神经化学研究。2018; 43(10): 1897–1904.
TLR2配体Pam3CSK4通过MAPK/NF-κB信号通路调节原代脑微血管内皮细胞MMP-2/9的表达
,1,2,三，4 ,5 ,6 ,7和
7 朱红艳
1昆明科技大学环境科学与工程学院，昆明，650093
2中国云南省昆明市昆明科技大学附属医院临床实验室，邮编650031
三云南省第一人民医院临床检验科，昆明，650031中国云南省
4昆明理工大学医学院，昆明，650093
戴荣荣
5中国云南省昆明市昆明医科大学第一附属医院临床实验室，邮编650034
周友泉
6中国云南省昆明市昆明医科大学附属第三医院临床实验室，650118
郝福
7中国云南省昆明市第一人民医院神经内科，邮编：650031
强蒙（Qiang Meng）
7中国云南省昆明市第一人民医院神经内科，邮编：650031
1昆明科技大学环境科学与工程学院，昆明，650093
2中国云南省昆明市昆明科技大学附属医院临床实验室，650031
三中国云南省昆明市第一人民医院临床检验科，邮编：650031
4昆明理工大学医学院，昆明，650093
5昆明医科大学第一附属医院临床检验科，昆明，650034中国云南省
6中国云南省昆明市昆明医科大学附属第三医院临床实验室，650118
7中国云南省昆明市第一人民医院神经内科，邮编：650031
通讯作者。 2018年2月5日收到；2018年5月23日修订；2018年8月2日接受。
摘要
血脑屏障（BBB）破坏与多种神经疾病有关。脑微血管内皮细胞（BMEC）是血脑屏障的关键组成部分。基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/9）和类toll受体-2（TLR2）在BMEC中共存，并在BBB分解中发挥重要作用。目前尚不清楚TLR2是否能调节BMEC中的MMP-2/9。本研究使用Pam3CSK4激活TLR2，并通过实时定量PCR和western blotting检测BBB中MMP-2/9和紧密连接（TJs）的表达。用蛋白质印迹法测定磷蛋白。使用丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和NF-κB抑制剂来确定TLR2调节BMEC中MMP-2/9表达的信号通路。本研究表明，Pam3CSK4上调了BMEC中MMP-9的mRNA和蛋白表达，同时下调了MMP-2和TJ的表达。Pam3CSK4还诱导了BMEC中MAPK和NF-κB信号通路的磷酸化。经ERK1/2和JNK抑制剂预处理后，MMP-9表达降低，但p38未降低。然而，添加NF-κB抑制剂后，MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达增加。我们的结果表明，Pam3CSK4能够通过ERK1/2和JNK信号通路上调MMP-9的表达，但NF-κB信号通路负调控TLR2对BMEC中MMP-2和MMP-9表达的影响。该发现为MMP-2/9在BMEC中表达的分子机制提供了新的见解。
关键词：Toll样受体-2、基质金属蛋白酶、Pam3CSK4、丝裂原活化蛋白激酶、脑微血管内皮细胞
介绍
Toll样受体（TLRs）是一种跨膜模式识别受体（PRRs），不仅参与全身细菌感染，还参与脑损伤[1]. TLR在哺乳动物天然免疫细胞和非免疫细胞中表达，如上皮细胞和内皮细胞[1]. 中枢神经系统（CNS）中几乎所有类型的细胞，包括小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞[2]和内皮细胞[三]，表示TLR。目前已知13只小鼠和10只人类TLR[4,5]. TLR2是一种在细胞表面表达的TLR[2]. 先前的一项研究表明，在小鼠脑缺血模型中TLR2的mRNA表达上调[6]. 与野生型小鼠相比，脑局灶性缺血损伤后TLR2缺陷小鼠的梗死面积减少[6].
血–脑屏障（BBB）在维持中枢神经系统微环境的稳态中起着关键作用。BBB由脑微血管内皮细胞（BMEC）形成，由紧密连接（TJ）和粘附连接（AJ）连接[7]. 内皮细胞之间的TJ和AJ维持BBB的完整性[三]. 血脑屏障破坏与一系列中枢神经系统疾病有关，如多发性硬化症[7]缺氧和缺血[8].
基质金属蛋白酶（MMPs）是一个锌依赖性酶家族，通过降解内皮细胞（EC）的TJs来破坏血脑屏障的完整性[9]. MMP-2/9降解脑血管周围基底层的主要成分，包括IV型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白[9]. 最近的报告表明，MMP-2/9和TLR2[三]以BMEC表示。TLR2可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路[三]. 其他研究表明MMPs受MAPK信号通路调节[10]. 然而，以前还没有研究过这种分子机制。我们推测TLR2激活可能通过MAPK和NF-κB信号通路诱导BMEC中MMP-2/9的表达，从而导致BBB的破坏。因此，我们使用TLR2合成类似配体Pam三胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸4（Pam3CSK4）激活TLR2，并探讨Pam3CSK4是否以及如何调节BMEC中MMP-2/9的表达。
材料和方法
试剂
TLR2激动剂Pam3CSK4购自InvivoGen（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。U0126（ERK1/2抑制剂）购自Cell Signaling Technology（美国马萨诸塞州贝弗利）。SB203580（p38 MAPK抑制剂）、SP600125（JNK抑制剂）和BAY11-7082（NF-κB抑制剂）购自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥，美国）。
对于western blot分析，抗TLR2（目录ab108998；1:1000）、抗MMP-9（目录ab76003；1:1000。Anti-claudin 5（目录号ABT45；1:1000）和anticolagen IV（目录号ab6586；1:2000）分别从默克Millipore（美国马萨诸塞州Billerica）和Abcam（中国上海）购买。Anti-ZO-1（目录61-7300；1:4000）从Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买。β-actin来自Proteintech（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。抗磷酸化ERK1/2（目录号4377）、pJNK（目录号4668）、pP38 MAPK（目录编号4511）和pNF-κB p65（目录号3033）的抗体购自Cell Signaling Technology。
原代脑微血管内皮细胞（BMEC）培养
所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经中国昆明理工大学动物护理委员会批准。BMEC培养自先前发表的Sprague–Dawley新生大鼠大脑皮层[11]. 内皮细胞在含有20%胎牛血清（FBS）的DMEM/高糖中培养24 h，并用4µg/mL嘌呤霉素进行筛选（美国俄亥俄州Amresco）。用von Willebrand因子（vWF，1:50，Proteintech，Rosemont，IL，USA）通过免疫荧光染色鉴定BMEC。
定量实时聚合酶链反应
使用Eastep™Total RNA Extraction Kit（中国上海Promega）从BMEC中分离出总RNA。通过NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量分离RNA的质量和数量。根据制造商的协议，使用GoScript™逆转录系统（Promega）合成第一链cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus，Takara，Dalian，China）在Roche LightCycler 480上对1 uL cDNA产物进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）。
底漆β-actin、MMP-2和MMP-9大鼠引物设计如下：
β-肌动蛋白（正向：5′-GGAGATTACTGCCTGGCTCCTA-3′，反向：5′-GACTCATCGTACTGCTTGCTG-3′）；
MMP-2（正向：5′-ACCTTGACCAGACACACACATCGAG-3′，反向：5′-CAGGGTCCAGTGTGTA-3′）；
MMP-9（正向：5′-CATGCGCTGGGCTTAGATCA-3′，反向：5′-GAGGCTCTGGGTCAGGTTTAGAG-3′）。PCR条件为：一个周期的初始变性（95℃30 s）、40个周期的扩增（40个周期95℃5 s、55℃30 s、72℃30s）和一个周期扩增曲线分析（95℃5s、60℃60s、95℃）。每个反应重复三次。比较mRNA表达水平表示为2-ΔΔCt。
Western Blot分析
用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Calbiochem，加州圣地亚哥，美国）和PhosSTOP（Roche Applied Science，伊利诺伊州罗克福德，美国）的RIPA裂解缓冲液（Beyotime Biotechnology，中国上海）收集细胞裂解产物。上清液中的蛋白质浓度通过双钦尼克酸（BCA）分析（Beyotime Biotechnology）进行检测。蛋白质通过蛋白质印迹分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（Merck Millipore）上，然后用含有0.1%吐温20和5%（w/v）脱脂乳的Tris缓冲盐水（TBS；Sangon Biotech，中国上海）封闭。将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体（1:5000，Proteintech）孵育2小时。抗体稀释率为：TLR2抗体（1:1000）、MMP-9抗体（1:100）、MMP2抗体（1:11000）、闭塞素抗体（1:12000）、克劳丁5抗体（1:10000）、IV型胶原抗体（1:2000）、ZO-1抗体（1:4000）、β-肌动蛋白抗体（1:5000）、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38和p-NF-κB p65抗体（1:1000。使用增强化学发光（Proteintech）对带状物进行可视化，并使用膜成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行拍照。使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达NIH）半定量测量带强度。
统计分析
结果表示为平均值 ± 标准误差（SE）。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行最小显著性差异检验。第页 ≤ 0.05被认为具有统计学意义。
结果
Pam3CSK4上调BMEC中MMP-9的表达但下调MMP-2的表达
据报道，BMEC可以表达两种MMPs[12]和TLR2[三]. 为了研究TLR2激活对BMEC中MMP-2/9的影响，我们用1µg/mL Pam3CSK4处理细胞1、2、3、6和24小时。MMP-9的mRNA和蛋白表达分别在3和6小时增加(第页 < 0.05，图b、 d）。MMP-2 mRNA水平在第1、2和3小时显著降低(第页 < 0.05，图a） ●●●●。然而，MMP-2蛋白水平在2小时后下降(第页 < 0.05，图c） 。
Pam3CSK4刺激的BMEC中MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达水平。用Pam3CSK4（1µg/mL）刺激BMEC 1、2、3、6和24小时。MMP-2的mRNA表达水平(一)，基质金属蛋白酶-9(b条)用qRT-PCR分析β-actin。收集细胞用于检测MMP-2(c（c）)和MMP-9(d日)蛋白质表达采用western blot，蛋白质水平采用ImageJ软件定量，并用β-肌动蛋白水平进行标准化*第页 < 0.05, **第页 < 与用PBS处理细胞的对照组相比，0.001
Pam3CSK4下调BMEC中TJ的表达
基质金属蛋白酶降解BMEC中的TJ蛋白（如克劳丁5和闭塞素）和基底膜蛋白（如层粘连蛋白和胶原），导致BBB的破坏[13,14]. 为了观察TLR2刺激是否能破坏BMEC中的TJ，加入TLR2激动剂Pam3CSK4后，用western blot法测定克劳丁5、闭塞素、ZO-1和IV型胶原蛋白水平。发现claudin 5的水平（图a） 和IV型胶原蛋白（图c） 2小时后，ZO-1水平下降（图d） 经Pam3CSK4治疗后，BMEC在3小时时下降（全部第页 < 0.05）。然而，闭塞素水平没有改变（图b） ●●●●。
Pam3CSK4刺激的BMEC中TJ的蛋白表达水平。用Pam3CSK4（1µg/mL）刺激BMEC 1、2、3、6和24小时。收集细胞检测克劳丁5(一)，闭塞素(b条)，IV型胶原蛋白(c（c）)和ZO-1(d日)蛋白质表达采用western blot，蛋白质水平采用ImageJ软件定量，并用β-肌动蛋白水平进行标准化*第页 < 0.05, **第页 < 与用PBS处理细胞的对照组相比，0.001
Pam3CSK4诱导BMEC中MAPK和NF-κB磷酸化
在用1μg/mL Pam3CSK4处理BMEC 1、2、3、6和24小时后，我们通过western blotting检测MAPK和NF-κB磷酸化。ERK1/2的磷酸化（图a） ，JNK（图c） 和第38页（图b） 1小时检测到MAPK(第页 < 0.05）。ERK1/2和JNK的磷酸化倾向于持续3小时，尽管在2小时和3小时没有统计学意义(第页 > 0.05，图a、 c）。在3和6小时诱导NF-κB磷酸化(第页 < 0.05，图d） ●●●●。
Pam3CSK4诱导BMEC中ERK、JNK、p38和NF-κB磷酸化。用1µg/mL的Pam3CSK4处理细胞不同时间后，磷酸化ERK的表达(一)，第38页(b条)，百万(c（c）)和NF-κB(d日)western-blot分析并用β-actin蛋白水平进行归一化*第页 < 0.05, **第页 < 与用PBS处理细胞的对照组相比，0.001
Pam3CSK4通过ERK1/2、JNK和NF-κB途径调节MMP-2/9的表达
为了研究TLR2调节BMEC中MMP-2/9表达的信号通路，用ERK1/2抑制剂（20µM U0126）、p38 MAPK抑制剂（20μM SB203580）、JNK抑制剂（20µM SP600125）和NF-κB抑制剂（10µM BAY11-7082）或DMSO（0.1%溶媒对照）预处理细胞1小时，然后用1µg/mL Pam3CSK4处理6小时。通过qRT-PCR和蛋白质印迹检测MMP-2和MMP-9的表达。如图所示b、 d、U0126和SP600125显著抑制MMP-9的表达，而Pam3CSK4上调了MMP-9表达（所有第页 < 0.05）。与车内相比 + Pam3CSK4组，SB203580和BAY11-7082未抑制MMP-9的上调（图b、 d）。然而，BAY11-7082预处理细胞后，MMP-2的mRNA和蛋白表达(第页 < 0.001，图a、 c）和MMP-9的mRNA与载体对照和载体相比增加 + 分别为Pam3CSK4组(第页 < 0.001，图b） ●●●●。
Pam3CSK4通过MAPK/NF-κB信号通路影响BMEC中MMP-2和MMP-9的表达水平。用ERK1/2抑制剂（U0126）、p38 MAPK抑制剂（SB203580）、JNK抑制剂（SP600125）和NF-κB抑制剂（BAY11-7082）或DMSO预处理BMEC 1 h，然后用1µg/mL Pam3CSK4处理6 h。MMP-2的mRNA表达水平(一)，基质金属蛋白酶-9(b条)用qRT-PCR分析β-actin。收集细胞检测MMP-2(c（c）)和MMP-9(d日)蛋白质表达采用western blot，蛋白质水平采用ImageJ软件定量，并用β-肌动蛋白水平进行标准化*第页 < 0.05, **第页 < 0.001，与用PBS处理细胞的溶媒对照组相比
讨论
中枢神经系统中血液和大脑之间有三个主要屏障：血脑屏障、血脑脊髓液屏障和蛛网膜屏障[15]. BBB功能障碍与几种神经疾病的病理生理学相关[15]例如中风、多发性硬化症（MS）和阿尔茨海默病（AD）。BBB分解也与细胞因子、趋化因子和其他物质有关，包括基质金属蛋白酶[16].
MMPs家族包括20多种蛋白水解酶[17]. 它们通常分为四类：胶原酶、明胶酶（MMP-2和MMP-9）、基质溶素、基质溶酶和膜型MMPs[18]. MMPs家族参与组织重塑、癌症转移、慢性炎症和神经疾病[19]. 基质金属蛋白酶还能够降解几种蛋白酶、生长因子、细胞表面受体和细胞-细胞粘附分子[20]. 在受损的脑组织中，各种细胞表达MMPs，包括常驻细胞（内皮细胞、星形胶质细胞和神经元）和浸润性炎症细胞[9]. MMP在成人大脑中的表达通常很低，但许多研究表明，缺血性中风后，几种MMP被激活，其水平升高[21,22]. MMP活性在四个不同水平上受到严格调节：转录水平的基因表达；分区；前酶激活；和抑制蛋白水解[23].
当激动剂配体与TLR结合时，配体分子将激活TLR信号通路。TLR信号通路有两种类型：髓系分化因子88（MyD88）依赖性通路和TIR-域适配器诱导干扰素-β（TRIF）依赖性（MyD88-independent）通路[2]. TLR2激活MAPK[三]和转录因子（NF-κB）通过MyD88依赖性信号通路，导致促炎细胞因子如白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达以及MMP的产生。MAPK包括三个主要成员：细胞外信号相关激酶（ERKs）、c-Jun N末端激酶（JNKs）/应激激活蛋白激酶和p38[24].
最近的研究表明，MMP-2/9与中枢神经系统疾病密切相关。先前的研究人员已经揭示MMP-9的表达受不同细胞类型中MAPK的调节[25–27]. 此外，转录因子NF-κB参与调节几种细胞类型中MMPs的表达。几种TLR激动剂可以激活NF-κB并调节MMP的表达[26]. 然而，BBB的BMEC的分子机制尚未阐明。我们的研究表明，TLR2配体Pam3CSK4可以显著上调BMEC中MMP-9的表达，并下调MMP-2。同时，TLR2的刺激导致克劳丁-5、IV型胶原和ZO-1的下调，这与人类大脑内皮细胞系hCMEC/d3的研究一致[三]. MMP-2/9是炎症反应的关键介质，可能导致BMEC中的TJ降解和中枢神经系统疾病中BBB完整性的缺乏。先前的研究表明，MMP-9可以损伤TJ蛋白[28]. 据报道，活性MMP-9诱导ZO-1表达降低[29]MMP-9基因敲除小鼠缺血后ZO-1的降解减弱[30]. 可以合理地得出结论，TLR2激活可能通过增加BMEC中MMP-9蛋白水平来降解ZO-1。然而，MMP-9蛋白诱导的时间为3-6小时，而本研究中仅在治疗2小时后观察到克劳丁-5或IV型胶原的减少。我们只通过western blot和qRT-PCR检测细胞中MMP-9的含量。因此，推测上清液或其他物质中分泌的MMP-9会导致治疗2小时后克劳丁-5和胶原蛋白IV的减少。
Pam3CSK4是TLR2的特异配体[31]在本研究中，Pam3CSK4在1小时诱导了BMEC中ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化，在3和6小时诱导了NF-κB的磷酸化。此外，为了研究Pam3CSK4影响MMP-2/9表达的信号通路，我们用抑制剂预处理BMEC 1 h，然后用Pam3CSK4处理细胞6 h。ERK1/2抑制剂（U0126）和JNK抑制剂（SP600125）显著阻断Pam3CSK4诱导的MMP-9表达。与溶媒对照组相比，p38 MAPK抑制剂（SB203580）不抑制MMP-9的上调。结论：TLR2可能通过ERK1/2和JNK信号通路调节BMEC中MMP-9的表达。相反，用NF-κB抑制剂（BAY11-7082）预处理细胞后，MMP-2/9的mRNA和蛋白表达与载体对照组相比明显增加，但只有MMP-9的mRNA表达与载体相比显著增加 + Pam3CSK4组。结果表明，TLR2通过NF-κB信号通路负调控BMEC中MMP-2和MMP-9的表达。先前的研究表明TLR2激活了两条下游通路，包括IKK复合物和MAPK家族，然后激活NF-κB和激活蛋白-1（AP-1），导致促炎细胞因子的表达[32]. 然而，一项研究报道磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）负调控TLR2信号[33]. 因此，推测Pam3CSK4对MMP-2表达的调节涉及NF-κB信号通路和其他信号通路（如PI3K通路）之间的平衡。然而，这个实验有局限性。选择Pam3CSK4刺激BMECs 6小时来研究TLR2调节MMP-2表达的信号通路是不合适的，因为在BMECs中Pam3CSK4刺激6小时后，MMP-2的mRNA和蛋白水平没有变化（图a、 b）。
总之，TLR2通过ERK1/2和JNK信号通路调节MMP-9的表达，通过NF-κB信号通路负调控MMP-2/-9的表达。该发现可能为MMP-2/-9在BMEC中表达的分子机制提供新的见解。
致谢
本研究得到国家自然科学基金资助（81460188）；云南省应用基础研究项目（No.2011FB148）；云南省科技厅与昆明医科大学应用基础联合专项（No.2013FB201）；云南省中青年学术技术带头人和后备人才（No.2012HB028）；中国云南省卫生系统领导（编号D-201235）；王龙德院士工作站。
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1Gooshe M、Abdolghaffari AH、Gambuzza ME、Rezaei N。Toll样受体在多发性硬化症中的作用以及可能的治疗靶向性。《神经科学评论》。2014;25:713–739.[公共医学][谷歌学者] 2Hamanaka J，Hara H.Toll样受体参与缺血诱导的神经元损伤。中枢神经系统药物药物化学。2011;11:107–113. doi:10.2174/187152411796011312。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Nagyőszi P，Wilhelm I，Farkas AE，等。大脑内皮细胞中toll样受体的表达和调节。Neurochem国际。2010;57:556–564. doi:10.1016/j.neuint.2010.07.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Akira S、Uematsu S、Takeuchi O。病原体识别和先天免疫。单元格。2006;124:783–801. doi:10.1016/j.cell.2006.02.015。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Miggin SM，O'Neill LA。TLR信号调节的新见解。白细胞生物学杂志。2006;80:220–226. doi:10.1189/jlb.1105672。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Ziegler G、Harhausen D、Schepers C等。TLR2在小鼠短暂性局灶性脑缺血中具有有害作用。生物化学与生物物理研究委员会。2007;359:574–579. doi:10.1016/j.bbrc.2007.05.157。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Ortiz GG、Pacheco-Moisés FP、Macías-Islas M等。血脑屏障在多发性硬化症中的作用。医学研究档案。2014;45:687–697. doi:10.1016/j.arcmed.2014.11.013。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Kaur C、Ling EA。缺氧缺血性条件下的血脑屏障。当前神经血管研究。2008;5:71–81. doi:10.2174/156720208783565645。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Lakhan SE、Kirchgessner A、Tepper D、Leonard A.急性缺血性卒中中基质金属蛋白酶和血脑屏障破坏。前神经。2013年doi:10.3389/fneur.2013.00032。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Piperi C，Papavassiliou AG.调节基质金属蛋白酶的分子机制。当前顶级医学化学。2012;12:1095–1112. doi:10.2174/1568026611208011095。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Burek M，Salvador E，Forster CY。作为体外血脑屏障模型的永生化鼠脑微血管内皮细胞系的生成。J签证费用。2012年doi:10.3791/4022。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Jin R，Yang G，Li G.缺血性卒中血脑屏障破坏的分子见解和治疗靶点：基质金属蛋白酶和组织型纤溶酶原激活剂的关键作用。神经生物学疾病。2010;38：376–385。doi:10.1016/j.nbd.2010.03.008。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Adibhatla RM，Hatcher JF。组织纤溶酶原激活物（tPA）和基质金属蛋白酶在中风发病中的作用：治疗策略。中枢神经系统神经紊乱药物靶点。2008;7:243–253. doi:10.2174/187152708784936608。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14坎宁安LA，韦泽尔M，罗森博格GA。MMPs和TIMPs在脑缺血中的多重作用。格利亚。2005;50:329–339. doi:10.1002/glia.20169。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Abbott NJ、Patabendige AA、Dolman DE、Yusof SR、Begley DJ。血脑屏障的结构和功能。神经生物学疾病。2010;37:13–25. doi:10.1016/j.nbd.2009.07.030。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16血脑屏障：最新进展和临床相关性。神经病学。2012;78:1268–1276. doi:10.1212/WNL.0b013e318250d8bc。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17罗林斯ND、巴雷特AJ、贝特曼A.MEROPS：肽酶数据库。核酸研究。2010;38：D227–D233。doi:10.1093/nar/gkp971。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Nagase H，Visse R，Murphy G.基质金属蛋白酶和TIMP的结构和功能。心血管研究。2006;69:562–573. doi:10.1016/j.ccardires.2005.12.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Klein T，Bischoff R.基质金属蛋白酶的生理学和病理生理学。氨基酸。2011;41:271–290. doi:10.1007/s00726-010-0689-x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Khokha R、Murthy A、Weiss A.金属蛋白酶及其在炎症和免疫中的天然抑制剂。Nat Rev免疫学。2013;13:649–665. doi:10.1038/nri3499。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Lee CZ、Xue Z、Zhu Y、Yang GY、Young WL。基质金属蛋白酶-9抑制减弱血管内皮生长因子诱导的脑出血。(打、击等的)一下。2007;38：2563–2568。doi:10.1161/STROKEAHA.106.481515。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22McColl BW，Rothwell NJ，Allan SM。全身炎症改变小鼠实验性中风后脑血管紧密连接中断的动力学。神经科学杂志。2008;28:9451–9462. doi:10.1523/JNEUROSCI.2674-08.2008。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Loffek S、Schilling O、Franzke CW。基质金属蛋白酶的生物学作用：关键平衡。《欧洲复兴杂志》。2011;38:191–208. doi:10.1183/09031936.00146510。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Vandooren J、Van den Steen PE、Opdenakker G.明胶酶B或基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的生物化学和分子生物学：未来十年。生物化学与分子生物学评论。2013;48:222–272. doi:10.3109/10409238.2013.770819。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Ahmad R、Shihab PK、Jasem S、Behbehani K.FSL-1通过TLR-2和NF-kappaB/AP-1信号通路诱导单核细胞THP-1细胞产生MMP-9。细胞生理生化。2014;34:929–942. doi:10.1159/000366310。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Jiang C，Xu M，Kuang X等。梅毒螺旋体鞭毛蛋白通过TLR5和MAPK/NF-κB信号通路刺激人表皮角质形成细胞中MMP-9和MMP-13的表达。实验细胞研究。2017年doi:10.1016/j.yexcr.2017.09.040。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Shihab PK、Al-Roub A、Al-Ghanim M、Al-Mass A、Behbehani K、Ahmad R.TLR2和AP-1/NF-kappaB参与了人类单核细胞THP-1细胞中热杀李斯特菌诱导的MMP-9的调节。J Inflamm（伦敦）2015;12：32.doi:10.1186/s12950-015-0077-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Liu J，Jin X，Liu KJ，Liu W.基质金属蛋白酶-2介导的闭塞素降解和小窝蛋白-1介导的克劳丁-5再分布有助于缺血性卒中早期血脑屏障损伤。神经科学杂志。2012;32:3044–3057. doi:10.1523/JNEUROSCI.6409-11.2012。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Harkness KA，Adamson P，Sussman JD，Davies-Jones GA，Greenwood J，Woodroof MN。地塞米松对中枢神经系统血管内皮基质金属蛋白酶表达的调节。大脑。2000;123（第4部分）：698–709。doi:10.1093/brain/123.4.698。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30Asahi M，Wang X，Mori T，等。基质金属蛋白酶-9基因敲除对脑缺血后血脑屏障和白质成分蛋白水解的影响。神经科学杂志。2001;21:7724–7732. doi:10.1523/JNEUROSCI.21-19-07724.2001。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Jin MS，Kim SE，Heo JY，等。三酰化脂肽结合诱导的TLR1-TLR2异二聚体的晶体结构。单元格。2007;130:1071–1082. doi:10.1016/j.cell.2007.09.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Okun E、Griffoen KJ、Lathia JD、Tang S、Mattson MP、Arumugam TV。神经变性中的Toll样受体。大脑研究评论。2009;59:278–292. doi:10.1016/j.brainesrev.2008.09.001。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Fukao T、Koyasu S.PI3K和TLR信号的负调控。趋势免疫。2003;24:358–363. doi:10.1016/S1471-4906（03）00139-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
