简介
激活MAPK通路突变导致肿瘤恶性转化黑色素瘤，BRAF（V600E）是患者环境中最常见的驱动因素(1–三). 选择性MEK和BRAF抑制剂的临床应用已全面扩展BRAF突变型黑色素瘤患者的生存率(4–6). 最初的时候这些靶向治疗最终会产生有效的耐药性，即使在给予BRAFi/MEKi联合治疗的患者(5，7，8). 关于黑色素瘤是如何形成的，已经提出了一些机制对治疗无效，包括PI3-K和AKT通路活性增加，受体酪氨酸激酶（如c-KIT、FGFR和EGFR）的表达增强，以及通过NRAS突变或CRAF或ARAF上调补偿BRAF活性(9–11). 尽管进行了这项工作，但仍有大量的相关需求分析治疗反应的临床前模型体内整齐做出更好的预后预测并告知治疗策略(12).
多种复杂的基因组、表观遗传和细胞外因素都会影响黑色素瘤对治疗干预的反应和抵抗。证据分子水平上的“表型转换”也已被确定作为肿瘤对靶向治疗产生耐药性的相关机制(13–15). 通过这种机制，肿瘤细胞可以适应干样表型，从上皮表型到间充质表型的“转换”在多种肿瘤中记录了对药物的反应，这被认为可以促进恶性肿瘤与治疗抵抗(16).
黑色素瘤细胞异质性，由分子中的两个开关驱动细胞外微环境的表达和变化也会影响治疗耐药性(17，18). 细胞外基质（ECM）的确切影响肿瘤对药物的反应尚不清楚。众所周知，肿瘤中的胶原蛋白通常在线性束中交联，可以加固微环境和引发促进肿瘤发生的下游信号事件(19，20). 改善我们对治疗药物如何影响肿瘤内ECM的理解微环境至关重要，因为胶原蛋白沉积和重组可能促进黑色素瘤细胞侵袭、恶性和耐药的多种机制(21，22).此外，高基质细胞浓度的肿瘤内区域显示可以促进肿瘤细胞对抗BRAF抑制剂的持久性(23). 肿瘤发展和药物中ECM行为的建模通过适当的体内策略进行反应有助于发现新的治疗方法方法和目标(24).
应对应对和抵制目标的建模挑战治疗，我们扩展了现有的泰尔：：克里尔；BRAF公司加利福尼亚州;PTEN公司液氧/液氧通过Lox-Stop-Lox-td番茄荧光杂交建立黑色素瘤（PBT）GEM模型报告等位基因（td番茄LSL公司) (25，26). 本公司的成立等位基因能够直接追踪内源性黑色素瘤的发展和治疗通过非侵入性活体成像对时间的反应。高度放大我们已经实现了4-羟基他莫昔芬（4-HT）在小鼠耳朵上的应用方法精确的时空控制黑色素瘤的发生。使用这种方法，我们直接可视化肿瘤和胶原在整个发育过程中的重组对单药曲美替尼（一种高效变构MEKi）的反应(27)和曲美替尼/达布拉芬尼联合用药MEKi/BRAFi治疗。我们还通过治疗早期和晚期的转录组和激肽组重编程分析，全面了解黑色素瘤对MAPKi的反应。
材料和方法
局部4-HT应用方法
所有动物研究均按照UNC-Chapel Hill的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。收件人通过局部局部注射实现空间控制的黑素细胞重组我们将1μl 20mM浓度的4-HT溶液用于二甲基亚砜、100%乙醇和橙-6染料可精确显示该区域暴露于4-HT中，CreER被激活（Sigma-Aldrich）小鼠麻醉时的耳朵。8-10分钟后用70%的EtOH大力清洗，以防止三苯氧胺转移到其他并确保单一、可控的原发病变(.1B）。使用这种方法，我们不断地诱导局部黑色素瘤仅在可复制的应用区域生长时尚。
用细胞分辨率可视化黑色素瘤随时间的发展。A） tdTomato+PBT黑色素瘤发展的活体内多光子图像随着时间的推移在老鼠耳朵里；施用20mM 4-HT后0-9周。二次谐波产生（SHG）揭示了真皮内的成束胶原蛋白耳朵。图片显示合并的SHG和tdTomato频道。FV1000MPE；1050nm；4%激光功率。B） td番茄信号和C）SHG的归一化平均强度肿瘤生长过程中的信号。N≥12。误差=95%CI.D）小鼠TRAMETINIB&E染色和E）Masson三色染色4-HT应用后第2、6和8周。奥林巴斯B×51；10×目标；布莱菲尔德。F） 2、6、7和8日td番茄+肿瘤生长的组织学施用20mM 4-HT后数周。图像显示合并了DAPI和tdTomato频道。奥林巴斯B×51；20×目标。
活体内双光子显微镜
肿瘤在10-30mm之间的荷瘤动物三是如前所述成像(28).在配备加热垫的情况下，用1–2%的异氟醚对动物进行麻醉通过温度反馈，在治疗前和治疗过程中对肿瘤进行成像药物治疗研究。所有成像均在奥林巴斯FV1000MPE上进行配备Insight DeepSee红外激光器（Spectra-Physics）和垂直BX-61WI显微镜，使用25x，1.05 N.a.（2 mm TRAMETINIB.D.）浸水物镜使用与水折射率相同的光学成像凝胶捕获图像。激光调谐至1050nm以激发td番茄荧光。一个定制铝耳夹，1）底部平台，用于放置耳朵和2） 装有一对拇指螺丝固定耳朵的上部部件在盖玻片下面，有助于将热量从在成像过程中隐藏加热板/加热垫。激光功率（4%）、软件和显微镜设置（850和500时的RXD2和RXD4通道PMT电压，分别）对所有采集的图像都是一致的。双通道非descan探测器用于图像采集，数据通过奥林巴斯收集Fluoview软件。
td番茄阳性肿瘤的宏观成像
在奥林巴斯MVX10显微镜系统上进行宏观成像，并使用Metamorph软件和0.8X或放大1倍。使用水银灯和用于红色荧光的滤光轮。用1–2%麻醉小鼠异氟醚，并在成像期间放置在加热垫上。耳朵被压扁了使用双面胶带稳定到5mL试管，以实现完整的宏观视图每一个肿瘤。
肿瘤进展的组织学和肿瘤对曲美替尼的反应
耳和淋巴结切除，4C时固定在4%PFA中24小时小时。然后用新鲜的30%蔗糖在4C温度下对组织进行24次冷冻保护小时。然后在VWR透明冰冻切片中冷冻耳朵和淋巴结使用乙醇/干冰浴将化合物（VWR 95057）储存在剖切前为-80C。切片和TRAMETINIB&E染色由北卡罗来纳大学教堂的细胞生物学和生理学组织学核心进行希尔。
药物治疗和进一步的小鼠方案
每公斤0.3毫克（mpk）曲美替尼（GSK212）粉状化合物或者，对于联合研究，0.3 mpk曲美替尼+18 mpk达布雷尼粉剂将复合混合物添加到基础混合物中，再将其添加到普通食物/食物中混合后由Research Diets，Inc.制粒在药物治疗1周和12周时收获的小鼠。肿瘤在课程中，每周用数字卡尺进行测量并记录长度、宽度和高度的测量值（单位：mm）。肿瘤大小由肿瘤深度指示。仔细监测小鼠根据我们的协议。
荧光强度分析
最大强度投影来自4μm的z堆叠间隔，用FV1000MPE双光子拍摄，（每个大约20–40片图像，取决于肿瘤深度）。使用变形术测量平均强度软件分析，每个图像的强度通过减去背景平均荧光值。测量值为4-OHT应用后每个时间点的平均值，用Excel绘制，以及在Prism中绘制。用4%的激光功率采集每张图像以保持一致性。
M（M）多路复用的我抑制剂b条ead（MIB）色谱和质谱（微软）
速冻肿瘤用研钵和杵在冰镇MIB中碾碎裂解缓冲液（50mM HEPES、150mM NaCl、0.5%Triton X-100、1mM EDTA、1mM EGTA、pH7.5）添加完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）和1%磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3（西格玛）。对提取物进行超声波处理3×10s，离心澄清，注射器过滤（0.22um）Bradford含量测定。等量的总蛋白质（0.3mg）在复合抑制剂珠（MIB）柱上进行重力释放高盐MIB裂解（1M NaCl）。MIB柱由175ul的六种混合物组成I型激酶抑制剂（CTx-0294885，VI-16832，PP58，Purvalanol B，UNC-21474，和UNC-8088A）用烃类连接剂定制合成并共价连接ECH-Sepharose（或EAH-Sephalose用于Purvalanol B）珠描述(29). 柱用5mL高盐（1M NaCl）、5mL低盐（150mM NaCl-）MIB裂解缓冲液，以及0.5mL低盐溶解缓冲液，含0.1%十二烷基硫酸钠。结合蛋白用洗脱剂洗脱两次0.5%十二烷基硫酸钠、1%β-巯基乙醇、100mM Tris-HCl、pH6.8，在100C下保持15分钟。洗脱液在60℃下用DTT（5mM）处理25分钟，用20mM碘乙酰胺处理25分钟黑暗中30分钟。使用Amicon Ultra-4（10k）进行自旋浓缩截止）至~100 uL，用甲醇/氯仿沉淀样品，在a speed-vac并在50mM HEPES（pH8.0）中重新悬浮。色氨酸消化物在37℃下过夜，用1mL乙酸乙酯萃取四次去除洗涤剂，在speed-vac中干燥，并使用C-18进一步清洁肽根据制造商的协议旋转柱（Pierce）。
RNA分离、RNA-seq文库制备、RNA-sq和分析
每个snap冷冻肿瘤的中心部分用一个干净的使用RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）根据符合制造商的方案，可选择DNase I治疗（Qiagen）持续15分钟。400ng总RNA被用作RNA-seq文库构建的输入根据制造商的方案使用Kapa Stranded信使核糖核酸试剂盒。TruSeq适配器序列用于索引。文库扩增为描述为12个PCR循环。每个库的等摩尔量作为NextSeq 500-75周期上的多个1.65pM池，单索引，高输出V2套件。QC-pass读数与小鼠参考基因组对齐（mm9）使用MapSplice(30). 路线剖面由Picard Tools v1.64确定。对对齐的读取进行排序使用SAMtools编制索引，并转换为转录组坐标并过滤对于indel、大型插入和使用UBU v1.0的零映射质量。成绩单使用期望最大化算法(31). 预期的基因读取计数被用作DESeq2的输入识别差异表达基因(32). 差异表达基因集（p形容词<0.1)用作Enrichr的输入(33，34)识别通路富集。热量原木图2转换后的RSEM规范化表达值为使用GENE-E软件生成（Broad Institute）。正常化RSEM小鼠基因这些值通过共享的同源基因ID路径转换为唯一的人类基因ID如前所述确定签名(35，36).
细胞系和药物治疗
人类黑色素瘤细胞系使用A375、SK-MEL-190、，WM266–4、SK-MEL-100、SK-MEL-5和Mel537已经广泛应用具有特征的(37). 细胞是常规的DAPI染色检测支原体污染，传代不超过实验前一个月。细胞在DMEM（A375，WM266–4）或RPMI（SK-MEL-190、SK-MEL-100、SK-MEL-5和Mel537）补充10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。Dabrafenib和trametinib从Selleck购买并溶解在DMSO中。培养物用二甲基亚砜作为对照，或用100nM达布拉芬尼和10nM达布芬尼处理曲美替尼联合治疗48例。
西方印迹法
提取速冻小鼠肿瘤或人类黑色素瘤细胞系如上所述的MIB裂解缓冲液（150mM NaCl）和过滤的裂解产物在1X中煮沸100C下SDS样品缓冲液10分钟。通过以下方法分离等量的裂解物SDS-PAGE，转移到硝化纤维素膜上，用TBS中5%的牛奶封闭，并用以下主要抗体进行免疫印迹：PDGFRβ、DDR1、磷酸-ERK1/2（218/222）、MEK1/2、磷酸-MEK1/2、SOX2和E-cadherin，来自细胞信号；泛细胞角蛋白、BRAF、c-Kit、SOX10和ERK2来自圣克鲁斯；来自Rockland的RFP（检测tdTomato）；来自ProteinTech的SOX21。使用的二级抗体是来自皮尔斯。SuperSignal West Pico化学发光基板（Thermo Scientific）使用并在Biorad ChemiDoc上收集图像。
液相色谱、质谱和分析
肽在2%ACN和0.1%甲酸中重新悬浮。40%的将最终的肽悬浮液注入Thermo Easy Spray 75μm x25cm C-18色谱柱，并使用简单nLC-1000。Thermo Q Exactive质谱ESI参数如下如下：3e6 AGC MS1，80ms MS1最大注入时间，1e5 AGC MS2，100ms MS2最大注入时间，20个回路计数，1.8m/z隔离窗，45s动态排除。原始MaxQuant LFQ使用Uniprot/Swiss-Prot鼠标数据库和默认参数用于以下例外情况——只使用了独特的肽，运行之间的匹配是利用，并包括磷酸化-STY肽。归一化LFQ强度为日志2-变换和层次聚类（1-Pearson相关），或者导入到Perseus软件中。在英仙座，LFQ强度为对数2-转换，缺少值如果至少有三个有效值存在于一个治疗组和两个样本t检验基于排列的FDR（5%截止值）。
结果
特定的4-HT应用方法可实现肿瘤的时空控制生长
可诱导的基因工程小鼠（GEM）癌症模型提高了我们对肿瘤生物学和治疗反应的认识对于翻译研究来说，迫切需要改进这些模型(39). 控制能力内源性肿瘤在时间和空间上的启动是一个关键的实验需要改进的变量，以更好地模拟发生在患者。我们开发了一种精确的诱导方法，其中1μL 20mM将4-羟氨苄醚（4-HT）涂抹在小鼠耳朵中部，用于8-10分钟后，小心取出并清洗该区域。我们选择了诱发耳朵上的黑色素瘤，因为小鼠耳朵的皮肤含有滤泡内黑素细胞的数量更接近人类皮肤，耳朵为稳定的活体成像提供了理想的表面(39，40). 我们的成像策略包括tdTomato荧光报告等位基因（td番茄LSL公司)在现有的他莫昔芬诱导PBT中黑色素瘤GEM模型() (25，26). 这种应用4-HT的方法产生了强大的局部肿瘤以可复制的方式在小鼠耳朵上形成；肿瘤形成率100%外显率(;
补充图S1（第一阶段）). 此外，黑素瘤诱导的精确时空控制在这个GEM模型中，延长了动物的寿命（通常受到多个初级阶段的限制肿瘤），实现了对黑色素瘤的长期纵向体内研究发展和后来的药物反应。
td番茄的基因掺入使黑色素瘤可视化采用特定的4-HT施用方法进行引发和生长。A） PBT示意图(泰尔：：克里尔；BRAF公司加利福尼亚州;PTEN公司lox/lox;td番茄LSL公司)CreER诱导重组前后的黑色素瘤GEM模型。B） 宏观的在单个鼠标耳朵上应用4-HT之前、期间和之后的图像。奥林巴斯MV×10.巴=500μm。C） 透射光的宏观图像和D）td番茄荧光对肿瘤生长的纵向影响单鼠耳，4-HT应用后2-9周。E） 肿瘤生长，通过肿瘤深度随时间变化进行测量。N≥12。误差=95%置信区间。
可视化早期内源性肿瘤进展过程阶段在该领域是一个相对的“黑匣子”现有模型不能用于跟踪肿瘤细胞在细胞分辨率。我们使用了两种先前描述的活体成像方法在宏观（mm）和使用体视显微镜和多光子的微观（μm）尺度显微镜，分别(补充图S1A、S1B) (28). 使用麻醉的动物，我们将它们放在加热垫上并在成像过程中使用定制设计的耳夹稳定耳朵。使用多光子成像，我们能够量化重组的原始数量黑素细胞诱导后。4-HT治疗后不到2天，我们发现真皮内单个重组内源性黑素细胞(补充图S1). 在这里阶段，我们计算了1.2毫米内的td番茄+黑色素瘤细胞2区域（140个电池/毫米2)并近似于重组的总数最初由4-HT液滴（2.77mm2，n=20）(补充图S1C、S1D). 我们鉴定了不同群体的重组tdTomato+细胞，包括真皮内的叶内和叶间黑素细胞，计算较少400多个黑素细胞最初在该系统中与20mM 4-HT重组，产生可重复的肿瘤形成(补充图S1E、S1F).
接下来，我们连续观察了PBT黑色素瘤早期的进展情况在这个模型中描述黑色素瘤发展的时间。跟踪每个肿瘤通过透射光和荧光成像进行4-HT治疗后一周显示了肿瘤生长的各个阶段，在不同的时间点(). 在肉眼可见，黑色素瘤最初呈放射状扩散，形成可触及的肿瘤施用4-HT后6-8周内出现肿块，我们观察到在整个肿瘤生长过程中，即使在单独队列(，数据不展示). 黑色素瘤的生长，以肿瘤深度衡量，呈指数增长，没有证据表明该动物的其他区域出现肿瘤(;
补充图S1G系列). 此外，培育出Pten液氧/液氧和BRAF公司加利福尼亚州等位基因产生对照Tyr:：CreER；td番茄LSL公司用于与非致瘤小鼠进行比较的小鼠系荧光黑素细胞是树突状的，不会增殖形成黑色素瘤(补充图S2A公司).
纵向活体成像显示黑色素瘤的不同阶段发展
多光子成像提供了一个同时可视化的平台td番茄+黑色素瘤细胞和二次谐波产生（SHG）肿瘤微环境中胶原纤维束网络的检测(42). 以SHG为指导，我们可视化整个真皮的肿瘤细胞（深度范围为30μm至~200μm），位于表皮和软骨层之间老鼠耳朵。此外，我们还发现了头发等已知结构卵泡，其圆形结构和中心缺乏荧光。
通过跟踪与SHG一致的td番茄+黑色素瘤细胞，我们通过细胞分辨率跟踪黑色素瘤的早期发展，我们确定了不同的生长阶段(;
补充图S2B型). 在“扩散阶段”4-HT应用后第周，我们确定了黑色素瘤细胞的克隆群直接产生于真皮。这些浓缩的tdTomato+细胞区域随着时间的推移，扩大为肿瘤前病变。从那里开始，td番茄+细胞在“预”（2-4周）和“早期肿瘤”（4-6周）阶段，真皮因td番茄+黑色素瘤而变得致密细胞。在此阶段，SHG信号显著降低，表明捆绑胶原蛋白和ECM的降解。在这里，我们还清楚地确定了耳内细胞水平的肿瘤边界(补充图S2C，白线). 最后，“晚期肿瘤阶段”（7+周），对应于患者环境中的垂直生长阶段，如黑色素瘤出现在原来平坦的耳朵表面(;). 不同条件下的荧光强度分析肿瘤发展的阶段进一步概括了我们模拟临床的能力肿瘤生长，随着时间的推移，tdTomato增加，SHG信号减少(;).
比较我们的活体内分期系列与更传统的方法，我们使用经典的组织学技术来表征肿瘤通过TRAMETINIB&E染色在该模型中的进展。与我们的一致活体成像，组织厚度随时间增加基质细胞数量和肿瘤细胞浓度明显增加(). 马森三色（MT）染色进一步证明4-HT后胶原降解应用程序(). 自从tdTomato组织学处理后，信号保持不变，我们也进行了组织切片荧光显微镜观察肿瘤的发展在不同阶段(;
补充图第2天). 有了这项技术，在“增殖我们在背部看到少量tdTomato+细胞施加4-HT的小鼠耳朵。在肿瘤早期和晚期，然而，我们发现在腹侧和背侧区域都有垂直生长在“肿瘤晚期”，我们发现了黑色素瘤细胞侵入耳朵中部的软骨层(补充图S2D).
通过定义原位黑色素瘤发展的不同阶段初始时间点，我们的系统提供了一种可视化肿瘤细胞的机制各种不同调查平台中的行为。我们设想该系统可用于查询早期体内肿瘤行为，如肿瘤血管生成、肿瘤与基质的相互作用、，垂直生长之前的入侵(43). 然而，由于我们的主要目标是创建一个患者对治疗的长期反应，我们使用该系统来探测选择性MEK1/2抑制剂对黑色素瘤行为的纵向影响细胞和分子水平。
随着时间的推移，黑色素瘤对MEKi的反应是异质性的
治疗活化BRAF-突变黑色素瘤的护理标准包括BRAFi（如达布雷尼）和MEKi（如曲美替尼）联合治疗(44). BRAF抵抗机制抑制剂在创业板和人类中都有广泛的特征。在此我们专注于对选择性变构MEK1/2抑制剂的反应，曲美替尼（以下简称MEKi），可有效抑制两种Ras和BRAF激活ERK通路(27). 研究靶向MEKi治疗如何影响肿瘤行为在这个模型的宏观和细胞水平上，我们给含MEKi的4-HT应用后8-9周，从晚期肿瘤开始，给小鼠喂食阶段，并使用活体成像连续成像黑色素瘤对药物的反应。MEKi被纳入chow（研究饮食）中，每日剂量为0.3 mpk，食物摄入量是用杰克逊实验室的酚类物质计算的数据库，如之前的研究(45).由于肿瘤的发展在我们的模型中是时空控制的，我们能够扩展药物治疗并可视化PBT黑色素瘤对MEKi的反应和肿瘤再生（使用MEKi 12周后），模拟延长的肿瘤抵抗在患者环境中进行靶向治疗。
没有药物治疗，肿瘤在空间上呈指数增长tdTomato表达相对均匀的区域继续生长，与MEKi上随时间变化的异质响应相比(数字，). 所有肿瘤在MEKi治疗后反应迅速，然而，第一周内肿瘤体积缩小约30%与对照组相比(数字，). 给足够的时间治疗，疾病进展，肿瘤复发，恢复到原来的大小12周内。即使在宏观水平上，肿瘤反应也是异质的，一些区域有持续的tdTomato信号，而其他区域没有荧光，在后期用tdTomato+细胞重新填充MEKi公司(，箭头).这些结果表明了内在和后天功能的证据在该模型中对MEKi的耐药性，并模拟异质性药物反应。
随着时间的推移，MEKi的异质性肿瘤反应和上皮化。A） 未经药物治疗的PBT肿瘤的宏观图像8，9，10，涂抹20mM 4-HT和B后14周和16周）曲美替尼治疗前和治疗1、5、10和12周后PBT肿瘤的时间。C）无MEKi的PBT肿瘤厚度/生长随时间变化的图形表示曲美替尼治疗和D）随着时间的推移接受MEKi治疗。N≥4.误差=95%CI.E）PBT肿瘤术前、术后1周的免疫组织化学宽视野图像MEKi（早期）和7周（晚期），用Vimentin和F）E-Cadherin染色。奥林巴斯FV1000，开放针孔；20×.
MEKi诱导上皮化和瘤内重组
我们在MEKi上对早期和晚期肿瘤进行了组织学切片发现间充质标志物Vimentin的表达减少通过免疫组织化学（IHC）增加E-Caddherin(数字，). 我们还发现肿瘤细胞组织和通过亮场和荧光成像研究黑色素随时间的表达(补充图S3A，第三方银行). 药物治疗前，肿瘤细胞聚集在真皮内但与靠近软骨的细长和纺锤状形态对齐边界(补充图S3C系列，顶部). 在MEKi早期，我们发现肿瘤内真皮内的巢穴，肿瘤细胞以密集的圆形方式组织(补充图S3C系列，中间). 肿瘤巢被描述为黑色素瘤中的促生长区域，在MEKi的这个阶段，它们可能指出促进治疗抵抗的结构(46). td番茄+细胞也减少靠近软骨层。MEKi治疗晚期肿瘤再生真皮中的巢不太明显，黑色素瘤细胞再次出现再次靠近软骨边界(补充图S3C，底部). 有趣的是，肿瘤巢穴仅在区域内发现MEKi晚期通过软骨边界的侵袭(补充图S3D系列). 在MEKi晚期，td番茄+黑色素瘤的密度增加阶段与治疗前相比，表明肿瘤在很大程度上再生由于肿瘤细胞本身(补充图S3).
肿瘤细胞与捆绑的胶原蛋白在最初存活期间共同定位MEKi公司
肿瘤中的ECM是高度动态的，胶原蛋白的去调节ECM内的交联已被证明在癌症中起到致病作用发病机理(47，48). 我们使用了多光子活体显微镜用于识别肿瘤细胞和MEKi上早期和晚期的胶原捆绑。治疗前，SHG信号较低，反映了9周PBT肿瘤中ECM的丢失或降解4-HT后。然而，MEKi处理引起了形态学变化和早在用药3天时肿瘤细胞的重组(). 引人注目的是，tdTomato强烈地共同本地化在这一阶段出现SHG，表明耳真皮在MEKi肿瘤细胞存活中起作用(数字，). 经过几周的持续治疗肿瘤细胞与成束胶原结构的空间相关性坚固(数字，). 此外，td番茄+黑色素瘤MEKi上的细胞密度在几周内增加，显示出显微镜下肿瘤再生前肿瘤持续存在。
活体内成像显示胶原束与肿瘤之间的关系细胞在MEKi上存活。A） tdTomato+PBT黑色素瘤的活体多光子成像MEKi治疗前和早期（3天）、中期（3.5周）和晚期（9周）药物阶段。最大强度投影；FV1000MPE；25×;1050纳米；4%功率。比例尺=50μm。B） 平均皮尔逊MEKi上SHG和tdTomato信号随时间变化的相关系数治疗。N≥9.误差=95%CI.C）马森三色（MT）PBT黑色素瘤早期和晚期组织切片的染色（1和7周）。蓝色信号表示肿瘤内ECM和捆绑胶原蛋白。
在MEKi的后期（6-12周）肿瘤细胞和捆绑的胶原结构随着肿瘤复发而减少(数字，). 在这个阶段，我们观察到tdTomato和SHG信号之间的空间相关性和共定位，我们确定肿瘤细胞独立于胶原的区域，反之亦然(，箭头).通过tdTomato和SHG信号之间的联合定位分析，我们能够测量肿瘤细胞与捆绑胶原蛋白的相关性随时间的变化在MEKi上(). 这表明随着时间的推移，随着MEKi失效和黑色素瘤耐药胶原蛋白结构对肿瘤细胞生存的重要性降低，这可能是由于肿瘤信号或表型的显著变化。
TRAMETINIB&E和Masson’s Trichrome（MT）表明ECM沉积与MEKi早期相比，后期增强(数字，蓝色色斑). 这表明捆绑的胶原蛋白可能起到曲美替尼治疗初期对肿瘤细胞存活的重要作用治疗。当ECM的特性发生变化时（沉积、位置、，浓度、分布、组织）和捆绑胶原蛋白增加在MEKi治疗期间，肿瘤细胞对捆绑胶原蛋白的依赖性随着治疗的继续，单个细胞的存活率降低，表明ECM与药物治疗期间肿瘤生长之间存在可塑性关系响应。
MEKi反应的基因体分析显示MEK1/2有效且持久抑制与适应性激酶体重编程
由于我们能够看到肿瘤处药物反应的变化随着时间的推移，通过活体成像的细胞水平，我们试图补充这些通过询问MEKi上随时间发生的分子变化来洞察(补充图S4系列). 识别与之平行的基因体中的重编程事件我们的影像学研究中，我们收集了MEKi治疗和控制的肿瘤，并进行了肿瘤反应的分子分析。我们采用了化学蛋白质组学方法(米复杂的-我抑制剂b条ead亲和层析与米屁股秒光谱测定，MIB/MS）至评估我们模型中基因体的状态。对目标的适应性反应激酶抑制剂可以导致信号转导的显著改变，最终耐药与肿瘤进展(49–51). 我们有之前使用MIB/MS来表征导致三阴性乳腺癌对MEK抑制的治疗耐药性拉帕替尼治疗HER2+乳腺癌(29，52). 亲和力纯化需要I型激酶抑制剂的混合物来选择性地基于激酶的激活状态、丰度和亲和力来富集激酶抑制剂。未治疗的肿瘤和治疗1周（早期）的小鼠肿瘤在MEKi上收获或12周（晚），进行snap冷冻，并进行MIB/MS处理(). 如预测MEK1/2 MIB结合（由无标签定量（LFQ）强度确定）与未经治疗的对照肿瘤相比，它是引人注目的，并且在整个实验持续时间(). 这个LFQ强度也很容易观察到BRAF和ERK1/2的MIB结合损失(补充数据S5A-C型). 这些观察结果证实曲美替尼治疗的小鼠表现出MEK抑制，与总体情况一致肿瘤深度减少。
对慢性和强MEK抑制的适应性激肽反应。（A） 实验MIB/MS工作流程的示意图。（B） MIB公司未经处理、早期和晚期MEK1和MEK2的结合（LFQ强度）肿瘤。***，p<0.001。（C） 显示为热图的层次聚类以平均值为中心的对数2-转换的LFQ强度（MIB结合）未经治疗、早期和晚期肿瘤，如（A）所示。显示选择面板按行标记激酶。（D） 显示log2折叠变化MIB的火山图早期与未治疗肿瘤的结合（LFQ强度）与–log10 p值（FDR=0.05）。虚线，p=0.05。（E） 火山图显示晚期与未治疗肿瘤的log2折叠变化MIB结合（LFQ强度）根据–log10 p值绘制（FDR=0.05）。虚线，p=0.05。（F）未经治疗、早期和晚期肿瘤的免疫印迹，如（A）所示。ERK2被用作加载控件。
为了深入了解MEK抑制的整体激肽反应用Perseus软件处理激肽组数据，并对其进行层次聚类进行对数转换的LFQ强度(). 值得注意的是，大多数激酶表现出与生长相关的曲美替尼对结合力的相对丧失阻滞和肿瘤缩小(，插入). 尽管MEK具有强大的抑制作用激酶显示随着时间的推移MIB结合增加的模式。这些激酶包括RTKs c-KIT和Ephrin A型受体1（EPHA1），代谢激酶FN3K、PTK6、应激相关激酶CDK5和B淋巴激酶（黑色）。而未经治疗的患者可以观察到一定程度的肿瘤异质性在早期时间点，晚期组在整体kinome方面表现得更相似行为。主成分分析证实了这一观察结果kinome剖面(补充图S5D). 要可视化数量和基因体变化的重要性，早期生成了火山图与未治疗对照组相比，晚期MEKi治疗的肿瘤(数字，). 不出所料，我们损失惨重MEK1和MEK2的MIB结合中。相反，激酶如c-KIT、FGFR3和对MEKi的反应是BLK显著增加。这些观察结果通过肿瘤裂解物WB确认()包括磷酸-ERK1/2的损失和总量的减少PDGFRβ。此外，在所有的WB肿瘤(补充的图S5E). 这些实验证明了在我们的黑色素瘤模型中对激肽组进行时序评估，并证明激肽组的可塑性，即使是对强效和选择性MEKi的反应。这个适应性激肽反应允许对黑色素瘤信号进行重新编程对MEKi产生耐药性。
转录组分析揭示了增强的表型状态变化上皮细胞对MEKi的反应
为了检测MEKi治疗过程中基因表达的变化，我们早期和晚期snap冷冻肿瘤的利用切片用于RNAseq分析的药物治疗，并将表达变化与自适应激肽反应，由MIB/MS测量。如所示，kinome基因的层次聚类MEK抑制反应中的表达显示出显著的差异与未经治疗的肿瘤相比，早期和晚期时间点的变化。收件人识别差异表达的激酶，我们进行DESeq2比较早期和晚期时间点控制肿瘤并可视化火山中的基因绘图(32). 在MEKi上一周后许多激酶的表达显著改变(). 的表达式Mek1/Map2k1和Mek2/Map2k2随着甲基苯丙胺1比墨西哥克2其他表达减少的激酶包括特征较差的丝氨酸/苏氨酸激酶Stk32a标准，Cdk18、Akt3、Epha3、，和阿尔克相反，治疗一周后收获的肿瘤表达增加成纤维细胞生长因子受体第二层和Fgfr3，以及Rps6ka1（p90Rsk），和Ddr1、，我们在之前的体外研究中观察到(52).
转录组分析揭示了反应中M-E-T表型的显著变化去曲美替尼。（A） 未治疗、早期和晚期肿瘤的RNAseq分析log2转化的RSEM标准化基因计数。显示分层聚类作为以平均值为中心的小鼠激酶基因的热图。（B） 火山图显示早期与未治疗肿瘤的log2折叠变化（RNAseq）与–log10调整后的p值（FDR=0.05），由DESeq2确定。虚线，p=0.05。（C） 火山图显示晚期与晚期的log2褶皱变化（RNAseq）未经治疗的肿瘤与–log10调整的p值对比（FDR=0.05）由DESeq2确定。虚线，p=0.05。（D） 对数2 LFQ强度（MIB结合）和Log2 RNAseq表达变化（早期与未治疗）对于通过MIB/MS定量的激酶（E）Log2 LFQ强度（MIB结合）和绘制激酶的Log2 RNAseq表达变化（晚期与未处理）通过MIB/MS.（F）未治疗、早期和晚期肿瘤的RNAseq数据进行量化用于Pathway Signature分析和聚类。代表来自每个集群的签名显示在右侧。（G） 记录2折叠变化为由DESeq2确定参与EMT的特定基因。（TRAMETINIB）火山图如（B）中的转录因子基因。（一） 火山图，如（C）所示转录因子基因。（J） 来自未经治疗、早期和晚期肿瘤。
在晚些时候，Mek1/Map2k1和Mek2/Map2k2没有显著改变(). 相反，激酶的表达包括Cdk18、Alk、Akt3、，和Stk32a标准是在曲美替尼治疗过程中，其减少程度更大治疗。另一种晚期基因表达增加的激酶包括Ntrk1号机组，神经营养受体酪氨酸激酶，它是对神经元的发育和生存很重要，可能在黑色素瘤(53). 此外，表达式非受体Src相关酪氨酸激酶高级管理人员，心想在角质形成细胞增殖中起作用，后期增加点(). 区别于早期时间点，淋巴细胞激酶的表达Itk公司和扎普70随着MEK抑制而增加。共同地，MEKi的慢性治疗导致肿瘤的持续生长早期和晚期特异性激酶表达的重编程时间点。
直接比较MIB/MS kinome图谱与RNAseq表达数据，我们绘制了每一次分析在激肽组中观察到的折叠变化(数字，). 在早期和晚期点，Mek1和Mek2的抑制几乎完全是药理作用，由MIB结合损失决定。相比之下Cdk18，以法3、以法7、，和Stk32a标准在与功能性MIB结合丧失相关的转录水平。RTK大都会和Efa1公司发现增加了RNAseq和MIB结合，同时RTK的表达配套元件仅在早期显著增加，但显示持续MEKi治疗过程中的功能性MIB结合(数字，). B淋巴细胞激酶Blk表达增加后期结合，但基因表达无变化。在一起RNAseq和kinome数据表明kinome的转录重编程这导致功能激酶的适应性改变用MIB捕获激酶的能力。
作为全球分析的另一种方法，我们采用了pathway基因表达特征分析(35). 使用一组先前发布的衍生基因签名根据人类转录谱，路径特征分数来自使用共享同源基因ID的小鼠肿瘤(). 路径特征的聚类容易被照亮通路活动的五种不同模式(;
补充数据S6A-D系列). 聚类1的高通路特征得分（与乳腺干细胞、基底型乳腺癌和成纤维细胞）未经治疗的控制肿瘤，但不包括MEKi治疗的肿瘤。因此，肿瘤似乎从间充质样表达模式转变为上皮样表达模式在MEKi上1周后。此外，相关路径的特征分数免疫应答（如T细胞、B细胞、CD8）增加，以应对MEKi。PI3K和AKT通路得分也表明生存前信号转导随着时间的推移而增加。尽管在各组中观察到一些异质性EMT_up和EMT_down的特征性得分下降和上升，随着时间的推移，MEKi上分别显示。因此，全球路径分析证实了这一点tdTomato阳性肿瘤细胞的持续生存和支持转移在治疗期间达到上皮状态和免疫反应。
由于通路分析表明上皮表型，我们研究了EMT相关基因(). 基因与上皮表型相关，如E-Cadherin，显著MEKi反应增强，而与间充质表型相关减少了。在MEKi期间，这些EMT相关基因的变化持续存在早期和晚期治疗组的治疗。基因列表富集分析Enrichr加强了这一发现，因为基因在早期和晚期时间点在“上皮”基因集中最为丰富小鼠基因图谱(补充图S6E-特拉梅蒂尼).
考虑到在我们的模型中观察到的转录组的巨大变化对MEKi的反应，我们推测谱系特异性转录因子可能推动观察到的表型转变。因此，我们对小鼠进行了研究作为离散基因子集的转录因子(数字，). 这个索克斯转录因子家族是神经嵴发育的关键参与者黑色素瘤发生(54，55). 针对MEKi，我们观察到上调Sox21系统和下调Sox5指数和Sox10型此外，其中两个在这两个时间点，转录因子发生最显著变化的是Zeb1号机组和Grhl2号机组（粒状头像2）。有趣的是，Zeb1号机组和Grhl2号机组已经是被证明参与了复杂的相互调节反馈回路控制乳腺癌EMT(56).由于转录组分析表明向上皮样表型转变在持续性肿瘤中，我们进行了免疫印迹并证实E-钙粘蛋白（CDH1）和泛细胞角蛋白对MEKi的反应增加().
对转录组的分析表明，适应性激酶组重新编程和胶原蛋白重组协同进行以促进黑色素瘤细胞在MEKi上长期存活的持久性。此外，而EMT被认为是抵抗BRAFi，我们的基因表达分析表明相反与对照组相比，药物治疗肿瘤的上皮特征。
BRAFi和MEKi联合治疗模型
虽然这些研究侧重于MEK抑制的奇异效应，但我们还利用达布雷尼和曲美替尼的组合治疗与单独使用BRAFi相比，提供了更持久的临床反应。BRAFi/MEKi联合治疗的肿瘤活体内成像显示基质胶原可塑性相似；然而，胶原蛋白区域早在药物治疗后两周就可以观察到独立的肿瘤细胞处理(). 正如预期，BRAFi/MEKi治疗导致肿瘤缩小，与单独使用MEKi相似，但长时间持续生长抑制().
MEKi和BRAFi的联合抑制也显示EMT_down信号和持续性黑色素瘤中的激肽组重编程。A） tdTomato+PBT黑色素瘤对BRAFi/MEKi联合治疗前和早期（5天）、中期（2周）和药物治疗晚期（11周）。最大强度投影；FV1000MPE；25倍；1050nm；4%功率。比例尺=50μm。B） 图形化使用和不使用BRAFi/MEKi时PBT肿瘤厚度随时间变化的表现随着时间的推移进行治疗。N≥6，12周除外N=2。误差=95%置信区间（C）分层聚类显示为以平均值为中心的热图，日志2-未经处理、早期、，晚期肿瘤如（D）Log所示2LFQ强度（MIB结合）和日志2RNAseq表达变化（早期与未治疗）绘制由MIB/MS定量的激酶。（E）Log2LFQ强度（MIB绑定）和日志2RNAseq表达变化（晚期vs未处理）绘制MIB/MS量化的激酶。（F）RNAseq数据来自未经治疗、早期和晚期肿瘤用于Pathway特征分析和群集。右侧显示了每个集群的代表性签名。（F） 未经治疗、早期和晚期肿瘤的免疫印迹，如（A）所示。使用ERK2作为加载控件。
未治疗的肿瘤和治疗1周（早期）或5-12周的肿瘤用BRAFi/MEKi收获了周（晚）。通过MIB/MS分析功能性激肽组，根据BRAFi/MEKi分离治疗肿瘤(;补充图S7A、S7B).始终观察到MEK抑制（BRAF有足够的独特肽未检测到定量），并且许多RTK表现出增加绑定-数字参考文献1，大都会，第6页，EphA1公司(补充图S7A、S7B).然而，BRAFi/MEKi的早期和晚期治疗组较少通过主成分分析比在仅对MEKi的响应(补充图S7C). 这一观察结果与报告了BRAF和MEK联合抑制的耐久性在整个实验过程中，我们在我们的模型中观察到肿瘤退化。
对肿瘤样本也进行了RNAseq观察到激肽表达模式(数字，;
补充图S7D系列). 将激酶表达变化与MIB/MS进行比较神经节轮廓。而MEK1和MEK2表现出明显的MIB结合缺失与MEKi治疗一致，表达、激酶的变化最小包括数字参考文献1，第二层、和第6部分表达水平增加与增强功能MIB绑定以响应BRAFi/MEKi。与单个代理相同MEKi，针对BRAFi/MEKi的转录因子表达分析显示增加Grhl2号机组并且减少了Zeb1号机组Sox转录因子的表达及其动态变化(补充数据S7E、S7F). RNAseq数据的通路特征分析证实了向更像上皮细胞的表型转变（EMT_up信号随着时间的推移而减少）和免疫浸润的证据（增加T细胞特征）().小鼠黑色素瘤的蛋白质印迹表明BRAFi/MEKi导致磷酸-MEK1/2的预期下降，而MEKi没有出现这种情况独自一人。当BRAF和磷酸化-MEK1/2水平在后期点反弹时，磷酸化ERK1/2的信号没有完全恢复，这与MEK MIB绑定。
验证我们对EMT因子和Sox变化的观察谱系转录因子，我们检查了临床数据和人类黑色素瘤细胞线。患者接受BRAFi或BRAFi/MEKi的临床数据分析揭示了转录因子的Sox家族在早期是高度动态的在治疗期间和进展时对MAPK通路抑制的反应(补充图S7G公司). 此外，对一组人类黑色素瘤细胞系的分析在EMT的基线和对BRAFi/MEKi的反应中表现出异质性标记物、Sox转录因子和RTK(). 我们的模型表现出与人细胞系SK-MEL-100-一种RTK反应，涉及c-套件以及向上皮样表型的转变，通过增加E-钙粘蛋白并且减少了连环蛋白总之，这些数据加强了我们的单药MEKi发现肿瘤发生适应性改变随着时间的推移，BRAFi/MEKi组合显示表型变化和持续性生存。
讨论
我们在诱导型GEM中开发了高度本地化的4-HT应用方法实现可重复时空控制黑色素瘤发展的模型老鼠耳朵。我们重复追踪了黑色素瘤从最初阶段的发展通过晚期肿瘤发生，然后使用长期纵向研究研究肿瘤对治疗的反应，密切模拟患者的临床反应设置。
我们的活体成像方法使我们能够从以下方面观察肿瘤的发生体内单细胞期。我们确定了黑色素瘤的几个可复制期发展。早期，我们观察到黑色素瘤细胞直接位于真皮中，在肿瘤发生前变得密集在人类中发生的沿径向扩散到真皮的病变。由2应用4-HT几个月后，黑色素瘤在真皮内垂直生长形成可触及且空间明确的肿瘤。
通过对黑色素瘤模型中MEKi的长期纵向研究，我们发现黑色素瘤细胞和捆绑的胶原的肿瘤内重组，随着上皮标记物的增强表达，在药物对肿瘤细胞存活的影响。SHG信号与tdTomato+细胞紧密相关在早期治疗阶段，表明对捆绑胶原蛋白的依赖模型初始肿瘤细胞存活。然而，在MEKi的后期，这种相关性被废除，黑色素瘤细胞的异种区域独立于胶原蛋白；以图形表示补充图S8.结构药物在不同阶段的瘤内差异，如肿瘤的存在晚期侵入软骨边界区域的巢穴MEKi可以支持保护机制，使药物能够长期存活。此外，虽然与捆绑胶原蛋白基质的直接相互作用在MEKi的晚期，肿瘤内总的来说胶原蛋白较多，与预处理相比。这些结果表明肿瘤僵硬是由于随着时间的推移，增强胶原蛋白沉积和肿瘤细胞重组可能促进对靶向治疗的抵抗。
此外，肿瘤生长的时空控制使我们能够执行药物体内分子可塑性的纵向和综合观点。MIB/MS数据分析显示胶原蛋白结合活性增强MAPKi早期的受体DDR1，促进胶原蛋白促进肿瘤细胞存活率对抗治疗。虽然表型转换通过“EMT”以前被描述为促进药物的一种手段相反，我们发现证据表明“MET”进展似乎提高抗MAPKi的黑色素瘤生存率。值得注意的是，一本小说“角蛋白高”和上皮样黑色素瘤亚类TCGA分析最近描述了与预后不良相关的人类皮肤黑色素瘤(57). 比较mRNA-seq以及药物治疗晚期和早期黑色素瘤的MIB/MS数据，我们有确定c-KIT、EPHA1、CDK5、BLK、PTK6和FGFR2/3是在此模型中对MEKi的功能性抵抗。这些发现在BRAFi/MEKi联合治疗肿瘤，并且与患者和人类细胞系模型中的反应。
通过在我们的模型系统中使用新方法的组合，我们设置了肿瘤生物学和治疗新发现和新认识的阶段响应。将我们的成像研究与转录组和激酶组重编程结合起来分析可以直接询问肿瘤可塑性体内在药物反应和特性鉴定及潜在治疗中促进抵抗的目标。使用这些新颖的方法，我们开发了一个能够直接观察内源性肿瘤发展、肿瘤异质性与内源性细胞水平靶向治疗的可塑性反应就地这些方法将促进我们对参与疾病进展的细胞过程，增加现有和未来的GEM模型，并帮助测试新的治疗方法恶性黑色素瘤。
