p190RhoGAP使RhoA失活调节细胞扩散和通过促进膜突起和极性迁移

摘要

简介

Rho家族GTPases作为分子开关、转导来自细胞外环境的信号引发细胞反应比如基因表达、形态和迁移的变化(霍尔，1998;萨斯特里和伯里奇，2000年). 在14种已知的Rho蛋白中，Cdc42，Rac1和RhoA的特征最为明显(高井et（等）阿尔。, 2001). 每一种GTPase都通过以下途径促进细胞运动刺激肌动蛋白细胞骨架的重排。Cdc42和Rac1分别刺激丝足类和跛足类的形成(雷德利等人。, 1992;科兹马等人。, 1995;诺贝尔奖和霍尔，1995年). 这两种突起结构都允许细胞扩展到新的领域。因此，丝足纲和跛足纲是常见于扩张细胞周围和迁移细胞的前沿(霍尔，1998年). 此外，Cdc42是建立极性所必需的(Nobes and Hall，1999年;埃里克森和塞里昂，2001年).

活性RhoA刺激局部粘连和压力的形成纤维(Ridley和Hall，1992年). 这些结构的归纳是被认为是通过RhoA效应器Dia的协同活动发生的和Rho激酶/ROCK/ROK，但可能涉及其他靶点(木村et（等）阿尔。, 1996;瓦塔纳贝等人。, 1999). Rho激酶通过直接和间接刺激肌球蛋白的收缩力调节性肌球蛋白轻链磷酸化水平的升高(凯布奇等人。, 1999). 由此产生的肌球蛋白活化触发肌球蛋白丝的形成和丝状肌动蛋白的捆绑变成应力纤维。应力纤维施加的张力通过聚集整合素及其相关蛋白(Chrzanowska-Wodnicka和Burridge，1996年). RhoA的精确调节对于有效的细胞迁移至关重要。虽然一些RhoA活动是需要迁移，可能是为了保持与底物，高RhoA活性抑制运动(高石et（等）阿尔。, 1994;雷德利等人。, 1995;Nobes and Hall，1999年).

因为Rho蛋白参与动态细胞过程作为迁移，它们的活动受到积极因素和负调节器(Van Aelst和D’Souza-Schorey，1997年). 这些GTPases被鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）激活，这促进了GDP的释放，使GTP具有约束力，从而激活蛋白质。Rho蛋白在GTP水解为GDP，这是一种由以下因素增强的反应GTPase激活蛋白（GAP）。Rho GTPases也受提取Rho的鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂质膜蛋白质(奥洛夫森，1999年). 如何破译细胞外信号改变GEF、GAP和鸟嘌呤的活性核苷酸解离抑制剂对理解Rho家族GTPases的调节。最初人们假设粘附对于RhoA的激活是必要的，但还不够(Hotchin和Hall，1995年). 随后的研究表明，粘附力纤维连接蛋白或整合素与精氨酸、甘氨酸、，含有天冬氨酸（RGD）的肽足以刺激依赖RhoA的应力纤维(巴里等人。,1997).任等人。（1999年）直接测量RhoA活性，揭示了对纤维连接蛋白的粘附调节三相方式。RhoA被迅速短暂抑制（10–30min）当细胞首次与纤维连接蛋白结合时。这种初始失活是然后是一个峰值在60到90分钟之间的激活阶段最后一个阶段，RhoA活性在2-3小时后逐渐降低至水平略高于初始抑制水平。

我们在早期的研究中证明整合素触发的RhoA抑制由c-Src依赖性激活p190RhoGAP(亚瑟等人。,2000). 在这里，我们检查了RhoA的生物学意义细胞扩散和迁移中的失活。我们的结果表明p190RhoGAP对RhoA局部失活的反应整合素介导的粘附有助于高效细胞通过增强膜突起和细胞的扩散和迁移极性。

材料和方法

结果

p190RhoGAP对RhoA活性的粘附依赖性调节

研究p190RhoGAP在人胃癌中的生物学功能整合素介导的信号传导，我们产生了稳定表达显性阴性、GAP缺乏的Rat1成纤维细胞HA-p190RhoGAP型^1283A兰特（p190-RA细胞），空载体（模拟细胞），或野生型HA-p190RhoGAP过度表达（wt-p190单元格）。GAP缺陷型p190RhoGAP的表达以前是显示出对内源性蛋白质有显著的负面影响(亚瑟等人。2000年). 通过生成稳定的线，我们为表达低于以下水平p190RhoGAP的细胞选择需要诱导上述严重表型以细胞收缩和珠状延伸为特征(纹身et（等）阿尔。, 1998). 外源性p190RhoGAP变异体的表达水平大约是内源性p190RhoGAP的四到五倍并且对RhoA的表达没有影响（图​（图1A）。1A） ●●●●。

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图1

p190RhoGAP抑制粘着依赖方式。（A） 混合种群的表达水平稳定转染显性阴性和野生型Rat1细胞p190 Rho间隙。表达显性基因的Rat1细胞系的全细胞裂解物负HA-p190RhoGAP^1283A兰特（p190 RA），野生型HA-p190RhoGAP（wt-p190）或空向量（模拟）用抗HA或HA的单克隆抗体进行免疫印迹p190RhoGAP，用于评估外源性p190RhosGAP的表达水平变量或RhoA作为加载控件。（B） RhoA的类似水平对照细胞和表达显性阴性的细胞的活性p190RhoGAP，无粘附。模拟，wt-p190和p190-RA细胞以及转导C3转移酶或转染组分活性RhoA GEF（Lsc），呈阴性将阳性对照置于悬浮液中1小时，然后加入RhoA测定了活性。注：较长的胶片曝光显示可检测wt-p190细胞中活性RhoA的水平，但C3处理的细胞中没有转移酶。（C） p190RhoGAP是RhoA失活所必需的对纤维连接蛋白（FN）粘附的反应。Mock或p190 RA细胞在纤维连接蛋白上电镀0、10、20、30、45和60分钟然后进行裂解并进行RhoA活性分析。

检查外源野生型或显性阴性的影响p190RhoGAP，我们通过沉淀活性GTP-结合物来测量RhoA活性RhoA与GST-RBD(任等人。, 1999). 悬挂，模拟和p190-RA细胞具有相似水平的RhoA活性，而RhoAwt-p190细胞的活性水平降低（图​（图1B）。1B） 。RhoA公司用RhoA处理的模拟细胞也进行了活性评估抑制剂C3转移酶或转染交换因子Lsc作为阴性对照组和阳性对照组。C3类转移酶将RhoA活性降低到检测不到的水平，而表达Lsc的细胞中RhoA活性升高（图​（图1B）。1B） ●●●●。模拟细胞与纤维连接蛋白的粘附刺激了快速和短暂的RhoA活性降低（图​（图1C）。1C） ●●●●。然而，RhoA失活p190-RA细胞对纤维连接蛋白的反应被拮抗。细胞表达显性阴性p190RhoGAP的细胞在RhoA活性对纤维连接蛋白粘附的反应，但灭活作用大大减弱。这些数据与我们的以前的研究(亚瑟等人。2000年)并建议RhoA纤维连接蛋白刺激信号传导的抑制作用是通过以下途径介导的p190 Rho间隙。此外，这些数据表明鉴于显性阴性，内源性p190RhoGAP需要粘附这种GAP突变体可改变粘附细胞中的RhoA活性，但不影响粘附细胞中RhoA的活性悬浮细胞。

细胞内p190RhoGAP对肌动蛋白细胞骨架的调控传播

因为RhoA调节丝状肌动蛋白的组织，我们在细胞最初粘附时检查肌动蛋白细胞骨架纤维连接蛋白。我们发现模拟和wt-p190细胞在纤维连接蛋白在早期几乎没有应力纤维但在周围有大量富含F-肌动蛋白的褶皱和片状足电池的外围（图​（图2A）。2A） ●●●●。在相比之下，p190-RA成纤维细胞很少有皱褶或其他突起，但显示出强大的应力纤维。Rat1中这种表型被夸大用编码显性阴性的载体瞬时转染细胞HA-p190RhoGAP型^1283A兰特（图​（图2B）2B） 发现是对RhoA-特异性抑制剂C3转移酶敏感（数据不如图所示）。细胞中应力纤维的早熟发育在早期点表达显性阴性p190RhoGAP符合p190-RA细胞中观察到的RhoA活性升高（图​（图1C）。1C） ●●●●。模拟细胞在60分钟后形成应力纤维纤维连接蛋白（数据未显示），与RhoA的升高一致此时点这些单元格中的活动（图​（图1C）。1C） ●●●●。这些数据提示p190RhoGAP对RhoA的抑制对于防止细胞扩散时过早形成应力纤维纤维连接蛋白。

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图2

p190RhoGAP对于预防纤维连接蛋白上铺展的细胞中的过早应力纤维形成。瞬时模拟、p190-RA和wt-p190细胞（A）或Rat1细胞转染pEGFP-C1（GFP）或显性阴性pKH3-HA-p190Rho间隙^1283A兰特载体（B）被电镀在纤维连接蛋白作用20分钟，然后F-actin和HA表位（短暂仅转染）标记。注：图像的曝光时间细胞内肌动蛋白瞬时表达的形态HA-p190RhoGAP型^1283A兰特缩短以补偿强烈的卵磷脂标记。棒材，20μm。

p190RhoGAP对细胞扩散的调控

鉴于RhoA介导的收缩性抑制细胞膜突出物(罗特纳等人。, 1999;考克斯等人。,2001)纤维连接蛋白对RhoA的失活在细胞中被拮抗表达显性阴性p190RhoGAP（图​（图1C），1C） ，p190RhoGAP可能调节细胞扩散。为了验证这个假设，我们测量了粘附期间单个细胞的相对面积（图​（图3A）。三A） ●●●●。在早期传播时间点（20min），p190-RA细胞的面积明显小于模拟单元格。此外，wt-p190细胞的面积显著大于模拟细胞的面积。服用纤维连接蛋白3小时后，我们在模拟、p190-RA和wt-p190细胞（数据未显示）。确定是否减少p190-RA细胞的扩散是高RhoA活性的结果（图​（图1C），1C） ，RhoA特异性抑制剂C3转移酶被引入细胞。我们发现低剂量C3转移酶抑制RhoA部分挽救了p190-RA细胞传播的减少（图​（图3B）。三B） 。这些数据与RhoA所描述的作用一致增强膜突起的抑制作用(罗特纳等人。,1999)并提示p190RhoGAP对RhoA的失活有助于纤维连接蛋白上的高效细胞铺展。

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图3

p190RhoGAP抑制RhoA对于纤维连接蛋白上的高效细胞铺展。悬挂式模拟，p190-RA和wt-p190细胞（A）或模拟细胞和转GST或C3的p190-RA转移酶（B）在纤维连接蛋白上固定20分钟，然后考马斯蓝染色。中单个细胞的相对面积测量数字图像。控制的平均面积（模拟单元格）设置为100%。相对面积±SEM由以下公式计算得出四个独立实验的平均面积。

p190RhoGAP对细胞迁移的调控

传播过程中发生的信号传递和细胞骨架动力学细胞通常被认为是模拟迁移细胞。以前的研究已经证明p190RhoGAP定位于在扩散细胞与迁移细胞的前沿(Nakahara公司等人。, 1997;布龙等人。2000年). 我们发现内源性和稳定性亚细胞定位模式相似在Rat1细胞中表达HA标记的野生型或GAP缺陷型p190RhoGAP（未显示数据）。这些发现表明p190RhoGAP可能是激活的在活动细胞的前沿细胞外基质。与这个假设一致，我们发现亚融合p190-RA细胞的RhoA活性纤维连接蛋白在3小时内相对于模拟细胞升高（图​（图4）。4). 这些数据表明p190RhoGAP信号参与观察到的RhoA活性的最终下降当细胞被纤维连接蛋白覆盖2–3小时或更长时间时(任et（等）阿尔。, 1999). 正如预期的那样，wt-p190细胞中的RhoA活性较低。Cdc42和Rac1的活性也通过使用前面描述的技术(巴格罗迪亚等人。, 1998);然而，在模拟、wt-p190和p190-RA细胞系（数据未显示）。

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图4

p190RhoGAP对于维持低纤维连接蛋白细胞的基本RhoA活性。模型，wt-p190和p190-RA细胞被纤维连接蛋白包裹3小时，RhoA活性为仔细斟酌的。

为了进一步探讨p190RhoGAP在运动中的作用，我们检测了细胞迁移到单层伤口时的形态（图​（图5）。5). 我们发现p190-RA细胞相对而言，不太可能将膜突起伸入伤口区域模拟或wt-p190细胞。相反，wt-p190细胞通常延伸精细的生长锥状突起结构（图​（图5，5,箭头）。此外，模拟和wt-p190细胞，但不包括p190-RA细胞，伸入伤口。这些观察结果表明RhoAp190RhoGAP的抑制参与细胞伸长和迁移细胞膜突起的形成或维持。

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图5

p190RhoGAP促进膜突起和细胞伸长率。允许p190-RA和wt-p190细胞迁移到用德克萨斯红血球蛋白标记单层伤口3小时揭示肌动蛋白细胞骨架的形态。的位置分析开始时的伤口边缘用黑色表示箭头。模拟和wt-p190细胞，但不包括p190-RA细胞，伸入伤口。此外，wt-p190细胞经常延伸精心制作的锥形突起（白色箭头）。酒吧，20微米。

为了量化迁移，使用Transwell过滤器。过滤器的上下表面为用纤维连接蛋白包被，细胞被添加到上腔迁移被允许进行3小时（图​（图6A）。6A） ●●●●。我们发现迁移得到了加强在wt-p190细胞中。相反，p190-RA细胞显著减少与模拟单元相比，能够通过过滤器进行迁移。收件人确定p190-RA细胞迁移减少是否是由于RhoA信号过度，RhoA效应器Rho激酶被抑制带Y-27632(乌哈塔等人。，1997年a). 虽然Y-27632有对模拟细胞的运动没有显著改变抑制剂部分修复了p190-RA显示的迁移缺陷单元格（图​（图6B）。6B） 。这些数据以及我们的发现p190RhoGAP阴性使粘附细胞的基础RhoA活性升高（图​（图4），4)，支持我们的假设，即在p190RhoGAP的前沿增强了细胞迁移。

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图6

p190RhoGAP是有效迁移所必需的。（A） 使用涂有纤维连接蛋白的Transwell过滤器测量通过模拟、p190-RA和wt-p190细胞迁移。迁移的细胞对过滤器的下表面进行计数。（B） 类似分析用3μM Rho处理模拟和p190-RA细胞激酶特异性抑制剂Y-27632。对照细胞的平均数量通过过滤器迁移的（模拟细胞）设置为100%。这个根据通过四个单独的实验。

p190RhoGAP对建立极性的要求

虽然我们的扩散和伤口愈合数据暗示p190RhoGAP在调节膜突起方面，我们研究了额外的可能导致迁移缺陷的因素p190-RA细胞。我们最初观察到p190-RA细胞的细胞核与mock和wt-p190细胞（未显示）。因此，我们试图确定p190RhoGAP是建立细胞极性所必需的，即。，朝迁移方向定向的能力。为了解决这个问题在受伤的单层中标记细胞核和高尔基体（图​（图7）。7). 单层边缘的细胞如果高尔基体位于如前所述，核的伤口侧(库普费尔et（等）阿尔。, 1982;Nobes and Hall，1999年). 大约三分之二的模拟细胞和wt-p190细胞中的高尔基体正对着伤口。然而，我们发现p190-RA细胞极化率明显低于模拟或wt-p190细胞。事实上，p190-RA的极化伤口边缘的细胞与在汇合单层中观察到的随机分布。这些发现提示p190RhoGAP对RhoA的局部抑制对于细胞在迁移方向上建立极性增强膜突起。

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图7

p190RhoGAP对于建立极性。允许模拟、p190-RA和wt-p190细胞迁移到单层伤口2小时。细胞用三重标记Hoechst 33342、GM130（高尔基标记物）抗体和德克萨斯州红血球蛋白显示细胞核（蓝色）、高尔基体（绿色）和F-actin（红色）。棒材，20μm。伤口边缘的细胞如果高尔基球朝向伤口一侧，则得分为极化如前所述(库普费尔等人。,1982). 细胞中高尔基体面对任意点的细胞数汇合单层也被视为随机测量方向。极化细胞的百分比±SEM为由四个独立实验的平均值计算得出。

讨论

在这项研究中，我们研究了p190RhoGAP对粘连介导的RhoA失活。这方面的动力这项工作来自于几个早期的研究，其中涉及p190RhoGAP粘附反应信号。p190RhoGAP是酪氨酸抗体与β1整合素结合磷酸化(Nakahara公司等人。, 1997)，易位为与纤维连接蛋白粘附后的洗涤剂不溶部分(夏尔马，1998)与F-actin共同定位于跛足前突(Nakahara公司等人。, 1997;布龙等人。2000年).此外，我们之前在哪种整合素连接通过以下途径触发RhoA抑制c-Src依赖性激活p190RhoGAP(亚瑟等人。,2000).

这里我们显示p190RhoGAP对粘附依赖性RhoA的抑制是对于有效的细胞扩散和迁移是必要的。细胞表达显性阴性p190RhoGAP不能降低RhoA高基础水平的活动，导致过早应力纤维形成和传播受损。相反野生型p190RhoGAP促进细胞扩散。观察到p190RhoGAP定位于迁移细胞表明这种GAP在迁移过程中是活跃的。与此假设一致，RhoA活性在表达显性阴性p190RhoGAP的亚融合粘附细胞。在迁移细胞，显性阴性p190RhoGAP的表达受到抑制细胞伸长和膜突起，而这些行为在过度表达野生型p190RhoGAP的细胞中增强。因此，显性阴性p190RhoGAP的表达被抑制p190RhoGAP的过度表达增强了运动能力。有趣的是，显性阴性p190RhoGAP也阻断了细胞在迁移方向上建立极性。我们建议p190RhoGAP抑制RhoA是对粘附纤维连接蛋白通过增强细胞突起、伸长和极性。

细胞迁移是一个涉及细胞膜延伸的复杂过程前缘突出，形成粘连，细胞后部的分离和收缩(劳芬伯格和霍维茨，1996). 虽然Cdc42和Rac1已经得到了很好的证明活动对突起至关重要(Van Aelst和D’Souza-Schorey，1997)，其他研究表明，RhoA抑制也参与其中。将RhoA抑制剂C3转移酶引入细胞刺激膜皱褶(罗特纳等人。, 1999). 此外，野生型RhoA的表达(考克斯等人。, 2001)或构成性活跃RhoA（E.A.Cox和A.Huttenlocher，个人通信）抑制膜突起的延伸。这些研究支持我们的假设，即局部RhoA失活是通过p190RhoGAP是允许膜延伸的允许步骤。没有这种抑制，RhoA活性将在功能上对抗由于过度收缩而形成突起。因此，p190RhoGAP活性对RhoA的抑制有助于传播和迁移所需的活动。

最近的研究表明，非受体酪氨酸激酶FAK(任等人。2000年)，除c-Src和p190RhoGAP外(亚瑟等人。2000年)，对于初始纤维连接蛋白刺激RhoA失活。有趣的是，表型我们观察到在扩散的Rat1细胞中表达显性阴性p190RhoGAP类似于缺乏FAK的扩散细胞(西格等人。, 1999). 目前尚不清楚FAK是否参与RhoA抑制整合素→c-Src→p190RhoGAP信号机制或if它位于平行路径中。与FAK的观点一致参与c-Src介导的p190RhoGAP激活，FAK为空细胞粘附激活c-Src，但不能抑制RhoA(西格等人。, 1998;任等人。2000年). 此外支架作用被分配给FAK相关激酶Pyk2/CAKβ/CADTK/RAFTK，因为它结合c-Src和p190RhoGAP，并且介导c-Src对p190RhoGAP酪氨酸磷酸化的反应海格林(兹里汉·利赫特等人。2000年). 因此，这似乎是可能的FAK通过c-Src介导p190RhoGAP的酪氨酸磷酸化粘附反应，就像Pyk2在heregulin下游所做的那样刺激。有趣的是，马西埃罗等人。（1999年）最近显示FAK与p190RhoGAP在粘附细胞中共沉淀。

这项工作中的一个意外发现是p190RhoGAP的抑制导致细胞无法形成与迁移到受伤单层有关。极性迁移与选择性的跛足足突出和前缘的丝状伪足，前缘持续存在，以及抑制侧突(纳比，1999年). 它还与高尔基体和中心体朝向迁移方向的核(库普费尔等人。,1982;Euteneuer和Schliwa，1992年). 关于通过损伤单层膜启动的信号通路细胞骨架组织极化和定向迁移，尽管Cdc42活动是必要的(Nobes and Hall，1999年;埃里克森和Cerione，2001年). 我们首先怀疑p190RhoGAP在极性上的阴性形式可能是直接介导的，或者通过减少Cdc42活性间接。然而，我们没有检测到任何这种Rho家族蛋白活性的变化。一种可能性是RhoA活性升高抑制Cdc42下游的信号传导。或者，RhoA介导的收缩力可能发挥其通过反对形成或维持对极性的抑制作用突出结构的(罗特纳等人。, 1999;考克斯et（等）阿尔。, 2001). 在后一种功能对抗方案中这意味着突出的结构有助于极性的发展和是极化的上游高尔基的方位。在未来的工作中探索这些结构在控制细胞迁移的极性。

进一步证明p190RhoGAP对介导细胞极性来自对p190RhoGAP结合伙伴的研究，p120光栅。观察到p120RasGAP的招募p190RhoGAP与Src依赖的应力纤维分解相关由此得出结论，p120RasGAP对激活p190RhoGAP(埃利斯等人。, 1990;移民等人。, 1992;张等人。, 1995;范德格尔等人。, 1997;屋顶等人。, 1998;芬查姆et（等）阿尔。, 1999). 如果p120RasGAP有助于激活p190RhoGAP，则可以预测p120RasGAP或p190RhoGAP将产生类似的表型。引人注目的是，p120RasGAP空细胞在细胞伸长和极性方面存在缺陷，导致移民受损(库尔卡尼等人。2000年)，与我们观察到的表达显性阴性的Rat1细胞相似p190 Rho间隙。p190RhoGAP-p120RasGAP关联的重要性是进一步强调了抑制肽复合物损伤迁移和极化(库尔卡尼等人。2000年).

我们的研究结果和以往的研究结果共同促使我们提出粘附纤维连接蛋白的以下信号机制通过调节RhoA控制细胞行为（图​（图8）。8). 纤维连接蛋白RGD的结合整合素基序最初通过以下方式触发RhoA失活c-Src依赖性激活p190RhoGAP(亚瑟等人。,2000)，一种可能包括FAK的机制(任等人。,2000). p190RhoGAP对RhoA的抑制可减轻收缩力否则会塌陷展开所需的突出物。接下来，RhoA已激活(任等人。, 1999)，从而形成应力纤维的聚集和强大的附着力整合素形成局部粘连(克尔扎诺夫斯卡·沃德尼卡和伯里奇，1996年). RhoA通过粘附于纤维连接蛋白可能由全球环境基金的激活触发RGD位点与整合素的结合(巴里等人。,1997)或由纤维连接蛋白的肝素结合域触发syndecan-4信号(Woods and Couchman，1992年;布鲁姆et（等）阿尔。, 1999;萨翁切拉等人。, 1999)，或两者兼而有之。随后，RhoA活性降至较低的基础水平(任等人。, 1999). RhoA活性下降的机制随着时间的推移还没有确定，但我们的观察表明阴性p190RhoGAP在较长时间点升高RhoA活性表明p190RhoGAP参与了这种减少。本地化RhoAp190RhoGAP在前缘的抑制使细胞极化延长对细胞至关重要的膜突起迁移。在正在进行的研究中，我们正在调查信号通过纤连蛋白与RhoA结合来激活RhoA的成分合癸糖和整合素。

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图8

RhoA监管的拟议模型纤维连接蛋白。纤维连接蛋白粘附在三相中调节RhoA方式。RhoA最初被整合素触发抑制p190RhoGAP的c-Src依赖性激活。RhoA的失活是通过阻止Rho介导的有效细胞传播所必需的新生突起形成的收缩性。在第二次相位、整合素或syndecan信号触发应激纤维和通过激活RhoA形成焦点粘附。最后，RhoA活动基本活性降低。粘附细胞的基础RhoA活性低细胞至少部分是通过局部p190RhoGAP活性维持的对建立极性是必要的，有助于膜突起和细胞伸长。

致谢

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