鲜血。作者手稿；PMC 2018年6月13日发布。
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Notch1的要求区分了发育过程中最终造血的2个阶段
密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学与细胞生物学系、分子生物学与药理学系、医学与免疫学系；马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室；凯斯西储大学遗传学系和俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰大学医院
摘要
已知Notch1在调节多种细胞类型的命运中起着关键作用，包括造血谱系的细胞。Notch1缺陷胚胎表现出的多重缺陷混淆了体内早期造血发育中Notch1功能的测定。为了克服这一局限性，我们研究了槽口1−/−胚胎干细胞体外分化和体内嵌合体分析。发现Notch1在ES细胞分化和体内对原始红细胞生成有不同的影响，这一结果反映了与发育中的小鼠胚胎相比，ES细胞分化期间Notch1表达的调节存在重要差异。在体外和体内，Notch1对于最终造血的开始是不可或缺的槽口1−/−在分化的ES细胞以及嵌合体小鼠的卵黄囊和早期胎肝中可以检测到明确的祖细胞。尽管事实上槽口1−/−细胞可以在早期发育中产生多种类型的最终祖细胞，槽口1−/−在嵌合体小鼠的野生型环境中，细胞在早期胎肝阶段后不能促进长期明确的造血。因此，Notch1是以细胞自主的方式建立长期、确定的造血干细胞（HSC）所必需的。
介绍
在成年哺乳动物、确定型或成年型中，造血细胞是在与常见前体造血干细胞（HSC）的连续分化过程中产生的。这种明确的HSC具有在成年受体中长期重建所有淋巴和髓系的独特能力。相反，在胚胎发生过程中，哺乳动物造血系统的发育以造血祖细胞形成的连续波为特征，其重建能力有限，随后才发展为最终的（成人样）HSC发育。发育过程中的第一个瞬时造血波出现在胚胎外卵黄囊的血岛上，由原始红细胞集落形成单位（CFU）祖细胞组成。这些CFU祖细胞在原肠胚形成后约7天至8.5天的短时间内被检测到，并产生原始有核红细胞，表达独特的胚胎型珠蛋白，构成发育中胚胎的第一个循环细胞。1第二波稍晚开始，包括形成明确的造血祖细胞，产生去核红细胞、巨噬细胞和粒细胞，细胞类型与成人相似。1,2虽然这些明确的祖细胞最初是在卵黄囊中发现的，但它们也出现在胚胎中较晚，反映了卵黄囊细胞通过新建立的循环和/或在最初称为主动脉旁内脏（P-Sp）的区域中自主胚胎内开始明确造血的迁移。三–6在早期阶段，这些明确的造血祖细胞自我更新能力有限，因为它们无法在成年受体中重建长期造血。因此，有人提出，这些祖细胞是第一批为胎儿肝脏播种的细胞，在那里它们大规模分化，形成循环中第一个功能明确的造血细胞，取代原始红细胞。1只有稍后才能检测到具有完全造血重建能力的明确HSC。7–9在卵黄囊和主动脉-中肾区（AGM）发育和/或成熟后，明确的HSC首先位于胎儿肝脏，最终位于骨髓，在发育的剩余阶段和成人中提供多系造血。早期明确的CFU祖细胞和后期多系造血干细胞（HSC）之间的确切关系尚不清楚（综述见Palis和Yoder10). 具体地说，这些早期明确的祖细胞是不成熟的胚胎HSC的后代，只有在发育后期才能获得成年再繁殖能力，还是它们来自不同于明确HSC的细胞群体？
发育性造血的不同阶段依赖于各种关键信号通路，这些通路与成人的信号通路既重叠又不同。Notch受体途径在胚胎和成人发育的各个方面都有明确的作用，包括通过控制许多组织中的分化、存活和/或增殖来决定细胞命运。11–16Notch1以及其他3种哺乳动物Notch同源物及其各自的配体在骨髓、胸腺、胎肝造血和/或基质细胞、发育中的卵黄囊血管系统和外周循环中以重叠和不同的模式表达，Notch蛋白在造血各个方面的作用17–23（有关审查，请参见Allman等人24还有Milner和Bigas25). 已建立的细胞系和骨髓衍生前体中Notch通路的激活表明，在造血祖细胞的水平上，Notch信号可以调节谱系决定或促进前体命运的维持，但牺牲了谱系特异性分化21,26–37（有关审查，请参见Ohishi等人38). 为了解决Notch1信号在成人造血中的体内作用，研究人员在新生小鼠体内使用了一种诱导性缺失槽口1或第个，共个RBP-J型作用于核复合体中，该复合体具有所有4个Notch受体的分裂胞内结构域。15,39–41这些实验表明，Notch1信号虽然对T淋巴细胞与B淋巴细胞的分化至关重要，但在成人造血的其他方面（如HSC的维持或红-髓系的分化）并不具有重要的生理作用。然而，造血的胚胎部位代表着不同于成人造血的环境，具有独特的调控要求。42–46因此，在出生后的小鼠中进行的这种性质的研究并不排除Notch1信号在造血系统胚胎发育期间具有额外功能的可能性。
最近的一项研究表明，Notch1在最终造血发育过程中起着关键作用。47体外培养经Notch1缺陷或γ-分泌酶抑制剂处理的9.5-dpc P-Sp组织，生成内皮细胞粘附床，但最终CFU数量严重减少。此外，通过使用从9.5-dpc Notch1缺陷胚胎中分离的细胞重建条件新生小鼠的造血，发现在无Notch1的情况下缺乏长期明确的HSC发育。Notch1在内皮细胞命运的各个方面发挥着关键作用（综述见Lawson和Weinstein48还有罗桑特和广岛49)和功能50–52（审查见Iso等人13)在重组分析中使用9.5-dpc胚胎中已经存在缺陷的Notch1缺陷组织来检测其在造血中的发育潜力，这给Notch1功能的解释带来了问题。例如，9.5 dpc的Notch1缺陷胚胎已经显示出血管系统的主要缺陷，包括背主动脉塌陷和卵黄囊中的血管形态发生缺陷53; 这可能会干扰HSC的发育，因为它被认为与这些部位的动脉内皮密切相关，或可能直接来自这些部位的动脉内皮。54,55因此，无法从Notch1缺陷胚胎中检测出长期HSC是否是细胞内在缺陷或环境缺陷的结果，还有待确定。
第二个尚未回答的重要问题是Notch1缺陷细胞如何在HSC发育之前促进胚胎外原始和最终CFU祖细胞形成的早期波。Notch1缺陷型胚胎在致死前卵黄囊中含有原始红细胞。53目前尚未对Notch1缺陷胚胎的原始红细胞生成进行时间分析，以排除数量差异。此外，尚不清楚Notch1缺陷细胞是否缺乏产生所有明确祖细胞的能力，包括在HSC发育之前检测到的祖细胞。56
为了解决有关Notch1在发育性造血中的功能的这些关键问题，同时避免Notch1缺陷小鼠早期死亡的并发症，我们制备了Notch1缺乏胚胎干细胞（ES），用于体外和体内分析。对于体内分析，我们使用了一种体细胞嵌合体方法，将LacZ标记（ROSA26）Notch1缺陷的ES细胞注射到野生型宿主囊胚中，并允许其在整个造血发育过程中进行，从而确定Notch1无效造血祖细胞对卵黄囊的贡献潜力，胎儿肝脏和骨髓造血。在该系统中，野生型细胞将提供Notch1的外源性需求，因此，Notch1缺陷细胞显示的缺陷将表明Notch1固有的功能。
材料和方法
ES细胞的衍生
纯合性小鼠ES细胞槽口1空突变（槽口1英寸32等位基因57)通过对杂合子ES细胞中剩余野生型等位基因的序列靶向构建槽口1突变等位基因。57有4个ES细胞系来源于CJ7亲本细胞系（1个野生型、1个杂合型和2个独立衍生的纯合子阴性槽口1细胞系）用于体外分化测定。所有ES细胞在丝裂霉素C处理的STO成纤维细胞饲养细胞或小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs；干细胞技术，温哥华，不列颠哥伦比亚省）上保持未分化状态，或在由Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、15%ES-筛查的胎牛血清（FBS；Hyclone，Logan，UT）、2 mM谷氨酰胺、，37°C，5%CO时，1 mM丙酮酸钠、0.1 mM非必需氨基酸、0.14 mM单硫代甘油和1000 U/mL白血病抑制因子（LIF；Chemicon，Temecula，CA）2。除非另有说明，否则所有化学品均来自西格玛（密苏里州圣路易斯）。
ES细胞向类胚体的分化
ES细胞在ES培养基中预分化2天，无饲养细胞（Iscoves改良Dulbecco培养基[IMDM]代替DMEM）。随后，对细胞进行胰蛋白酶消化以获得单细胞悬浮液，洗涤两次，将其接种在含有15%FBS（Hyclone，定义）、2 mM谷氨酰胺、0.14 mM单硫代甘油和50μg/mL抗坏血酸的IMDM培养皿中，并在分化的指定日收获用于造血集落分析。
在添加50μg/mL抗坏血酸的甲基纤维素培养基（M3234；干细胞技术）中，通过比较分化第6天和第12天EB的电镀效率和EB大小来表征类胚体（EB）的形成。
甲基纤维素中的集落形成单位（CFU）测定
将在不同分化日收集的EB汇集、胰蛋白酶化，并通过21号（21G）针传代以获得单细胞悬浮液，然后再悬浮在IMDM中。胚胎在不同发育阶段被解剖，并进行胰蛋白酶化或用胶原酶处理（干细胞技术），然后通过21G针传代获得单细胞悬浮液。一小部分细胞用于基因分型，引物如前所述。57,58对于较老的胚胎，在用胰蛋白酶或胶原酶处理之前，从胚胎中分离卵黄囊。胚胎用于基因分型。对于嵌合体胚胎，胚泡着床日期为3.5天（交配后3.5天）。为了从嵌合体进行CFU祖细胞分析，解剖卵黄囊（9.5 dpc至12.5 dpc）或胎肝（13.5至17.5 dpc），用胶原酶处理，并分离成单细胞悬浮液。出生后小鼠的骨髓样本制备方法类似，但未经胶原酶处理。
如前所述，检测EB或胚胎细胞的造血祖细胞。1,59使用了以下试剂和细胞因子：M3234甲基纤维素培养基（干细胞技术）；小鼠白细胞介素-3（IL-3，10 ng/mL）、IL-6（10 ng/mL）、IL-11（5 ng/mL（全部来自新泽西州落基山的Peprotech）；和人促红细胞生成素（3至5 U/mL；Amgen）。在初步实验（未显示）中，通过Wright-Giemsa染色和/或逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）确认菌落身份，以检测β-H1和β-主要球蛋白的表达，使用所述引物/条件。60
用5-溴-4-氯-3findolylβ-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）染色法对嵌合胚胎产生的集落进行染色，并对其进行评分：蓝色(LacZ公司+ES衍生）和非蓝色(LacZ公司−胚胎衍生）(). 在对照实验中，没有LacZ公司+从野生型胚胎中检测到菌落，100%的髓系和红系菌落来源于玫瑰26胚胎染成蓝色。
Notch1缺陷胚胎嵌合物的产生及造血分析(槽口1Δ1ROSA26标记的等位基因）或野生型（对照）细胞（A） 嵌合胚胎生成的示意图。主要槽口1−/−或含有ROSA26基因的野生型ES细胞系独立来源于囊胚。将这些ES系注射到野生型囊胚中以获得嵌合体胚胎。处于不同的发展阶段()卵黄囊（YS）、部分胎肝（FL）或骨髓（BMLacZ公司+染色组织的大体可视化细胞被纳入造血分析。造血集落用X-gal染色，CFU评分，以确定ES-derived的相对贡献率（LacZ+)和囊胚衍生（LacZ−)单元格。（B） 代表LacZ公司+来自嵌合胚胎Notch1缺陷（ES衍生）细胞的集落和LacZ公司−菌落来自槽口1+/+（胚胎衍生的）来自嵌合体胚胎的细胞。使用奥林巴斯60×/1.4油物镜对图像进行可视化。（C） 单个DNA样本LacZ公司−（胚胎衍生槽口1+/+)或LacZ公司+（ES-衍生槽口12−/−)分离菌落并用PCR对菌落进行基因型分析。
γ-分泌酶抑制剂治疗
单剂量γ-在指定的分化时间向分化EB的培养基中添加分泌酶抑制剂。11号院落（11号Cpd，M.Wolfe慷慨赠送61)，最终浓度为50μM。62对于DAPT(N个-[N个-（3,5-二氟苯基）-L-丙氨酸基]-[s]-苯甘氨酸丁酯）63–65（T.Golde慷慨赠送，目前可从加州圣地亚哥Calbiochem获得），使用浓度为1μM。两种抑制剂都是在二甲基亚砜（DMSO）中递送的。对于对照样品，仅添加载体DMSO。
LacZ标记ES细胞和嵌合体的产生
CD1小鼠携带一个Notch1受体无突变拷贝（槽口1Δ1)58与携带玫瑰βgeo26基因（ROSA26）66获得小鼠每个等位基因的杂合子。然后将这些小鼠杂交一代到SV129背景中，以提高ES衍生的效率。槽口1Δ1/+;俄罗斯26/+然后将（SV129第1代）小鼠进行杂交。使用预加热的M2培养基（新泽西州菲利普斯堡的Specialty Media）以3.5 dpc的速度从怀孕小鼠的子宫中冲洗囊胚，并转移到体外受精培养皿中（Costar 3260；马萨诸塞州剑桥市Costar）。在胚泡培养基（ES培养基，但含有25%FBS和2000U/mL LIF）中洗涤胚泡，并在矿物油下转移到单独的胚泡培养基滴中。或者，将囊胚转移到用0.1%明胶处理的60mm组织培养板上。孵育3至4天后，取出单个孵化囊胚的内细胞团，转移到含有35μL胰蛋白酶的96平皿中，并在37°C下孵育5分钟。重复移液后，将细胞转移到含有灭活MEF和200μL囊胚培养基的新鲜96周平板上。每天添加新鲜培养基。孵育4至6天后，将ES细胞集落转移到含有MEF的新微孔中。必要时，采集单个ES菌落并进行亚克隆，以去除污染细胞类型。细胞每隔2至3天传代一次，直到在T25培养瓶中，此时LIF和FBS浓度降低到常规ES培养基的浓度。所有ES系均进行了小鼠抗体产生（MAP）检测和核型分析。
为了产生嵌合胚胎和成年小鼠，玫瑰26+; 槽口1Δ1−/−和ROSA26；槽口1−/−将ES细胞注射到野生型C57Bl6或CD1囊胚中，并重新植入假孕鼠体内。确定总贡献LacZ公司+将ES-衍生细胞、胚胎或单个器官固定并用X-gal溶液（2 mM MgCl）染色2，5毫微米K三铁（CN）6，5毫微米K4铁（CN）6×3小时2O、 0.1%Triton-X和1 mg/mL X-gal，在磷酸盐缓冲盐水中（PBS]）。
Notch1蛋白表达分析
将处于不同分化阶段的混合EB样品在热的Laemmli缓冲液中溶解并煮沸5分钟。蛋白质水平通过连续样品稀释和考马斯染色进行半定量分析。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离平衡蛋白样品，转移到膜上，并用抗Notch1抗体进行免疫印迹。67
胚胎切片中活化Notch1（NICD）的染色
将约7.5 dpc的胚胎固定在Bouin固定剂中，嵌入石蜡中，并在6μm处连续切片。如前所述，使用抗体Val1744（Cell Signaling Technology，Beverly，MA）对切片进行Notch1细胞内结构域（NICD）染色。68对于细胞核复染，切片在双联苯胺（0.2μg/mL PBS）中孵育。在奥林巴斯IX70显微镜上进行荧光显微镜检查（奥林巴斯，纽约州梅尔维尔）。使用带有Metamorph 6.0软件的CoolSnap HQ冷却CCD相机拍摄图像（Universal Imaging，Downington，PA）。
EB和胚胎细胞的流式细胞术分析
EB或胚胎在胶原酶或胰蛋白酶中孵化，通过21G针传代数次，并通过70μm尼龙过滤器（Fisher，Hampton，NH）获得单细胞悬浮液。每个样品，5×105用染色缓冲液（加利福尼亚州圣地亚哥Pharmingen）冲洗细胞两次，并用抗鼠CD16/32（Pharminggen）封闭细胞。为了检测flk-1，将细胞与直接结合的一级抗体flk-1藻红蛋白（PE；Pharmingen）孵育。为了检测Notch1，细胞与Notch1胞外结构域（目录号06-809；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）的主要兔抗体孵育，然后是抗兔生物素（Vector，Burlingame，CA），最后是Streptavidin PE（Pharmingen）。使用CellQuest软件使用Becton Dickinson FACScan流式细胞仪（加利福尼亚州圣何塞）分析样本。
统计分析
如有指示，学生t吨检验用于确定统计显著性。
结果
缺乏槽口1不影响ES细胞增殖、EB形成或分化为flk-1+中胚层细胞
为了解决Notch1在早期发育造血各个方面的潜在作用，并规避Notch1缺陷胚胎的早期致死性，我们首先采用了一种常规部署的模型：体外ES细胞分化为造血前体。有2个独立推导槽口1−/−ES细胞系，a槽口1−/−ES细胞系和a槽口1−/−野生型亲本CJ7 ES细胞系，以等密度接种在STO成纤维细胞饲养层上，随后进行胰蛋白酶消化和计数。所有ES细胞系表现出相似的扩张速度(). 预分化2天的ES细胞在甲基纤维素培养基中以等密度培养，并在分化第6天对形成的EB总数进行计分。槽口1−/−ES细胞系表现出类似于胚状体形成的效率槽口1−/−和槽口1−/−ES细胞(). 此外，胚状体来源于槽口1−/−在液体培养中分化的ES细胞在分化第6天和第12天的大小与来自槽口1−/−和槽口1−/−ES细胞(). 包括造血和内皮血统在内的中胚层人群分化的最早标志物是flk-1，它是VEGF的受体。69为了确定这种早期细胞群的分化是否受到Notch1缺失的影响，我们通过荧光激活细胞转运体（FACS）分析检测了flk-1的表达。第3.75天Notch1缺陷型EB中flk-1表达细胞的百分比与槽口1杂合控制(). 总之，这些结果表明，在没有Notch1的情况下，ES增殖、EB板效率和生长以及早期flk-1祖细胞的分化没有显著改变。
Notch1缺陷型ES细胞系(槽口1英寸32等位基因）在早期flk1的增殖、胚胎体（EB）铺板效率或生长或分化方面没有缺陷+人口（A） ES细胞增殖曲线。第0天以5×10的密度培养ES细胞424孔板中的细胞/mL。在随后的几天里，对样品进行胰蛋白酶处理，并对总细胞数进行计数。值表示3个样本的平均值，误差条表示标准偏差（SD）。显示了野生型（+/+）、杂合型（+/-）和2个独立衍生的空ES系（−/−）。（B-C）ES细胞在无STO-neo饲养层但有LIF的情况下预分化2天，将其胰蛋白酶化，并在不含外源性细胞因子（B）的甲基纤维素中或在液体悬浮培养（C）中以2×10的密度进行培养4细胞/mL。在第4天（B）统计EB总数。在第6天和第12天，收集EB，并测量每个样品至少30个EB的最大直径（C）。数值表示一个实验中3次重复电镀的平均值，误差条表示SD。几个独立实验也获得了类似的结果。野生型（+/+），槽口1杂合（+/-），2个独立衍生槽口1空（−/−）ES细胞系。（D） 流式细胞术分析flk-1在槽口1−/−和槽口1+/−EB分化3.75天。将EB分离成单细胞悬浮液，并用与藻红蛋白结合的flk-1抗体染色。虚线所示的轮廓表示未染色的EB细胞。在两个独立实验中获得了类似的结果槽口1−/−和控制细胞系。显示M2窗口中的单元格百分比。
Notch1在胚胎体体外分化过程中调节原始红系集落形成祖细胞的数量，但在体内没有调节
体内和ES分化系统中第一批可检测到的造血祖细胞是原始红系祖细胞。为了定量检测Notch1是否调节这些祖细胞，将等量的EB细胞重新置于甲基纤维素培养基中，并对原始红细胞集落形成祖细胞（CFU-EryPs）的发育进行评分。对于2个不同的槽口1−/−ES细胞系，槽口1−/−EB持续产生的原始红系CFU-EryPs是两者的几倍槽口1+/+或槽口1+/−EB，在CFU-EryP形成的整个过程中().
缺口1缺陷(槽口1英寸32等位基因）和γ-分泌酶抑制剂处理的类胚体（EBs），但不是Notch1缺陷胚胎(槽口1Δ1等位基因），产生扩增的原始红细胞集落形成单位（CFU-EryP）祖细胞（A） EB在不同分化阶段形成原始红系祖细胞的动力学分析。在液体培养中分化2.5至9天的EB检测CFU-EryP。数值代表3次重复电镀的平均值。在分化4至6天的EB中进行的至少4个独立实验中获得了类似的结果。野生型（+/+），槽口1杂合（+/-），2个独立衍生槽口1检测空（−/−）ES细胞系。（B） 野生型EB在分化1.5、2.5或3.5天时用单剂量γ-分泌酶抑制剂11号Cpd（50μM）或仅用载体DMSO作为对照。然后在分化第5天检测原始红系祖细胞（CFU-EryP）。数值代表3次重复电镀的平均值。在一个独立的实验中也得到了类似的结果。（C） 野生型EB在分化第3.5天用单剂量γ-分泌酶抑制剂DAPT（1μM）或载体DMSO作为对照。然后在分化第4.75天检测原始红系祖细胞（CFU-EryP）(P（P）<.01，学生t吨测试）。数值代表3次重复电镀的平均值。（D） 从大约7.25天到8.5天，从Notch1-deficient CD1胚胎（−/−）或杂合和野生型（+/-或+/+）窝鼠对照中检测CFU-EryPs。每个时间点代表Notch1缺陷（−/−）或对照（+/−或+/+）同窝胚胎CFU的平均数量，其大致时间年龄基于形态学和/或体节数。在不同胚胎阶段进行的其他实验中也获得了本图中未显示的类似结果。近似表示近似。
我们之前已经证明，一种γ-分泌酶抑制剂通过抑制γ-分泌酶依赖的Notch蛋白膜内切割来减少Notch信号传导，它可以在相关的测定中，即胎儿胸腺器官培养中，重现Notch1信号传导减少的生物学效应。62为了测试γ-分泌酶抑制剂是否影响原始红系祖细胞扩增，我们检测了这些抑制剂对野生型EB造血潜能的影响。EBs在单个时间点用11号抑制剂进行治疗61,62或载体（DMSO）对照，在分化的第1.5、2.5或3.5天，然后在第5天检测CFU-EryP活性。分化第3.5天（接近原始红系祖细胞活性开始的时间点）使用11号Cpd进行治疗，导致第5天测定的CFU-EryPs显著增加(). 当第3.5天用不同的γ分泌酶抑制剂DAPT、，63,64,68并在第4.75天进行分析(). 在γ-分泌酶抑制剂存在的情况下，EB衍生CFU-EryPs的扩增与Notch1缺陷型ES细胞分化过程中观察到的表型一致，这表明当ES细胞分化为EB时Notch1信号减少或缺失时，CFU-Ery Ps扩增。
原始红系祖细胞（CFU-EryP）活性发生在从约7.0 dpc到8.5 dpc的早期发育短波中。1由于Notch1缺陷胚胎的血管缺陷和最终致死发生在造血的这一阶段之后，我们希望确定在Notch1缺乏ES细胞分化过程中观察到的原始红系祖细胞的扩增是否在缺乏Notch1的胚胎中得到了重现。在C57Bl6背景下进行的原始实验表明，该菌株的CFU-EryP活性波比之前报道的更短暂（在瑞士韦氏小鼠中），1使CFU-EryP活性的统计比较复杂化槽口1英寸32/英寸32胚胎和窝友控制了该菌株。为了避免这个问题，我们检测了CD1株小鼠的CFU-EryPs，这些小鼠携带的缺失等位基因为槽口1Δ,1表现出与槽口1英寸32/英寸32老鼠。58令人惊讶的是，我们发现在所检测的原始红细胞波的不同阶段，Notch1缺陷的胚胎产生的原始红系CFU祖细胞数量与野生型和杂合同卵对照相似().
在ES细胞体外分化和体内发育过程中观察到Notch1缺失对原始红细胞生成的不一致影响，一种可能的解释是这两个系统中Notch1表达或激活的调节方式不同。Notch1在正常发育环境外的异位表达和激活可能导致与生理无关的表型。在发育中的胚胎中，已经证明槽口1在6.5dpc时无法检测到mRNA表达，但在7.0-7.5dpc时变得明显，此时它主要局限于中胚层组织的特定亚群。17,23为了表征胚胎干细胞分化过程中Notch1的表达，我们首先使用特异性抗Notch1抗体进行了Western blot分析。67对分化不同天数的ES细胞和EB进行Notch1表达分析。在未分化的ES细胞和整个EB分化过程中很容易检测到Notch1蛋白(). 为了确定Notch1是否在培养的ES和EB细胞中广泛表达，或者是否仅在选定的细胞子集中表达，我们使用FACS分析了Notch1表达人群。与早期胚胎细胞相比，大多数ES细胞在分化前和早期EB分化期间持续表达Notch1，此时CFU祖细胞的原始红系波开始形成(). 这些结果表明，在体外EB分化过程中，Notch1表达在正常发育过程中的时间和组织特异性调节没有准确再现。
Notch1在ES细胞分化和体内的表达（A） EB分化过程中Notch1表达的Western blot分析。使用所示年龄（以天为单位）的ES细胞（在没有饲养细胞的情况下电镀）或EB裂解液中大致相等的总蛋白水平（通过连续稀释和考马斯染色确定），使用抗Notch1抗体（AN1）比较内源性Notch1蛋白水平。由于抗体是Notch1细胞内结构域的一部分，因此它检测到约120-kDa带，即Notch1的跨膜细胞内（TMIC）部分，该部分是在全长蛋白质转运到细胞表面的过程中形成的。还对作为阴性对照的Notch1缺陷ES细胞进行了分析。WT表示野生型。（B） FACS分析胚胎干细胞和发育中的类胚体（EBs）在不同分化日的Notch1表达。将ES或EB细胞处理成单细胞悬浮液，并用兔抗体对Notch1胞外区进行染色，然后用抗兔生物素次级染色，最后用链霉亲和素藻红蛋白染色。虚线所示的轮廓表示未经一级抗体染色的细胞。（C） FACS分析Notch1缺陷ES细胞系中Notch1的表达，该细胞系与B组分析的野生型细胞系处理相同。（D）FACS分析早期小鼠胚胎中的Notch1表达。大约8.25-dpc野生型胚胎被分离成单个细胞，并汇集用于与EB分析类似的分析。虚线所示的轮廓表示未经一级抗体染色的细胞。显示M2窗口中的单元格百分比。（E） 用Notch1（NICD）胞内结构域N末端抗体对大约7.5天的野生型胚胎切片中的Notch1活化表位进行染色。核染色用双苯甲酰亚胺（绿色）表示，NICD用红色表示。黄色细胞代表特定的核NICD染色。注意，NICD在胚胎固有中胚层（箭头）检测阳性，但在胚胎外区域的假定血岛聚集物中未检测到NICD（箭头）。在大约7.5 dpc的3个不同野生型胚胎的多个切片中观察到类似的染色模式。使用Olympus 100×/12.5油物镜对图像进行可视化。放大倍数，×100。
最后，我们在早期胚胎切片中检测了激活的Notch1与Notch1胞内结构域N末端特异性抗体（NICD，通过γ-分泌酶在跨膜区域切割Notch1形成）的积累。7.5 dpc时，在胚胎胚外中胚层的血岛中未检测到激活的Notch1表位，这是在该区域检测到原始红系祖细胞的时间点(，箭头）。1与报道的mRNA表达一致槽口1第二阶段三尽管如此，我们能够在胚胎中检测到Notch1似乎被激活的中胚层细胞子集(，箭头）。
体内无Notch1或分化ES细胞时，早期明确的造血祖细胞不受干扰
为了确定Notch1的缺乏是否影响早期决定性造血，我们首先检测了Notch1缺陷EB产生决定性红系和髓系CFU祖细胞的能力。这种早期明确的祖细胞活性可以在胚胎干细胞分化系统中检测到，在原始红细胞生成开始后出现一个波，对应于体内早期卵黄囊中原始和明确的CFU活性的相继出现。1将分化6至10天的EB细胞重新置于甲基纤维素培养基中，并加入适当的细胞因子，以检测各种明确的克隆免疫祖细胞，包括明确的红系（BFU-E，burst-forming unit–erythoid，)，髓细胞（CFU Mac，集落形成单位-巨噬细胞，; 和CFU-GM，集落形成单位-粒细胞/单核细胞，)和混合确定性（CFU-mix，包含红细胞和其他髓细胞，). 我们发现，来源于槽口1−/−EB相对于野生型和槽口1+/−在EB分化期间的任何时间点进行控制。此外，在所检测的任何谱系中，如果没有Notch1，菌落大小和形态都没有明显改变（未显示）。这些结果表明，尽管在ES细胞分化过程中，在没有Notch1的情况下，原始红细胞生成发生了改变，但在该系统中，最终祖细胞发育正常，没有Notchl。
缺口1缺陷(槽口132英寸等位基因）EB和早期胚胎显示正常的最终克隆形成单位（CFU）祖细胞活性对在液体培养中分化6、8或10天的（A-D）EB进行胰蛋白酶消化以获得单细胞悬浮液，并重新移植以检测以下明确的克隆形成祖细胞：（A）爆发形成单位-红系（BFU-E），（B）克隆形成单位-巨噬细胞（CFU-Mac），（C）克隆形成单元-粒细胞/单核细胞（CFU-GM），或用于（D）克隆形成单元-混合（CFU-mix）。数值表示3次重复电镀的平均值，误差线表示SD。在对分化10或12天的EB进行的独立实验中也获得了类似的结果。野生型（+/+），槽口1杂合（+/-），2个独立衍生槽口1检测了空（−/−）ES细胞系。（E-F）在不同发育阶段解剖Notch1缺陷胚胎或窝卵对照。将整个胚胎或切割的卵黄囊分散到单细胞悬浮液中，并在甲基纤维素中用细胞因子检测以下明确的克隆免疫祖细胞：（E）明确的红细胞（BFU-E）和（F）巨噬细胞（CFU-Mac）。每个时间点代表Notch1缺陷（−/−）或对照（+/−或+/+）同窝胚胎CFU的平均数量，其大致时间年龄基于形态学和/或体节数。误差条代表SD。在不同胚胎阶段进行的额外实验中也获得了此图中未显示的类似结果。
Notch1缺陷的胚胎在9.5 dpc时出现严重的血管缺陷，随后很快被吸收。53,57,58由于在8.5 dpc之前可以在卵黄囊中检测到第一个明确的红系和髓系祖细胞，1我们检测了Notch1缺陷胚胎中胚胎外明确造血祖细胞的发病情况。Notch1缺陷型和+/-和+/+同窝CD1胚胎卵黄囊中存在克隆形成单位（CFU）祖细胞(槽口1Δ1等位基因58)在7.5dpc以后的不同发育阶段进行了分析。在分化的早期阶段，最终红细胞（BFU-E，)和早期髓细胞（CFU-巨噬细胞，)从Notch1缺陷卵黄囊和对照窝卵黄囊中获得的祖细胞相似。此外，在Notch1缺陷胚胎中观察到的菌落大小和形态与同窝对照组没有差异（未显示）。这些结果表明，Notch1在卵黄囊最终造血开始中没有起关键作用，并且与缺乏Notch1的ES细胞分化的结果一致。
LacZ标记的（ROSA26）Notch1缺陷ES细胞有助于嵌合小鼠早期卵黄囊和胎肝中的最终造血CFU，但不能促进长期的最终造血
Notch1缺陷胚胎的发育在9 dpc后很快停止，很可能是由于血管重塑中广泛存在的严重缺陷。53由于能够在条件新生小鼠和成年小鼠中重建多系造血的HSC分别在大约9 dpc和10 dpc时才被检测到，确定来自Notch1缺陷的胚胎衍生组织的细胞的长期确定的HSC潜能的实验可能由于血管和其他发育缺陷而变得复杂。因此，为了确定Notch1是否对晚期胚胎的长期明确造血至关重要，以及这一需求是否在造血前体中是细胞自主的，我们制作了包含野生型细胞和Notch1缺陷细胞的嵌合体小鼠，这些细胞标记为玫瑰βgeo26（ROSA26）基因。我们导出标记（ROSA26）ES细胞（野生型、杂合型或纯合型槽口1轨迹）。然后将这些ES系注射到野生型囊胚中，以确定它们对嵌合体胚胎造血谱系的贡献潜力。
在不同的发育阶段，取嵌合体胚胎的卵黄囊或胎肝或出生后小鼠的骨髓，检测这些器官的细胞CFU潜能，然后用X-gal染色，以确定ES衍生的菌落的比例(). 将剩余的胚胎或单独解剖的器官固定，并用X-gal对整个支架进行染色，以确定LacZ公司+细胞。只有蓝染密度高的胚胎(LacZ公司+)大多数地区的细胞用于造血分析。使用2种不同的槽口1+/+;玫瑰26+对照ES系，我们发现LacZ公司+所有发育阶段的（ES衍生）最终菌落检查为25%或以上(). 与这些野生型对照ES细胞一样，在高比例嵌合体中观察到Notch1缺陷ES细胞对早期卵黄囊中最终CFU祖细胞群（9.5–10.5 dpc）的贡献相对较高(). 这与观察结果一致，即Notch1缺陷胚胎的卵黄囊中早期明确的造血功能没有严重受损。在卵黄囊（11.5–12.5 dpc）和胎肝（13.5–14.5 dpc）的后期LacZ公司+在明确的造血CFU中仍检测到Notch1缺陷细胞，其贡献相对减少(). 11.5 dpc或更高LacZ公司+（Notch1缺陷，ES衍生）克隆在所有检测的单个嵌合体中小于15%，平均为4%(). 菌落的大小和类型来源于LacZ公司+细胞与从LacZ公司−(槽口+/+，胚胎衍生）细胞（未显示）。从15.5 dpc到出生后发育，在胎肝或骨髓的任何CFU祖细胞中都不再检测到Notch1缺陷细胞()尽管Notch1缺陷的ES细胞在这些嵌合体中对其他器官的贡献率仍然很高（B.K.H.，未发表的数据，2004年）。3个独立的槽口1−/−ES克隆。相比之下，在对照组产生的嵌合体中未检测到标记CFU祖细胞的减少LacZ公司+（ROSA26）；槽口1+/+ES细胞。总的来说，这些结果表明，虽然Notch1对早期明确祖细胞的发育不是必需的，但细胞自主地对明确造血的长期贡献是必需的，这与Notch1在明确HSC发育中的关键作用一致。
表1
Notch1缺陷和野生型细胞对嵌合体小鼠最终造血的贡献
| Chimera年龄 | 器官化验 | 槽口1基因型 | 分析的嵌合体数量 | 不同ES线的数量 | LacZ CFU百分比 | 范围 |
|---|
| 9.5至10.5 | YS公司 | +/+ | 1 | 1 | 29 | |
| | −/− | 6 | 三 | 35±19 | 15–66 |
| 11.5至12.5 | YS公司 | +/+ | 1 | 1 | 33 | |
| | −/− | 8 | 2 | 4±5 | 0–14 |
| 13.5至14.5 | 佛罗里达州 | +/+ | 1 | 1 | 51 | |
| | −/− | 2 | 1 | 4.5 | 4–5 |
| 15.5至产后 | 飞行高度层/飞行高度层 | +/+ | 5 | 2 | 40±17 | 25–68 |
| | −/− | 10 | 三 | 0 | 0 |
讨论
Notch1缺陷的ES细胞系或所有Notch信号被γ-分泌酶抑制剂阻断的EB产生的EB比野生型和杂合型对应物或DMSO处理的对照组产生更多原始红系祖细胞，然而，Notch1缺陷胚胎和野生型或杂合同卵双胞胎在原始红系祖细胞潜能方面没有发现类似的差异。我们发现Notch1蛋白在胚胎干细胞和EB细胞分化过程中持续广泛表达，而之前的研究表明，在发育中的胚胎中槽口1mRNA表达开始于胚胎第6.5至7.5天17,23并在整个发展过程中保持时间和空间上的调制。此外，虽然我们可以在原始红系祖细胞出现在血岛（约7.0 dpc）内的发育过程中检测到活化特异性Notch1表位，但这些表位仅在胚胎中胚层中检测到，而不在推测的胚外血岛中检测到。因此，一种解释是，Notch1的缺失不会影响体内卵黄囊中原始红系CFU祖细胞的分化，因为Notch1在关键时刻在该组织中不活跃。然而，我们不能排除原始红系祖细胞的命运在迁移到胚外部位之前在胚胎中胚层中决定的可能性。70最近的研究表明，在分化的红系祖细胞之间检测到的数量差异运行x1+/+和运行x1+/−在运行x1+/+和运行x1+/−胚胎。71有人建议，由于体内造血早期胚胎波的快速动力学，可能无法检测到细微差异。因此，尽管不能排除Notch1在定量调节原始红系祖细胞形成中的微妙作用，但我们的体外和体内分析表明，Notch1不是原始红系祖细胞发育的重要因素。
除了对原始红细胞生成不必要外，我们还表明Notch1在HSC发育之前的早期、短暂的最终造血波中不需要在体外或体内进行。我们已经证明，基于几个标准，Notch1缺陷细胞能够产生早期明确的祖细胞。首先，在Notch1缺乏和野生型小鼠卵黄囊和EB中明确祖细胞出现的时间相似。我们观察到的时间序列与之前报道的另一种野生型小鼠株的时间序列相似1以及其他野生型ES生产线的EB。60其次，通过Wright-Giemsa染色（未显示），我们确认这些菌落包含代表最终造血的细胞类型（例如，BFU-Es，包含去核红细胞）。最后，我们发现，在13.5至14.5天的胎肝嵌合小鼠中，Notch1缺陷细胞仍对检测到的一小部分CFU祖细胞有贡献；因此，这些祖细胞不可能属于原始血统，因为原始祖细胞CFU活性在短发育期内（约7至8.5 dpc）仅局限于卵黄囊内。1
明确的HSC有能力在体内产生长期多系造血。为了确定Notch1活性是否是最终HSC发育所必需的，我们使用了一种强大的嵌合体方法，其中LacZ标记了Notch1−/−ES细胞可以与野生型细胞协同发育，从而评估Notch1的潜力−/−ES细胞有助于长期造血。我们明确表明Notch1在调节HSC前体的发育潜力方面起着直接和关键的作用。这些结果扩展了Kumano等人47通过表明在没有Notch1的情况下HSC发育的缺陷是一个细胞内事件。
缺乏关键造血转录因子SCL的小鼠存在原始和最终造血祖细胞缺陷，72因此与Notch1缺陷小鼠不同，在Notch1缺陷小鼠中保留了原始红细胞生成和早期决定性造血。表面上，缺乏转录因子Runx1的小鼠具有与Notch1缺陷小鼠相似的表型，因为没有明确的HSC。46,73然而，尽管Runx1缺陷胚胎和ES细胞不能产生任何类型的明确造血祖细胞，即使在早期卵黄囊中，46,59在这里，我们证明Notch1缺陷细胞可以促进早期明确的CFU祖细胞。造血发育中Notch1需求的这一独特方面表明终末期造血干细胞与其前体细胞分化的一个新阶段，这一阶段将自我更新的造血干细胞与寿命有限的早期终末期造血祖细胞区分开来(). 进一步研究以确定Notch1所必需的前体阶段的确切身份，需要能够在早期造血细胞与内皮细胞的不同发育阶段高效、特异地删除Notch1活性。这些研究将对造血干细胞的起源和性质产生新的见解。
发育性造血中的独特Notch1需求Notch1仅用于长期明确的造血干细胞隔室的发育，而对于早期、短期明确的造血祖细胞是不必要的，这些造血祖细胞在体外ES细胞分化的胚胎体和体内早期卵黄囊/胎肝中检测到。相反，关键的造血转录因子SCL是所有造血祖细胞（原始的和确定的）发育所必需的，72转录因子Runx1是所有确定但非原始祖细胞所必需的。46,59
致谢
我们感谢华盛顿大学医学院（WUSM）ES核心设施的E.Ross和J.Mudd；K.McGrath、J.Palis、K.Choi和P.Faloon提供技术建议；Mia Wallace（WUSM小鼠遗传学核心设施）和Yu Mei Wu进行胚泡注射；M.La Ragina用于MAP测试；谢家华（C.L.Xieh）对ES系进行核型分析；以及Longmore和Kopan实验室的成员进行批判性讨论和提出建议。我们还要感谢实验室的暑期学生Grace Wang。
由美国国立卫生研究院（NIH）资助的GM55479和HD044056，以及华盛顿大学/辉瑞生物医学研究计划（R.K.）；NIH授予CA75315，美国心脏协会授予9940116N。G.D.L.是美国心脏协会的资深研究员。B.K.H.得到了美国国立卫生研究院医学科学家培训计划的部分支持。
工具书类
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