介绍
神经母细胞瘤(NB)是儿童中最常见的恶性实体瘤之一,由神经嵴衍生细胞产生,占儿童癌症相关死亡率的15%。NB的临床病程具有明显的异质性,包括自发缓解或快速进展和死亡1对于患有高危NB的患者,尽管应用了多种疗法,但临床结果仍然很差2尽管许多遗传异常例如染色体区域1q和17q的获得,MYCN公司染色体1p、3p和11q区的扩增和杂合性丢失被认为是预后不良的指标三NB的侵袭性和进展的机制仍需进一步研究,以改善患者的预后。
先前的研究表明,以42个氨基酸基序重复序列为特征的armadillo(ARM)家族蛋白在肿瘤发生和侵袭性中发挥着至关重要的作用。例如,β-连环蛋白4,δ-连环蛋白5,6、和第120页7具有致癌活性,但大肠腺瘤息肉病(空气污染指数)和犰狳重复序列X连锁蛋白1(ARMCX1系列)充当肿瘤抑制剂8β-catenin作为ARM家族成员,通过与淋巴增强因子/T细胞因子和E-cadherin的相互作用,在调节Wnt信号和粘附连接方面发挥重要作用9而APC通过与糖原合成酶激酶3β、酪蛋白激酶Ⅰ和axin在降解β-catenin中的协同作用调节Wnt信号10,11.过度表达ARMCX1系列抑制结肠癌细胞的依赖性和非依赖性生长12,在击倒时ARMCX1系列加速小鼠肝癌的发生13,表明了ARMCX1系列因此,确定ARM重复序列蛋白在肿瘤侵袭性和进展中的功能已成为一项紧迫的任务。
在目前的研究中,我们发现犰狳含有重复序列12(ARMC12系列)通过对公共数据集的综合分析,作为ARM家族成员与NB患者的不良预后相关。我们证明了这一点手臂12在临床NB标本中高度表达,并驱动NB细胞系的生长和侵袭性。机制研究表明,ARMC12与视网膜母细胞瘤结合蛋白4(RBBP4)发生物理性相互作用,促进多梳抑制复合物2(PRC2)的形成,并增加zeste 2多梳抑制复合体2亚单位(EZH2)增强子的组蛋白甲基转移酶活性,导致肿瘤抑制基因的转录抑制。此外,阻断ARMC12和RBBP4相互作用的细胞穿透抑制肽可抑制NB细胞的肿瘤发生和侵袭性,表明其具有ARMC12系列NB进展中。
结果
ARMC12系列促进NB细胞的生长和攻击性
自ARMC12系列表达与NB进展相关,我们探讨了ARMC12系列NB细胞系上的过度表达或敲除代表低或高表达水平。稳定转染ARMC12系列导致其在SH-SY5Y和SK-N-SH细胞中过度表达(图),同时耗尽ARMC12系列在BE(2)-C和IMR32细胞系中使用两个独立的短发夹RNA(shRNAsARMC12系列表达水平(图). MTT比色研究表明ARMC12系列与空载体(模拟)或干扰shRNA(sh-Scb;图). 软琼脂和基质凝胶侵袭试验表明,在稳定转染NB细胞后,NB细胞体外非锚定生长和侵袭能力得到增强和抑制ARMC12系列或sh-ARMC12#1(图). 与这些发现一致,在裸鼠中,NB细胞的生长和其形成的皮下异种移植物的肿瘤重量显著增加或减少是在稳定的过表达或沉默ARMC12系列,分别(图). 同时,在注射稳定过度表达SH-SY5Y细胞的裸鼠中,观察到肺中有更多的转移集落,生存概率较低ARMC12系列通过尾静脉(图). 相反,通过尾静脉注射BE(2)-C细胞治疗的裸鼠,其肺部转移集落较少,存活率更高,并且稳定地击倒ARMC12系列(图). 总之,这些结果表明ARMC12系列促进NB细胞系的生长和侵袭性。
ARMC12系列促进体外和体内NB细胞的生长和侵袭性。一,b条Western印迹分析表明在用空载体稳定转染的NB细胞中ARMC12的表达(模拟),ARMC12系列、扰乱shRNA(sh-Scb)或sh-ARMC12。c(c)MTT比色测定法,其描绘了用mock稳定转染的NB细胞的细胞活力的变化,ARMC12系列、sh-Scb或sh-ARMC12(n个 = 每个时间点6个)。d日软琼脂分析的代表性图像(左面板)和量化(右面板)显示了稳定转染模拟物的NB细胞的锚定非依赖性生长,ARMC12系列、sh-Scb或sh-ARMC12#1(n个 = 每组4个)。e(电子)基质凝胶侵袭试验的代表性图像(左面板)和量化(右面板)显示了稳定转染模拟物的NB细胞的侵袭能力,ARMC12系列、sh-Scb或sh-ARMC12#1(n个 = 每组4个)。(f)皮下注射稳定转染模拟细胞的SH-SY5Y和BE(2)-C细胞形成的异种移植物的代表性图像(上面板)、体内生长曲线(左下面板)和终点重量(右下面板),ARMC12系列sh-Scb或sh-ARMC12#1进入裸鼠的背侧翼(n个 = 每组5人)。克经尾静脉注射SH-SY5Y和BE(2)-C细胞稳定转染的裸鼠肺转移定植和Kaplan−Meier曲线的代表性图像(上面板)和量化(中面板),ARMC12系列、sh-Scb或sh-ARMC12#1(n个 = 每组5人)*P(P) < 0.01相对于mock或sh Scb。年Bonferroni多重比较试验的单向方差分析c(c); 未配对双面吨在中测试c−g; 生存率比较的log-rank检验克.NS,不显著。数据显示为平均值±s.e.m.(误差线),代表了一−e(电子)
ARMC12与RBBP4相互作用以促进EZH2活动
为了确定ARMC12的相互作用伙伴,进行了质谱分析,以鉴定通过空载体(模拟)或ARMC12系列通过比较模拟和ARMC12系列转染组。对每个细胞系中差异蛋白的重叠分析表明,PRC2的一种成分RBBP418,是由AMRC12型过度表达(图和补充表4). ARMC12和RBBP4蛋白之间的内源性物理相互作用通过联合免疫沉淀(co-IP)以及BE(2)-C和IMR32细胞中的western印迹进行验证(图). 为了解决他们的交互域,FLAG-taggedARMC12系列截断构建物与血凝素(HA)标记的基因共转染RBBP4型将载体导入SH-SY5Y细胞。Co-IP和western blot分析表明,ARMC12蛋白的ARM结构域[128-346氨基酸(aa)],尤其是ARM2(206-245 aa),而不是N末端(1-127 aa)或C末端(347-367 aa)对其与RBBP4的结合至关重要(图). 同时,HA标记的RBBP4蛋白的N末端(1–132 aa),而不是WD40结构域(133–414 aa)或C末端(415–435 aa)对其与ARMC12的结合至关重要(图). 我们通过诱变试验进一步研究了ARMC12和RBBP4之间相互作用的关键氨基酸。缬氨酸突变217ARMC12或缬氨酸ARM2结构域内的残基35RBBP4 N末端的残基消除了它们的相互作用(图). 值得注意的是,由于相似的分子量和ARM2结构域(补充图5a级和补充图5亿),两个FLAG标记蛋白ARMC12系列低丰度的变体也能与SH-SY5Y细胞中的RBBP4蛋白相互作用(补充图5厘米)促进NB细胞的非锚定生长和侵袭(附图5天和补充图第五版).
ARMC12与NB细胞中的RBBP4蛋白相互作用。一Co-IP、康马西蓝染色(左面板)和质谱(MS)分析(右面板)显示了用空载体(模拟)或ARMC12系列.b条Co-IP和western blot分析表明BE(2)-C和IMR32细胞中ARMC12和RBBP4蛋白之间的内源性相互作用。免疫球蛋白G(IgG)结合蛋白作为阴性对照。c(c)Co-IP和western blot分析(下面板)描述了转染模拟FLAG标记的SH-SY5Y细胞中ARMC12和RBBP4蛋白之间的相互作用ARMC12系列截断(上部面板)和HA-tagedRBBP4型.d日Co-IP和western blot分析(下表)显示了ARMC12和RBBP4蛋白在转染模拟、HA-tagg的SH-SY5Y细胞中的相互作用RBBP4型截断(上面板),并标记FLAG手臂12.e(电子),(f)Co-IP和western印迹(e(电子)、中间和右侧面板)和BiFC((f),箭头)测定,表明用野生型或突变体转染的SH-SY5Y细胞中ARMC12和RBBP4蛋白之间的相互作用(e(电子),左侧面板)标记了FLAGARMC12系列和HA-标记RBBP4型.比例尺:10μm。数据代表三个独立实验
由于之前的研究表明RBBP4是PRC2的一个组成部分18,我们进一步研究了ARMC12是否影响PRC2复合物的形成。Co-IP和western blot分析显示ARMC12系列分别促进和抑制SH-SY5Y、SK-N-SH、BE(2)-C和IMR32细胞中ARMC12与RBBP4、EZH2或zeste 12抑制剂(SUZ12)的相互作用(图). 击倒RBBP4型在BE(2)-C细胞中减弱ARMC12与EZH2或SUZ12之间的相互作用(图和补充图6). 然而,任何一方的沉默EZH2型或SUZ12型不影响ARMC12和RBBP4之间的物理相互作用(图和补充图6). 值得注意的是,EZH2的活性和组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)的表达水平在ARMC12系列分别稳定过度表达或沉默NB细胞(图). ARMC12表达与H3K27me3水平呈正相关(R(右) = 0.526,P(P) < 0.001,Pearson’s product-moment correlation analysis)在42个NB样本中检测到(补充图第7页和补充表5). 此外,静音RBBP4型或EZH2型阻止EZH2活性和H3K27me3水平升高ARMC12系列过度表达(图),同时转染RBBP4型或EZH2型挽救了NB细胞中EZH2活性和H3K27me3水平的降低ARMC12系列(图). 综上所述,这些数据表明ARMC12与RBBP4蛋白相互作用,促进NB细胞中PRC2复合物的形成和EZH2活性。
ARMC12系列促进PRC2复合物的形成和EZH2活性。一,b条Co-IP和western blot表明ARMC12与空载体稳定转染的SH-SY5Y和BE(2)-C细胞中RBBP4、EZH2或SUZ12的相互作用(模拟),ARMC12系列、加扰shRNA(sh-Scb)或sh-ARMC12#1。c(c)Co-IP和western blot显示稳定转染sh-Scb或sh-RBBP4#2的BE(2)-C细胞中ARMC12与RBBP4、EZH2或SUZ12的相互作用。d日Co-IP和western blot表明稳定转染sh-Scb、sh-RBBP4#2、sh-EZH2#1或sh-SUZ12#1的BE(2)-C细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用。e(电子)免疫荧光共聚焦图像显示稳定转染sh-Scb、sh-RBBP4#2、sh-EZH2#1或sh-SUZ12#1的BE(2)-C细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用。比例尺:10μm。(f)Western blot(上面板)和化学发光分析(下面板,n个 = 4个/组),表明稳定转染模拟物的NB细胞中的H3K27me3水平和EZH2活性,ARMC12系列,RBBP4型,EZH2型、sh-Scb、sh-ARMC12#1、sh-RBBP4#2或sh-EZH2#1*P(P) < 0.01 vs.模拟+sh-Scb(未配对双面吨在中对两组进行测试(f)). 数据显示为平均值±s.e.m.(误差线)和三个独立实验的代表
ARMC12系列抑制PRC2靶基因的表达
为了确定ARMC12系列为了了解其在肿瘤发生中的致癌作用,我们进行了RNA测序(RNA-seq)分析,以筛选用空载体(模拟)或ARMC12系列共有6125个基因,其中2901个上调基因和3224个下调基因在ARMC12系列过度表达(图). 进一步重叠分析ARMC12系列-公共数据集中的相关基因({“type”:“entrez geo”,“attrs”:{“text”:“GSE16476”,“term_id”:“16476”}GSE16476标准和{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE62564”,“term_id”:“62564“}}GSE62564标准)和ChIP-X数据库中的PRC2下游目标19(P(P) < 0.001,Fisher精确检验)表明14个下游基因受ARMC12显著调节(图). 微阵列挖掘({“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE16476”,“term_id”:“16476”}}GSE16476标准)和RNA-seq({“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE62564”,“term_id”:“62564“}}GSE62564标准)数据集表明,在这些靶基因中,细胞粘附分子1的表达(CADM1公司),egl-9家族低氧诱导因子3(EGLN3型),harakiri BCL2相互作用蛋白(人力资源部),硫酸乙酰肝素6-O-硫转移酶3(高铁6ST3)和SMAD家族成员9(SMAD9系列)与患者的良好预后显著相关(补充图7亿).
异位表达ARMC12系列抑制NB细胞中PRC2下游抑癌基因的表达。一火山图(左面板)、维恩图(中面板)和热图(右面板)揭示了用空载体(模拟)或手臂12。红色表示高表达,蓝色表示热图中低表达。b条ChIP和qPCR表明ARMC12、RBBP4、EZH2或H3K27me3(归一化为输入)在SH-SY5Y细胞中稳定转染模拟或ARMC12系列以及与干扰shRNA(sh-Scb)、sh-RBBP4#2或sh-EZH2#1共同转染的(n个 = 每组5人)。c(c),d日实时qRT-PCR(c(c),n个 = 每组5个)和western blot(d日)显示稳定转染模拟或ARMC12系列以及与sh-Scb、sh-RBBP4#2或sh-EZH2#1共同转染的*P(P) < 0.01 vs.模拟+sh-Scb。重叠分析的Fisher精确检验一; 不成对的双面吨测试中的两组b条和c(c)数据显示为平均值±s.e.m.(误差线),代表了b条−d日
由于上述证据揭示了ARMC12在促进PRC2复合物形成和EZH2活性中的作用,并结合了EZH2和H3K27me3在转录抑制中的重要作用20–22,我们进一步调查了AMRC12型PRC2靶基因的表达。染色质免疫沉淀(ChIP)和定量PCR(qPCR)检测显示ARMC12系列促进ARMC12、RBBP4、EZH2和H3K27me3与CADM1公司,EGLN3型,人力资源部,高铁6ST3、和SMAD9系列,分别(图). 此外ARMC12系列抑制NB细胞中这些靶基因的转录和蛋白质水平(图). 相反,击倒ARMC12系列减少ARMC12、RBBP4、EZH2和H3K27me3在靶基因启动子上的富集(图),并增加了CADM1公司,EGLN3型,人力资源部,高铁6ST3、和SMAD9系列在NB电池中(图). 重要的是,拯救实验表明RBBP4型或EZH2型废除启动子富集和表达的变化CADM1公司,EGLN3型,人力资源部,高铁6ST3、和SMAD9系列由过度表达或敲除ARMC12系列分别(图,). 同时,敲除或异位表达RBBP4型或EZH2型阻止SH-SY5Y和BE(2)-C细胞因过表达或沉默ARMC12系列,分别(补充图第8页a,补充图8b个,补充图第8页c和补充图8天). 这些结果表明ARMC12系列抑制NB细胞中PRC2下游抑癌靶点的表达。
击倒ARMC12系列增加NB细胞中PRC2下游抑癌基因的表达。一ChIP和qPCR表明ARMC12、RBBP4、EZH2或H3K27me3(归一化为输入)在稳定转染shRNA(sh-Scb)或sh-ARMC12#1的BE(2)-C细胞中的靶基因启动子上富集,以及那些与RBBP4型或EZH2型(n个 = 每组5人)。b条,c(c)实时qRT-PCR(b条,n个 = 每组5个)和western blot(c(c))显示稳定转染sh-Scb或sh-ARMC12#1的BE(2)-C细胞中目标基因(标准化为GAPDH)的转录物和蛋白质水平的分析,以及与RBBP4型或EZH2型. *P(P) < 0.01 vs.sh-Scb+模拟(未配对双面吨测试中的两组一和b条). 数据显示为平均值±s.e.m.(误差线)和三个独立实验的代表
阻断ARMC12-RBBP4相互作用的治疗肽
为了进一步研究ARMC12和RBBP4在NB细胞侵袭过程中的功能相互作用,我们设计了长度为23、24和25个氨基酸的细胞穿透抑制肽,命名为RBBP4结合肽23(RBP23)、RBP24和RBP25(图),这可能会阻止ARMC12和RBBP4之间的交互23用RBP23处理NB细胞,但不使用RBP24或RBP25,导致细胞核内肽明显聚集(图). 使用生物素标记肽的下拉试验表明,RBP23,而不是RBP24或RBP25,能够与BE(2)-C和IMR32细胞裂解液中的内源性RBBP4蛋白结合(图). 同时,RBP23处理BE(2)-C和IMR32细胞以剂量和时间依赖性的方式消除了ARMC12和RBBP4之间的内源性相互作用(图). 此外,用RBP23处理SH-SY5Y细胞可消除ARMC12、RBBP4、EZH2和H3K27me3在细胞启动子区的富集CADM1公司,EGLN3型,人力资源部,高铁6ST3、和SMAD9系列诱发因素ARMC12系列过度表达(图). 因此,这些基因在ARMC12系列通过RBP23处理挽救了过表达SH-SY5Y和SK-N-SH细胞(图).
抑制肽阻断NB细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用。一预测阻断ARMC12和RBBP4相互作用的抑制肽的结构和序列。b条共焦图像显示合成的抑制肽在培养的BE(2)-C细胞中的分布。比例尺:10μm。c(c)生物素标记肽下拉和western blot分析表明抑制肽(50μmol L−1)细胞裂解物中的RBBP4蛋白。d日Co-IP和western blot揭示了不同剂量的对照或抑制肽(RBP23)处理24 h或50μmol L后NB细胞中ARMC12和RBBP4之间的相互作用−1控制肽或RBP23用于指定的时间点。e(电子)ChIP和qPCR显示ARMC12、RBBP4、EZH2或H3K27me3(归一化为输入)在SH-SY5Y细胞中稳定转染模拟或ARMC12系列以及用抑制肽RBP23(50μmol L−1)24小时(n个 = 每组5人)。(f),克实时qRT-PCR((f),n个 = 每组5个)和western blot(克)指示SH-SY5Y细胞和SK-N-SH中靶基因(归一化为GAPDH)的表达ARMC12系列以及用抑制肽RBP23(50μmol L−1)持续24小时*P(P) < 0.01 vs.模拟+控制(未配对双面吨测试中的两组e(电子)和(f)). 数据显示为平均值±s.e.m.(误差线)和三个独立实验的代表
然后,我们在体内外研究了抑制肽对NB细胞肿瘤发生和侵袭性的治疗效果。RBP23以剂量和时间依赖性的方式抑制BE(2)-C和IMR32细胞的活性(图). 相比之下,RBP23处理未导致MCF 10A和HEK293活性的显著改变,未转化和转化的正常细胞缺乏ARMC12系列表达式(补充图5a级和补充图第8页)与用对照肽处理的药物相比(图). 此外,RBP23可显著抑制存活NB细胞的锚定非依赖性生长和侵袭性(图). 然后,在体内研究RBP23对皮下异种移植物生长和盲目随机裸鼠存活的治疗作用(图). 与对照肽治疗组相比,瘤内注射RBP23导致注射BE(2)-C细胞建立的皮下异种移植物的体积和重量显著减少(图). 的级别手臂12瘤内注射RBP23后,下游肿瘤抑制靶点明显增强(图). 在转移试验中,通过尾静脉给予RBP23显著减少了裸鼠BE(2)-C细胞形成的肺转移集落(图). 对数秩和检验表明,RBP23的给药明显延长了裸鼠的存活时间(图). 总之,这些结果表明,阻断ARMC12和RBBP4相互作用的抑制肽抑制了NB细胞的体内外生长和侵袭性。
抑制肽在体内外抑制NB细胞的肿瘤发生和侵袭性。一MTT比色法描述了NB细胞、非转化MCF 10A细胞和转化HEK293细胞在不同剂量的对照或抑制(RBP23)肽作用24小时或50μmol L−1所示时间点的控制肽或RBP23(n个 = 每组6个)。b条,c(c)软琼脂的代表性图像(左侧面板)和量化(右侧面板)(b条)和transwell基质凝胶入侵(c(c))用对照肽或RBP23(10μmol L−1)24小时(n个 = 每组4个)。d日裸鼠皮下注射BE(2)-C细胞形成的异种移植物的体内生长曲线(左下面板)、代表性图像(中上面板)、终点肿瘤重量(中下面板)和western blot检测的基因表达(右面板)(n个 = 5个/组),随后通过瘤内注射对照肽或RBP23(3 mg kg−1)如图所示(左上面板)。e(电子)裸鼠肺转移定植和Kaplan−Meier曲线的代表性图像(左图)和定量(中图)(右图)(n个 = 每组5只),尾静脉注射BE(2)-C细胞,随后给予对照肽或RBP23(3 mg kg−1)如图所示。比例尺:100μm*P(P) < 0.01与对照组。未配对双面吨在中测试a−e; 对数秩检验e(电子).NS,不显著。数据显示为平均值±s.e.m.(误差线),代表了一−c(c)
讨论
ARM基序重复序列最初是从犰狳中的基因果蝇属24自那时以来,一系列研究表明ARM重复序列在真核生物中得到了很好的保存,并且在犰狳重复蛋白中发现了许多同源模体25–27ARM蛋白家族成员通过其ARM重复域与许多不同的结合伙伴相互作用,并在细胞粘附、细胞接触、信号转导和肿瘤发生中发挥不同的基本功能25–27例如,犰狳含有重复序列的X-连锁3(ARMCX3)通过ARM重复结构域的物理相互作用调节性别决定区Y盒10(SOX10)的亚细胞定位和转录活性28在这项研究中,我们发现ARMC12系列作为与NB进展和患者不良预后相关的ARM成员。我们的初步证据还表明ARMC12系列与其他癌症类型的预后相关。此外,ARMC12系列发挥致癌功能,如促进NB细胞的生长和侵袭性。作为一种核蛋白,ARMC12通过ARM结构域与RBBP4蛋白相互作用,以增加PRC2复合物的形成并促进EZH2活性,从而抑制下游抑癌基因的转录(补充图第9页). 值得注意的是,我们的发现表明,尽管丰度低ARMC12系列变异体也可能在肿瘤发生和侵袭性中发挥类似的致癌功能,这值得进一步研究。同时,阻断ARMC12−RBBP4相互作用的抑制肽能够抑制肿瘤细胞的生物学特性,但对缺乏内源性ARMC12系列表达式。这种ARM重复蛋白的发现为NB的治疗干预迈出了一大步。
RBBP4作为WD40家族的一种普遍表达的核蛋白,最初是基于其与视网膜母细胞瘤蛋白羧基末端的相互作用而被鉴定的29随后的研究表明,RBBP4蛋白是参与染色质组装、重塑和核小体修饰的各种复合物的组成部分,包括Sin330,PRC218,核小体重塑因子31,组蛋白乙酰转移酶1(HAT1)32和染色质组装因子1(CAF1)33和在每种环境中扮演着非常不同的角色。RBBP4作为靶向分子,将组蛋白脱乙酰化酶、HAT1或CAF1带到组蛋白底物32,33已经表明RBBP4型在许多类型的人类肿瘤中,如肺癌,其表达升高并与恶性表型相关34,肝癌35、甲状腺癌36,急性髓细胞白血病37和急性淋巴细胞白血病37.监管不力RBBP4型与乳腺组织致癌有关38,39,并通过调节肿瘤抑制因子(视网膜母细胞瘤和第53页)或致癌(细胞周期蛋白D1和c-Myc公司)基因40在甲状腺癌中,RBBP4通过影响控制细胞周期进展的基因的功能来促进癌细胞的生长潜能36相反RBBP4型在辐射的宫颈癌细胞中诱导细胞周期停滞和凋亡,这与第53页视网膜母细胞瘤蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-841作为一种放射敏感性基因,RBBP4在乳腺癌和黑色素瘤细胞系中诱导放射增敏42这些发现表明RBBP4型以上下文相关的方式。在这项研究中,我们的证据表明RBBP4型与NB的不良预后相关,并促进NB细胞的生长和侵袭性,表明其在NB进展中的致癌作用。
已经确定PRC2是H3K27甲基化的主要甲基转移酶,基因启动子区H3K27me3的高水平通常与动植物中的转录抑制有关20–22PRC2复合物由四个核心亚单位组成,包括EZH2、SUZ12、胚胎外胚层发育(EED)和RBBP443PRC2的催化活性由EZH2赋予,而EED和SUZ12对于PRC2在H3K27甲基化中的完整性和活性是必要的20–22同时,RBBP4仅在亚集团域对H3K27me3至关重要44在本研究中,我们发现ARMC12以RBBP4依赖的方式增加EZH2活性和H3K27me3水平,并促进基因启动子上PRC2和H3K27me3的富集,导致影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的肿瘤抑制剂的转录抑制,如CADM1公司45,EGLN3型46,人力资源部47,高铁6ST348、和SMAD9系列49。我们注意到ARMC12系列挽救由EZH2型NB细胞中的敲除,表明AMRC12与RBBP4的结合可能导致PRC2的结构改变,从而促进EZH2在相对较低水平上表达的活性,这值得进一步研究。自击倒RBBP4型消除由ARMC12系列我们的证据表明,ARMC12的致癌作用至少部分是通过与RBBP4蛋白的相互作用介导的。
总之,我们已经证明了ARMC12系列高表达且与NB生存率低相关。ARMC12与RBBP4物理结合,增加PRC2复合物的形成和EZH2活性,导致与NB进展相关的下游肿瘤抑制靶点的基因表达受到抑制。通过给药细胞穿透抑制肽阻断ARMC12和RBBP4之间的相互作用,抑制NB细胞的体内外生长、侵袭和转移。由于与拷贝数改变缺乏关联或病例数量有限ARMC12系列在NB中仍有待确定。同时ARMC12系列和RBBP4型在肿瘤发生和侵袭性方面仍有待使用转基因或敲除动物模型进行验证。这项研究有助于扩展对肿瘤进展至关重要的基因的知识,并表明ARMC12系列和RBBP4型是治疗NB的潜在靶点。
方法
细胞系
人NB细胞系MYCN公司扩增(NB-1643、NB-1691、SK-N-BE(2)(CRL-2271)、IMR32(CCL-127)和BE(2)-C(CRL-2668))或无MYCN公司扩增(SH-SY5Y(CRL-2266)、SK-N-SH(HTB-11)和SK-N-AS(CRL-2137,通过短串联重复序列分析验证,并在冷冻小份复苏后6个月内使用。使用Lookout支原体PCR检测试剂盒(西格玛,密苏里州圣路易斯)定期检测支原体污染。NB细胞系和HEK293细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA)培养,而MCF 10A细胞则用含有5%马血清的DMEM/F12培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)和20 ng培养基培养左旋-1表皮生长因子(Peprotech,Rocky Hill,NJ)。细胞在37°C、5%CO的增湿环境中生长2.
基因的过度表达和敲除
人类ARMC12系列cDNA(1104 bp),EZH2型通过PCR从NB组织中获得cDNA(2256 bp)及其截短片段(补充表7)并如所指示的那样插入到相应的向量中。FLAG标记的表达载体ARMC12系列使用GeneTailor制备变体2和3TM(TM)使用补充表中所示PCR引物的定点突变系统(Invitrogen)7.人为截断RBBP4型cDNA(1278 bp),Didier Trouche博士馈赠的礼物51,使用PCR引物制备(补充表7)并亚克隆到pCMV-HA(Beyotime Biotechnology,中国上海)。的突变ARMC12系列或RBBP4型是由GeneTailor准备的TM(TM)定点诱变系统(Invitrogen),使用补充表中所示的PCR引物7.针对shRNAs的寡核苷酸ARMC12系列,RBBP4型,EZH2型,或SUZ12型(补充表7)插入GV102(中国上海通用化学有限公司)。用嘌呤霉素或新霉素(Invitrogen)筛选后,建立稳定的癌细胞。
实时定量RT-PCR和PCR
总RNA由RNeasy Mini Kit(加利福尼亚州红木市Qiagen Inc.)制备。采用转录因子第一链cDNA合成试剂盒(Roche)进行逆转录。对于实时RT-PCR,SYBR Green PCR Master Mix(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)和引物(补充表8)应用,转录水平由2决定−ΔΔ计算机断层扫描方法。使用QIAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen Inc.)分离基因组DNA。基因外显子内的遗传变异ARMC12系列使用引物对基因进行PCR分析(补充表8)和Sanger测序。
蛋白质印迹
用1×细胞裂解缓冲液(Promega)制备肿瘤细胞或组织蛋白。如前所述进行蛋白质印迹52–55,带有ARMC12(ab72704,Abcam,Cambridge,MA,1:1000稀释)、RBBP4(ab1765,Abcan,1:1000稀)、EZH2(ab191250,Abcam,1:1000稀释剂)、SUZ12(ab12073,Abca姆,1:500稀释)、H3K27me3(ab6002,Abcam1:1000稀释度)、HA(ab9110,Abcam-1:1000稀释率)、FLAG(ab125243,Abcam/1:1000稀释法)、,CADM1(ab3910,Abcam,1:500稀释)、EGLN3(ab30782,Abcan,1:1000稀释)、HRK(ab45419,Abcam,1:1000稀)、HS6ST3(SAB2101082,Sigma,1:500稀)、SMAD9(ab115900,Abcam.,1:500倍稀释)、组蛋白H3(ab1791,Abcam-,1:1000倍稀释)和GAPDH(ab8245,Abcam:1000稀释)。补充图中提供了斑点的未截取图像10.
Co-IP和质谱分析
Co-IP按照之前的报告进行56,使用10µg针对ARMC12(ab72704,Abcam)、RBBP4(ab1765,Abcam)、EZH2(ab191250,Abca姆)、SUZ12(ab12073,Abcan)、FLAG(ab125243,Abcam-)和HA(ab9110,Abcam.)的抗体。从珠结合复合物中释放出来后,用蛋白质印迹法测定蛋白质水平。斑点的未裁剪图像如补充图所示10为了进行蛋白质组分析,用胰蛋白酶消化蛋白质,并根据Invitrogen方案提取肽。在混合四极杆-TOF LC/MS/MS质谱仪上进行LC-MS/MS检测(TripleTOF 5600+,SCIEX,Redwood City,CA)。对于每个扫描周期,进行一次全扫描质谱(m/z范围为350至1500,电荷状态为2至5)和随后的40次MS/MS事件。使用ProteinPilot软件5.0和UniProt人类蛋白质数据库中的氨基酸序列分析MS/MS采集的数据。
双分子荧光互补(BiFC)分析
人类ARMC12系列cDNA(1104 bp)或RBBP4型cDNA(1278 bp)分别亚克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155中(Addgene,Cambridge,MA)。的突变ARMC12系列或RBBP4型与GeneTailor合作TM(TM)定点突变系统(Invitrogen)和PCR引物(补充表7). 在使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)联合转染重组构建物24小时后,肿瘤细胞在37°C下再生长10小时。在共焦显微镜下,检测荧光发射(分别以488 nm和500 nm作为激发波长和发射波长)。
免疫荧光共定位分析
细胞生长在盖玻片上,用5%的牛奶孵育1小时,并在4°C下用ARMC12(ab72704,Abcam,1:100稀释)或RBBP4(ab1765,Abcam,1:100溶解)特异性抗体处理过夜。然后,用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(ab150081,Abcam,1:1000稀释)或Alexa Fluor 594山羊抗兔-IgG(ab150160,Abcam,1:1000溶解)处理盖玻片,并用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,300 nmol L−1). 这些图像是在显微镜下拍摄的52.
靶基因拯救实验
为了拯救手臂12全长表达载体靶基因敲除水平的提高RBBP4型或EZH2型转染到稳定的细胞系中。恢复由ARMC12系列shRNAs转染RBBP4型或EZH2型(补充表7)使用Genesilencer转染试剂(Genlantis,San Diego,CA)导入肿瘤细胞。
染色质免疫沉淀
使用EZ-ChIP试剂盒进行ChIP分析(Upstate Biotechnology,Temacula,CA)52,56,57提取DNA并将其超声处理成200bp大小。对于实时qPCR分析,SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)和基因启动子特异性引物(补充表8)已应用。
EZH2催化活性分析
使用EZH2化学发光分析试剂盒(BPS Bioscience,San Diego,CA)检测EZH2-的组蛋白甲基转移酶(HMT)活性。简单地说,S-腺苷蛋氨酸(400μmol L−1)在96个预先涂有组蛋白H3肽底物的平板上与核提取物在1×HMT分析缓冲液中孵育1h。然后,用H3K27me3抗体(室温)孵育平板1h。用TBST缓冲液洗涤后,用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体孵育30 h min,然后添加HRP底物。使用光度计(瑞士苏黎世Tecan Schweiz AB)测量化学发光。
抑制肽的设计与合成
通过Peptiderive服务器设计用于阻断ARMC12和RBBP4相互作用的抑制肽23来自Tat蛋白转导域的11氨基酸长肽(YGRKKRRQRRR)作为细胞穿透肽。因此,通过在N端与生物素标记的细胞穿透肽连接,并在C端与异硫氰酸荧光素(FITC)结合,化学合成了抑制肽。肽的纯度(大于95%)通过反相高效液相色谱法进行验证。
生物素标记肽下拉分析
使用1×细胞裂解缓冲液(Promega)分离细胞蛋白,并在4°C下与生物素标记肽孵育过夜。然后,将细胞裂解物与链霉亲和素琼脂糖在4°C下孵育2 h。广泛清洗小球,并将提取的蛋白质用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和western blot。
细胞活力测定
肿瘤细胞(3×10三每个孔,每组6个孔)接种在96 well板中,用MTT(Sigma)比色法检测细胞活力56。所有实验重复三次。
软琼脂试验
肿瘤细胞(5×10三每孔)与0.05%诺贝尔琼脂混合,并在含有凝固0.1%诺贝尔琼脂(赛默飞世尔科学公司)的六孔板上培养21天。细胞集落用0.5%结晶紫染料染色,并在显微镜下计数52,57.
集落形成分析
肿瘤细胞(每孔300个细胞)在六孔板上培养21天。细胞集落用0.1%结晶紫染色,并计数集落数(超过50个细胞)58.
Matrigel侵犯分析
用Matrigel矩阵(BD Science,Sparks,MD)测量细胞侵袭能力52,54,55,57,59–61简单地说,饥饿的肿瘤细胞(1×105每个孔)添加到带有8.0-μm孔的Transwell嵌件的上腔中,并允许侵入24 h。侵入细胞用0.1%结晶紫染色10 min,并在显微镜下计数。
体内肿瘤发生和侵袭性检测
同济医学院动物护理委员会批准了所有动物研究(批准号:Y20080290),这些研究是根据NIH《实验动物护理和使用指南》进行的。将4周龄雌性BALB/c裸鼠随机分为两组(n个 = 皮下异种移植(1×10)6每只小鼠的肿瘤细胞)和实验性转移(0.4×106每只小鼠的肿瘤细胞)研究52,53,57,62在治疗研究中,裸鼠接受肿瘤细胞注射(1×106或0.4×106)分别位于背侧翼或通过尾静脉。两周后,如图所示,在随机分组的裸鼠中进行合成细胞穿透肽(中国肽,中国上海)的瘤内或尾静脉给药。对于每只小鼠,记录并分析肿瘤体积和存活时间的变化。
临床组织
同济医学院机构审查委员会批准了所有人体标本研究(批准号:2011-S085)。所有程序都是根据《赫尔辛基宣言》中的准则执行的。患者的所有法定监护人均出具了书面知情同意书。所有病例均未接受术前化疗或其他治疗。从中断妊娠中采集人类正常背根神经节。手术时收集新鲜肿瘤组织,并在−80°C下保存。补充表中描述了42例患者的人口统计学和临床病理学细节三正常人背神经节的总RNA购自Clontech(加州山景城)。从10名年龄匹配的健康儿童的外周血样本中获取,这些儿童在门诊接受健康儿童就诊。
免疫组织化学
如前所述进行免疫组织化学染色52,53,57,62,带有ARMC12(ab72704,Abcam,1:200稀释度)或RBBP4(ab1765,Abcam1:200稀释率)特异性抗体。为了评估反应性程度,对每个试样的十个不同的高功率场(×400)进行了盲目评估。染色强度的评估范围为0至3(0,阴性;1,弱阳性;2,中度阳性;3,强阳性),而阳性细胞百分比的评估范围则为0至4(0,阳性;1,阳性,1−25%;2,阳性,26−50%;3,阳性,51−75%;4,阳性,76−100%)。根据染色强度乘以阳性细胞百分比的乘积,免疫组化结果分为阴性(−,0-1)、轻度(+,2-3)、中度(++,4-8)和强阳性(+++,9-12)。中度(++)或强(++)反应性被定义为高表达,而阴性(−)或轻度阳性(+)反应性则被定义为低表达。
统计分析
数据显示为平均值的平均值±标准误差(标准误差,用图表中的误差条表示)。基因表达的截止值由平均值定义。Pearson chi-square检验、Bonferroni多重比较检验的方差分析(ANOVA)和Student’s吨实验用于比较肿瘤细胞或组织的差异。重叠或表达相关性的统计显著性分别通过Fisher精确检验和Pearson乘积矩相关分析确定。采用对数秩分析比较存活率的差异。采用双向统计分析。尽可能采用随机和盲法策略。动物队列大小是根据以前的类似研究确定的。
数据可用性
支持当前研究结果的RNA-seq数据已保存在GEO数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网站,带有登录代码{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE107516”,“term_id”:“107516”}}GSE107516). 本研究的桑格测序数据已保存在无花果中(https://无花果网,标识符为10.6084/m9.图6015881)。公共数据集可从GEO数据库中获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo网址,带有登录代码{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE14340”,“term_id”:“14340”}}4340英镑,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE16476”,“term_id”:“16476”}}GSE16476标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE62564”,“term_id”:“62564“}}GSE62564标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE10846”,“term_id”:“10846”}}GSE10846标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE21653”,“term_id”:“21653”}}GSE21653标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE24551”,“term_id”:“24551”}}GSE24551标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE17679”,“term_id”:“17679”}}GSE17679标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE37418”,“term_id”:“37418“}}GSE37418标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE19234”,“term_id”:“19234”}}GSE19234标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE42352”,“term_id”:“42352“}}GSE42352标准,{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE28735”,“term_id”:“28735”}}GSE28735标准、和{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE21032”,“term_id”:“21032”}}天然气21032)或癌症基因组图谱(TCGA)数据库(https://cancergenome.nih.gov网站,注册代码为TCGA-LAML、TCGA-LIHC、TCGA-HNSC、TCGA-LUAD和TCGA-KIRC)。拷贝数和遗传变异数据可从致癌组学数据库获得(https://pob.abcc.ncifcrf.gov/cgi-bin/JK,标识符为CHR0600P035815896),cBioPortal for Cancer Genomics(http://cbioportal.org,带有搜索词“ARMC12”),TARGET数据库(https://ocg.cancer.gov/programs/target/projects/神经母细胞瘤)和欧洲基因组现象档案(https://www.ebi.ac.uk/ega,登录代码为EGAD00001000282)。所有剩余数据均在文章和补充信息文件中提供,并可根据要求从相应作者处获得。