我们专注于可共同利用的碳基质之间的生长转变21或那些密切相关且易于切换的,避免长时间生长停滞或异质生长特征8,9,11甚至稳态行为的特征也很差。我们首先通过种植野生型植物来研究营养物质的迁移大肠杆菌K-12菌株(NCM3722)在最小培养基中,以琥珀酸盐为唯一的碳底物。在指数增长期间,第二个共同利用的碳基质21添加(葡萄糖酸盐)(和方法)。600 nm(OD)处光密度的时间过程600纳米)细胞培养(细胞质量M的代表,),在整个过渡期间进行了测量(); 转变后不久,增长速度加快。核糖体含量(以RNA丰度报告16)众所周知,其增长速度超过细胞质量三,而分解代谢蛋白含量(通过在含有异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷、IPTG的培养基中诱导LacZ表达来报告15)花了几个小时才适应。最终,所有这些数量都以相同的速度增长,这是平衡增长所必需的。瞬时增长率,λ=dlnM(M)/d日吨,慢慢收敛到其最终值λ(f)经过几个小时(、和时间更长)。生物质合成通量,J型=天M(M)/d日吨,反应迅速:在升档后30分钟内达到最终增加速度(). 新RNA和LacZ的合成也观察到类似的快速反应(),在升档后一个质量内接近最终值(虚线的斜率)的表达水平(数据的斜率)加倍。
营养升档和降档大肠杆菌在最小培养基中生长的K-12(和诱导LacZ的IPTG)通过添加第二种营养素或耗尽营养素而发生移位。a–e,添加第二种营养素后上移:20 mM琥珀酸盐(持续存在),20 mM葡萄糖酸盐(仅在吨= 0).f–j营养素耗尽后降档:20 mM琥珀酸(持续存在),0.03%葡萄糖(约耗尽吨= 0).a、 (f)、光密度(OD600纳米,红色圆圈),RNA丰度(每培养体积的RNA数量,蓝色倒三角形),以及每培养体积LacZ活性,均与吨=0(绿色三角形),绘制时间。虚线的斜率表示最终增长率(升档,λ(f)=0.98小时−1; 降档,λ(f)=0.45小时−1).b、 克,瞬时增长率λ(吨)(红色钻石)。红色虚线表示λ(f).c、 小时,OD的时间导数600纳米(生物量通量,红色方块)。虚线的斜率表示λ(f).d、 e、i、j、绝对LacZ活性和RNA丰度与OD的关系图600纳米绿色和蓝色线条的斜率表示最终表达水平(定义为总蛋白的分数,参见补充注释2中的补充方程(8)); 橙色线的斜率表示转移后的预测表达水平。数据具有高度可重复性,请参阅在所有面板中,黑色曲线是FCR模型的无参数拟合预测,按照方法中的概述获得。
接下来,我们描述了由于培养基中营养成分的消耗而导致的营养物质向下转移的动力学,如莫诺德的双倍生长研究中所述1野生型细胞在饱和的琥珀酸盐和少量葡萄糖上生长():葡萄糖与琥珀酸共同利用21,细胞首先使用两种碳底物,并在葡萄糖耗尽后切换到只使用琥珀酸。此时,瞬时增长率λ(吨)急剧下降(). 在恢复过程中,RNA和LacZ()分别显示表达水平下降和增加(数据斜率),最终达到最终水平(虚线斜率)。升档和降档都是高度可重复的()在其他八对衬底上也观察到了类似的行为()和其他四对基板用于降档(),涵盖了广泛的初始和最终增长率组合。
中显示的恢复过程受监管互动的控制。尽管有丰富的分子知识,特别是关于四磷酸鸟苷(ppGpp)对核糖体合成的调节13,14,16,17以及cAMP-cAMP受体蛋白(cAMP-CRP)信号系统对碳分解代谢的调节12,15,缺乏对这些调控过程动态的定量描述。不包括基因调控动力学的模型无法一致地描述不同养分转移后的不同类型的恢复动力学(补充说明1和). 在这里,我们介绍了一个粗粒度动力学模型,该模型定量地纳入了分解代谢和蛋白质合成的调控,尽管缺乏描述分子过程的动力学参数。我们假设生长恢复的动力学受到许多关键内部代谢物(包括酮酸和氨基酸)丰度的限制11,22,我们将其粗粒化为一个“中央前体”池,因为这些代谢物通过快速可逆反应连接起来23。如所示,这个前驱物池被碳流入填满J型C类(方程式(1)in)在蛋白质合成过程中被核糖体耗尽。因为核糖体的翻译活性,σ(吨),数学上定义为平均翻译率24,由前体库设置,我们假设它在粗粒度时间尺度上进行调整,以便蛋白质合成的流量J型R(右)平衡碳流入J型C类(方程式(2a)和(2b)in).
FCR模型一流量平衡和蛋白质合成分配。碳底物S1和S2通过摄取丰富的Cat1和Cat2蛋白导入M(M)类别1和M(M)第2类按费率k个1和k个2分别是。这些底物外部浓度的变化导致碳流入的变化J型C类(红色,方程式(1)),提供了一个中央前体池(正方形)。这些前体被核糖体(Rb)消耗用于蛋白质合成,其通量J型R(右)(橙色,方程式(2b),带α作为从碳到蛋白质的转换因子)必须在粗粒度时间尺度上平衡碳流入的变化。对于给定数量的核糖体(丰度)达到这种蛋白质合成通量M(M)Rb公司)需要改变翻译活动σ如方程式(2a)所定义。分子上σ归因于前体库的变化16,24部分蛋白质合成通量分配给分解代谢和核糖体蛋白质的表达,M(M)Rb公司和M(M)类别1、2(方程式(3a)和(4a))。该分配由全球监管职能部门决定χ卢比(吨)和χ猫(吨),由前体池通过ppGpp进行分子设置(蓝色箭头)13,16和cAMP–CRP系统(绿色箭头)15以及特定于基层的法规小时1,2(补充说明3).b条、监管职能的形式和(黑线)可以从已知的稳态测量值中确定()导出于补充说明2.2d–f模型的中心简化假设是,生长过渡期间调节函数的时滞依赖性仅通过σ,如方程式(3b)和(4b)中明确表示的。
蛋白质合成的分配由基因调节功能决定:前体库的增加上调了核糖体的合成(蓝色,方程式(3a)))通过函数χRb公司(吨),由ppGpp信号控制13,14,16,17同时,分解代谢蛋白的合成(绿色,方程式(4a))被压抑通过χ猫(吨)并由cAMP–CRP信号系统控制12,15因此,这两种调节功能都依赖于前体库,前体库也设置了翻译活动σ.这些观察结果使我们形成了我们的关键方法,它关闭了模型方程并使其独立于分子细节:我们使用翻译活性σ(吨)设置监管职能χRb公司(吨)和χ猫(吨)通过稳态关系,和。后者如所示并从前面描述的“增长规律”中获得15,18(). 这在中的方程式(3b)和(4b)中明确说明相当于准静态假设(补充注释3和4). 通过构造,得到的粗粒度模型并没有试图解决非常快速的动力学过程,例如,向富介质迁移期间的核糖体振荡25然而,它描述了细胞生长和基因表达在较慢的时间尺度上的动力学,例如从大约10分钟到达到新的稳定状态,前提是生长过渡不涉及长时间的生长停滞8,这将使准静态近似无效。
我们将这种基因调控模型称为通量控制调控(FCR),因为关键的动态变量σ(吨)通过调节功能控制基因表达χRb公司和χ猫(方程式(3a)和(4a)in),由通量平衡条件设置(公式(2a)和(2b)). 组合中显示的所有方程式(详见补充注释4.1),我们得到了描述位移后动力学的单一非线性微分方程(吨> 0):
哪里和监管职能是否在.方程(5)可以用解析法求解(补充说明4.2). 这种逻辑式方程的时间刻度由速率设定μ(f),表示变换后介质中的最大碳吸收速率;它的值可以通过与稳态增长率的关系来确定λ(f)在换班后介质中,μ(f)≡λ(f)/(1 −λ(f)/λC类),其中λC类=1.17小时−1是生长定律中已知的应变特定常数(和补充说明2.3). 群众的时间进程M(M)(吨),核糖体M(M)Rb公司(吨),以及引入的所有其他数量可以从FCR模型中分析得出(补充注释4.4和方法). 对于许多宏观观察,第二个时间刻度由λ(f)在方程式(5)由于生长介导的遗传蛋白质组的缓慢稀释,已经松弛。
解决方案还需要指定初始条件σ(0),转换后直接进行的翻译活动。对于升档,这取决于升档时摄取系统Cat2(用于新添加的底物)的丰度,因为预先表达的Cat2导致碳流入的突然增加导致σ(0). 许多吸收系统在缺乏同源底物的情况下不表达,因此生物量通量J型(吨)和σ(吨)是连续的,并且方程式(5)能够在没有任何可调参数的情况下描述整个升档动力学(和,黑色面板)。
在某些情况下,我们观察到生物合成通量的突然跳跃J型(t) 升档瞬间(例如,请参见,)可能是由于Cat2在移前生长期间的表达。这种预表达式可以通过改变初始条件来适应FCR模型σ(0) (,黑线)。通过在移前生长期间综合预表达Cat2,流量突变的幅度J型(吨)在转变的时刻可以系统地改变,即使瞬时增长率暂时超过转变后状态的增长率(). 对于这些情况,FCR模型定量地预测了通量跳跃的幅度,如.
相同的FCR模型定量地捕获了共同利用的碳基质之间非常不同的降档动态(和,黑线)。在这里,使用具有既定Michaelis常数的Monod动力学来模拟碳底物消耗(补充说明4.2a),同样没有可调参数。底物耗尽后通量和生长速率下降的幅度由Cat2的表达水平决定,与仅底物S2相比,Cat2在两种底物上的生长过程中下调(补充注释4.2d和补充方程(57)). FCR模型进一步扩展,以捕捉分级使用的碳基质之间的生长变化,特别是聚合葡萄糖-乳糖二糖1(). 这里,诱导剂排除26防止乳糖的摄入和紫胶只要葡萄糖存在并被吸收,操纵子就会被激活。在不调用如何精确删除诱导子排除的详细信息的情况下,我们引入了紫胶操纵子作为孤立拟合参数(补充说明3.2g)并发现FCR模型也准确地描述了葡萄糖-乳糖二糖(,黑线)。
分级使用的碳基质之间的双氧水迁移一,大肠杆菌K-12生长在0.03%葡萄糖和0.2%乳糖上。最初,只使用葡萄糖1.大约时间吨=0的葡萄糖被耗尽,乳糖吸收和代谢被激活。红色虚线表示仅在乳糖上的生长速率,λ(f)=0.95小时−1.b条、瞬时增长率λ(吨)葡萄糖耗尽后突然下降,随后迅速恢复到λ(f)(水平虚线)。c(c),葡萄糖消耗后,生物量通量以增加的速率增加,然后达到最终速率。红色虚线的斜率表示λ(f),橙色虚线的斜率表示μ(f)
d日,乳糖分解代谢酶LacZ(绿色三角形)在转换前受到严格抑制(98 U ml−1OD处600纳米),然后在转移后迅速增加,然后稳定在绿色虚线斜率(1557 U ml)指示的最终表达水平−1OD处600纳米,仅从乳糖的稳态生长中获得)。带斜率的橙色虚线μ(f)/λ(f)×1557单位ml−1外径600纳米=7866单位毫升−1外径600纳米,是根据补充注释2的补充方程(18)黑色曲线是使用以下时间点对FCR理论的完整预测紫胶作为单个拟合参数的操纵子激活(参见补充说明3.2g).
考虑到模型的简单性,特别是缺乏自由参数,模型输出与实测观测值的定量一致性是显著的。如中所述,升档和降档显示出不同的恢复动力学,尽管受相同的基本监管策略控制。在升档时,蛋白质合成的重新分配很快就会解决(,虚线),分解代谢蛋白和核糖体丰度向其最终状态的生长介导的松弛是主要的恢复过程。在降档时,蛋白质合成的主动重新分配阶段跨越整个恢复(,虚线)。由于适应能力不同,升档主要受时间尺度的影响λ(f)−1,而降档主要是μ(f)−1(补充说明6和),解释了为什么(μ(f)=5.1小时−1)比升档快五倍(λ(f)=0.98小时−1). 在这两种转变中,尽管调节函数是从它们派生出来的,但它们并没有沿着稳态线滑动(补充说明2; 比较中的黑色线条和彩色线条).
考虑到克服代谢瓶颈所需的所需蛋白质数量很少,营养素转换后的完全恢复速度惊人地慢;例如,用于升档的Cat2和用于降档的Cat1不超过整个蛋白质组的百分之几。因此,如果按照最新的最佳生长转换策略理论,细胞只将蛋白质合成导向有限数量的瓶颈蛋白质,那么它们只需要加倍时间的百分之几就可以合成27,28相反,根据FCR模型,细胞采用了一种调节策略,其特点是蛋白质组的协调全球重塑远远超出了对少数特定蛋白质的调节,但包括例如大量与培养基中特定糖无关的合成代谢和分解代谢蛋白质。事实上,FCR模型对蛋白质组重塑动力学进行了定量预测:根据碳限制下的稳态反应对蛋白质组进行分类19,我们将在碳限制下增加、减少或不改变的蛋白质分为C↑、C↓和C−“部门”。因为分解代谢蛋白属于C↑,核糖体属于C↓19这些蛋白质组部门的动态,由调节功能分配χC↑和χC↓.,由监管职能部门在FCR模型中规定χ猫(吨)和χRb公司(吨)根据中的关系式(6a)和(6b),所有常数均由稳态蛋白质组分配固定(补充说明5). 扇区C↑和C↓的动态,表现为这些扇区中所有蛋白质的总质量分数的变化,表示为φC↑(吨)和φC↓(吨),然后由方程式(7a)和(7b)规定,如所示升档和降档产生的扇区动态定性地描述在分别是。
我们通过扩展定量质谱方法来测试这些预测19到动力学状态。显示了数百种蛋白质在向上和向下移动过程中丰度的时间依赖性变化我们观察到,蛋白质的动态反应符合其稳态分类:碳降档后,C↑蛋白质增加(绿色),C↓蛋白质减少(红色),而升档时则相反。C的大多数−蛋白质对养分转移几乎没有反应。蛋白质丰度的变化主要取决于蛋白质表达和生长介导的稀释,因为在过渡过程中降解作用微不足道(). 我们估计了属于这三个部分中每一部分的蛋白质的总丰度(见方法),并绘制了它们随时间变化的曲线(). 在整个过渡过程中,它们的动力学与模型预测(线)密切相关。同样的方法也被用于表征属于各种主要代谢途径或官能团的蛋白质的总丰度(和方法)。这些组在升档和降档时的动力学也基本上遵循了模型预测,但运动蛋白除外,运动蛋白在营养降档时明显表现出延迟。
恢复期间的蛋白质组组成一,单个蛋白质在,相对于预换档稳定状态(色标:对数2). 蛋白质根据其对碳限制降低生长速率的稳态反应(见方法)进行分组:C↑(增加;绿色)、C↓(减少;蓝色)和C−(无响应;黑色)19.b条,c(c),蛋白质部分的绝对蛋白质组分数φC↑,φC↓和φC−(符号)和非参数预测(线),假设C↑、C↓和C扇区中的所有蛋白质−遵循简单的全球分配规则(和补充说明5).d日,升档(实线和符号)和降档(虚线和开放符号)期间单个路径或蛋白质组的质量分数。颜色表示部门隶属关系。所有生物合成途径都遵循假设共同调控的理论预测。运动性表达式(右下角)是一个明显的例外,与表达式的预期增加值(虚线)相比,从降档恢复过程中的延迟增加了2小时。TCA,三羧酸。
模型预测与不带可调参数的蛋白质组数据的定量匹配表明,许多蛋白质组确实是共同调节的,由模型中假设的单一动态控制变量在整个生长转变过程中控制。在我们的模型中,这个动态变量是平移活动σ(吨),它本身是中央代谢物池的代理(例如酮酸和氨基酸),如所示因为在分子上,控制是通过信使cAMP来实现的12,15和ppGpp13,14,16,17,我们的结果表明,这两条信号通路通过中央代谢物池紧密耦合15,22这是全球监管控制的拟议驱动力。值得注意的是,即使是已知不受cAMP或ppGpp直接调控的途径,例如氨基酸合成,也会遵循碳转移后预测的全球反应,这可能是由于对转录或翻译资源的竞争16,17.
尽管这些信号具有中央调节作用,但生长过渡动力学对这些信号通路的动力学细节并不敏感,这一点可以从FCR模型的预测能力中得到证明,FCR模型并未明确包含信号。相反,动力学是由蛋白质合成和生长介导的稀释的全球重新分配的较慢时间尺度控制的。观察到的资源分配策略保持蛋白质组的全局协调,而不是按顺序优先处理各种瓶颈的表达27,28通过将代谢瓶颈限制在中心前体,这种保守的控制策略可能更加稳健,而中心前体推动全球监管控制(). 定量了解蛋白质组重建动力学是预测细胞动力学的先决条件,例如遗传回路的动力学或应力生长的动力学,使此处建立的框架成为理解其他动力学现象的广泛光谱的基础。
方法
没有使用统计方法预先确定样本量。这些实验不是随机化的,研究人员在实验和结果评估期间也没有对分配盲视。
生长培养基
本研究中使用的所有生长培养基均基于N-C最小培养基29,包含K2SO公司4(1克),K2高性能操作4·3小时2O(17.7克),千赫2人事军官4(4.7克),硫酸镁4·7小时2O(0.1克)和NaCl(2.5克)/升。用20mM NH补充培养基4氯作为氮源,各种碳源。必要时向培养基中添加1 mM IPTG,以完全诱导本机紫胶加入操纵子或0.1 mM IPTG诱导P拉卡-O1启动子驱动XylR用于可滴定表达dctA公司在应变NQ537中。的表达式聚氨基甲酸酯在指定浓度下添加3-甲基苄基醇(3MBA)诱导后,启动子被调节剂XylR激活。包括所有使用的碳源介质支持的稳态增长率。
培养程序
每个实验分三个步骤进行:种子培养、预培养和实验培养。实验前,将从−80°C甘油原料中提取的细胞接种在LB琼脂平板上。选取一个菌落,在37°C和250 r.p.m的摇晃水浴中的新鲜LB上生长。选择与实验培养物相同的预培养基。选择用洗过的种子培养物接种预培养物,使隔夜培养的预培养物在实验早上仍呈指数增长。细胞保存至少10倍(生长速度低于0.4小时时至少5倍−1)在37°C下的预培养中,在250 r.p.m下摇晃。选择早上接种到预加热的实验培养物中,以便在测量生长之前,细胞在37°C下至少再重复3次,并在250 r.p.m下摇动。
对于较小的培养体积,在20 mm×150 mm的玻璃试管中培养5 ml实验培养物。对于较大的容量,25 ml(100 ml)生长在125 ml(500 ml)带挡板的Erlenmeyer烧瓶中。在每个时间点,提取200μl样品,并在ThermoScific Genesys 20分光光度计中使用1 mm路径长度的Starna Sub-Micro试管在600 nm处测量光密度。
高精度光密度数据如所示使用流动细胞装置获得。将25 ml体积的实验培养物在37°C和250 r.p.m.的温度下在空气培养箱中的125 ml带挡板的Erlenmayer烧瓶中摇晃。使用蠕动泵使培养基循环通过流动细胞比色皿。外径600纳米使用LED光源(592 nm)和由微控制器控制的光电探测器进行测量。所有仪器和管道在空气培养箱内保持在37°C。
菌株
本研究中使用的所有菌株均来自野生型大肠杆菌K-12菌株NCM372230和总结如下.可滴定dctA公司如前所述构建表达菌株15简而言之,包含公里基因和聚氨基甲酸酯从质粒pKDPu中PCR扩增启动子并整合到大肠杆菌上游应变NQ351dctA公司(相对于的平移起点−1到−182 bpdctA公司),通过使用λ红色系统31.结果km-Pu-dctA将上述菌株中的P(P)拉卡-O1-木马R通过P1转导,产生菌株NQ530。构建可滴定的lacZ公司表达菌株,km-Pu-lacZ公司在里面补充方程(40)通过P1转导将其转入菌株NQ386,得到菌株NQ537。应变NQ381和NQ399已在前面进行了描述16.A型dctA公司敲除子通过P1转导途径从JW3496-1转移到NCM3722,产生菌株NQ1324。
β-半乳糖苷酶定量
β-半乳糖苷酶的定量基于Miller测定法32并如前所述使用15.
总RNA定量
RNA定量方法基于上述方法33按说明进行修改15.
总蛋白质定量
使用商业微BCA测定法对总蛋白进行定量。总之,通过离心收集1 ml样品,并将其储存在−80°C下,直至分析。为了进行分析,再次清洗细胞,将其重新悬浮在N-C培养基中,并以1:10稀释。接下来,在60°C的水浴中培养200μl稀释样品和200μl microBCA工作试剂。1小时后,将样品放在冰上,通过离心去除细胞碎片,并记录592 nm处的吸光度。每个分析都使用牛白蛋白血清标准物进行单独校准。
干质量量化
将150ml细胞培养物在带挡板的250ml烧瓶中生长至OD600纳米在37°C的水浴振动器中约为0.5。随后收集50 ml细胞培养物的三份样品,在冰水浴中摇晃冷却,并通过离心浓缩。每一步都记录上清液,并从OD中减去上清液600纳米正在读取。将所得颗粒转移到1.5 ml试管中,并在80°C下干燥过夜。用高精度天平测定颗粒的最终质量。
生长过渡质谱协议
我们使用定量质谱分析了升档和降档的动力学序列,如在大约两倍的时间内,我们为每个动力学转变收集了两个班前和六个对数间隔的班后样本,每个样本都包含OD下1ml液体培养物的等效生物量600纳米=1,17000离心收集克持续2分钟。为了使用质谱法实现轻/重相对定量,我们准备了一个15N稳定同位素标记参比物,包含稳态葡萄糖和琥珀酸-动物培养基培养物的1:1(w/w)混合物15全日空航空公司4氯。
在纯水中重新悬浮后,100μl混合液15含1 ml OD液体培养物当量的N参考600纳米=将1个细胞生物量添加到之前储存在−20°C下的每个样品细胞颗粒中。随后的样品处理,包括TCA沉淀、半胱氨酸还原、烷基化、胰蛋白酶消化和脱盐程序,如前所述进行24.
在与Sciex 5600 TripleTOF系统耦合的Eksigent NanoLC Ultra系统上分离色氨酸肽,并在数据依赖的鸟枪模式下进行分析(250 ms MS1扫描,然后40个150 ms MS2扫描周期)24每个样品注射两次,得到两个技术复制品。
如前所述24,供应商WIFF格式的仪器数据文件使用Sciex软件转换为轮廓和质心MZML格式。使用跨蛋白质管道34,以中心为中心的mzML文件被转换为mzXML并使用X!串联35违背习俗大肠杆菌数据库(来源于UniProt生物83333)。使用SpectraST将MS2搜索结果合并到原始光谱库和一致光谱库中。
MS1强度封套包含14N(轻)-和15使用最小二乘傅里叶变换卷积算法拟合N(重)标记离子19使用isodist实现36在Perl程序屠杀中实现37.相对14N个/15N比率被校正为不平衡15N参考移液管通过累积轻(样品)和重(参考)X的商!串联光谱计数大肠杆菌以每个样本为基础的肽。绝对蛋白质表达(即特定蛋白质的总蛋白质质量分数)通过X!串联肽-光谱匹配。
对于每次升档和降档,“绝对表达式数据”的时间序列可以表达式矩阵的形式表示E类m、 n个,带有时间序列(n个=1…8),以及蛋白质的数量,米,作为行。
以前分类为在碳限制下增加、减少或无反应的蛋白质19分为C↑、C↓和C−部门。24个以前未检测到的蛋白质19根据其线性响应的最近距离(升档和降档的平均值)和属于每个扇区的蛋白质的平均线性响应进行分类。
数据如所示使用相对表达数据,这些数据是通过将“绝对表达数据”标准化为预移位表达数据(一个数据点的平均值吨=−15分钟,以及换档前的第二个数据点)。如果两个换档前条目都为空,则无法将数据标准化并从分析中删除。此外,为了专注于高质量的表达数据,删除了包含四个以上空条目的行(蛋白质),总共得到米=647个蛋白质,提供于补充表1.数据为日志2在中转换并绘制为热图.
数据如所示使用“绝对表达数据”(即蛋白质的绝对质量分数)。单蛋白数据见补充表2.一个部门的丰富性X(X)在时间输入n个,φ十、 n个,通过蛋白质表达求和计算第页m、 n个所有条目米在蛋白质的条件下米是该行业的一个元素X(X),提供于补充表3蛋白质组的计算类似于蛋白质部分;所有蛋白质组的质量分数约为蛋白质组的60%。数据见补充表4蛋白质分类(部门和组)见补充表1.
脉冲标记质谱协议
细胞在含10 mM的N-C培养基中生长14全日空航空公司4氯是氮的唯一来源。在葡萄糖耗尽(降档)和添加葡萄糖酸盐(升档)时,细胞15通过添加脉冲来同位素标记N15全日空航空公司4Cl至10 mM。脉冲允许预移位蛋白质的分化(14N) 来自移位后产生的蛋白质(50%15N) ●●●●。我们收集了两个班前和六个班后样本(1个OD600纳米×ml总生物量)。A类15将N同位素富集参比物制备为稳态琥珀酸盐和葡萄糖最低限度培养基的1:1(w/w)混合物,在15全日空航空公司4Cl并如上所述添加到每个样品中。
数据采集和处理按照“生长转换质谱协议”中的描述进行。
MS1强度封套包含14N标记(预移位)离子,50%15N(位移后)离子,100%15使用isodist定量N-标记(恒定参考)离子36以符合三物种模型,包括50%15N-标记的信封。
数据可用性
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。