为3 mm，NEX为3。在三个正交方向上获取DWI，并将其合并为轨迹图像。ADC图是在逐个体素的基础上使用软件计算的，该软件使用这些数据集成到MRI单元中。

静脉注射浓度为0.1的钆丁醇期间，通过单次激发、梯度回波、回波序列获得横向DSC灌注MRI mmol/kg体重，速率为4 ml/秒，使用电动注射器（Spectris；Medrad）。随后以相同的注射速率进行30ml生理盐水的大剂量注射。对于每个截面，以等于TR的间隔采集60张图像。参数如下：TR，1500 毫秒；TE，30岁 毫秒；FA，90°；矩阵，128 × 128; 截面厚度，5 毫米；交叉间隙，1 毫米；视野，240 × 240 毫米；截面，15-20；体素大小，1.875 × 1.875 × 5 毫米^三; 像素带宽，1563 赫兹；和总采集时间，1 第30分钟 秒。

图像后处理和数据分析

将常规MR图像、ADC图和DSC PWI从图像存档和通信系统工作站数字传输到个人计算机进行进一步分析。相对CBV（rCBV）是通过专用软件包（nordicICE；Nordic Imaging Lab，Bergen，Norway）获得的，该软件包将已建立的示踪动力学模型应用于首次通过数据^49，50首先，在动态扫描过程中进行重新校准，以最小化患者的运动。伽马-变量函数用于拟合1/T2*曲线，以减少再循环的影响，该函数近似于无再循环时出现的一次通过响应。为了减少造影剂泄漏影响，使用专用软件上的泄漏校正软件包对动态曲线进行数学校正⁵¹在消除造影剂的再循环和渗漏后，通过曲线的数值积分计算rCBV。为了最小化单个患者rCBV的方差，通过将特定节段中的每个rCBV值除以未受影响白质中的rCBV，对基于像素的rCBW图进行标准化，最后生成标准化rCBV（nCBV）图⁵².

使用专用软件包（nordicICE），根据存储在各自数据集中的几何信息，在结构图像（例如FLAIR图像和CE T1WI）与nCBV和ADC图之间进行联合注册。基于底层结构图像，通过重新分割和联合配准，自动校正图像之间的层厚差异。nCBV和ADC图在FLAIR图像和CE T1WI上显示为彩色叠加。

一位对临床数据一无所知的神经放射科医生（拥有16年脑部MR成像经验的S.H.C.）绘制了多边形ROI，其中包含共同注册图像的每个部分中的整个增强病变。CE T1WI上明显的坏死、出血或非肿瘤宏观血管区域不包括在ROI中。然后，T2高SI病灶的ROI，无论增强程度如何，也在每个横向FLAIR图像上定义，避免出现囊性和坏死区域以及大血管。由于ROI定位是在与结构图像共同注册的nCBV和ADC图上进行的，因此可以确定病灶的边缘。计算造影增强病灶、T2高SI病灶和坏死的整体体积，即FLAIR图像上肿块内CE T1WI上未增强的低信号区域。

根据CE T1WI和FLAIR图像，使用北欧ICE对每个截面获得的数据进行汇总，得出整个肿瘤范围的逐体ADC和nCBV。用ADC和nCBV在各自的x轴上绘制ADC和nCBV直方图，面元大小为3 × 10⁻⁵ 毫米²/sec和0.1，而y轴表示为总病变体积的百分比，方法是将每个箱子中的频率除以分析的体素总数。为了进行进一步的定量分析，在y轴上绘制了直到指定仓的所有仓中的累积观测次数，作为累积直方图中的百分比。导出ADC的第5个百分位点（5%ADC）和nCBV的第95个百分位点（95%nCBV）（第X个百分位点是形成直方图的体素值的X%位于直方图左侧的点）^53，54.

免疫组织化学染色

用于IHC分析的抗体包括小鼠抗人整合素α4（CD49d）抗体（sc-365209，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和兔抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（ab7260，abcam）。石蜡切片（4 μm）进行脱蜡和复水，将切片置于表位回收溶液中，在微波中进行抗原回收（0.01 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0）20 分钟，然后在3%过氧化氢中培养20分钟 室温下的最小值。然后用3%BSA封闭石蜡切片30 min，用抗体染色1 室温下1小时，用洗涤缓冲液（S3006，Dako）洗涤并用二级抗体（A-11008，Alexa Fluor 488，Invitrogen）染色^TM（TM）; A-11032，Alexa Fluor 594，Invitrogen公司^TM（TM）)对于30 室温下的最小值。DAPI染色细胞核。

本研究得到了韩国卫生、福利和家庭事务部保健技术研发项目（HI16C1111）的资助，以及大脑研究计划通过韩国国家研究基金会（NRF）通过科学、信息通信技术和未来规划部资助的资助（2016M3C7A1914002），首尔国立大学（SNU）的创新研究人员计划和项目代码（IBS-R006-D1）。