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方法摩尔生物学。作者手稿；2018年2月5日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2017; 1622: 161–184.
doi（操作界面）：10.1007/978-1-4939-7108-4_13
PMCID公司：PMC5798201
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院929640
PMID：28674809

基于RNAi的基因功能分析技术果蝇属生殖系干细胞

阿米莉亚·J·布莱克,丹妮尔·芬格,维多利亚·L·哈迪、和伊丽莎白·T·阿尔伯斯
版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

阐明促进干细胞维持的全部分子机制需要复杂的技术来鉴定和表征干细胞在其自然环境中的基因功能。果蝇卵巢生殖系干细胞，黑腹果蝇是研究体内驱动干细胞功能的复杂分子机制的理想模型。各种新的遗传工具使RNAi成为对传统遗传突变体的有益补充，用于研究指导卵巢生殖系干细胞功能的分子机制。在这里，我们为使用靶向RNAi敲除来发现卵巢生殖系干细胞及其后代的基因功能提供了详细的指导。

关键词：生殖系、生殖细胞、干细胞、，果蝇属、卵巢、卵子发生

1引言

与大多数分化为相同子细胞的特殊细胞不同，干细胞具有长期自我更新的特性[1]. 在细胞分裂过程中，干细胞保持其非特异性的命运，同时产生一个注定要分化的不完全相同的子代。发育中的胚胎和一些成人组织中的干细胞允许连续生产细胞，这些细胞可以被指示分化成各种特殊的命运。这种独特的能力，加上细胞重编程和基因编辑的最新进展，提高了临床对干细胞特性的兴趣[2]. 在再生治疗中安全有效地使用干细胞及其后代需要详细了解调节干细胞功能的分子因素。

干细胞自我更新的维持受到多种因素的影响，包括细胞的染色质状态、代谢状态以及对局部微环境（干细胞生态位）和长期生理线索的反应[三–6]. 因此，识别和表征驱动干细胞自我更新的分子途径需要一个模型系统，其中干细胞可以在其自然环境中观察和操作。虽然各种模型系统已被用于研究干细胞，但我们的许多基本干细胞功能模型是在果蝇体内进行的实验的结果，黑腹果蝇[7]. 像人类一样，果蝇属具有多种组织-受体干细胞群，这些干细胞群对持续生产特殊后代至关重要[8–12]. 轻松自如果蝇属被饲养，用于细胞特异性基因操作的多种遗传工具，以及许多人类和果蝇属细胞信号通路使果蝇成为生物医学研究的强大模型生物[13].果蝇属非常适合快速、大规模的基因筛查[14]以及转基因库、库存中心、基因组和生物信息学工具的可用性[15–18]使其成为在整个生物体范围内研究干细胞生物学的有效且成本效益高的资源。

特别是果蝇属卵巢为干细胞调控提供了基础性的见解。GSC是一种特殊的干细胞群体，用来补充生殖细胞（卵母细胞）的存量，生殖细胞的数量因配子的产生而耗尽。GSC位于由帽细胞和终丝细胞组成的体细胞龛中，位于每个卵泡的前端（成体的功能单位果蝇属卵巢；图1a)在一个称为生殖病院的专门结构中(图1b) [12,19]. GSC不对称分裂为自我更新，并产生一个分化的子细胞（成囊细胞），该子细胞随后经历四轮有丝分裂和不完全胞质分裂(图1b、c). 在这个过程中，生殖细胞被指定为卵母细胞或哺乳细胞的命运，卵母细胞将转变为减数分裂。病菌库中的所有生殖细胞都含有称为镰刀菌的内质网样细胞器(图1b、c)，GSC很容易通过其与体细胞帽细胞并置的前部定位的融合体来识别[20–23]. 额外的体细胞引导生殖细胞的发育。三角护卫细胞延伸出长的突起，使分裂的囊肿横向穿过生殖病院[24]. 卵泡细胞（第二群体干细胞的子代，即卵泡干细胞）包裹着每个生殖系囊肿，形成上皮单层，伴随着生殖系囊肿的发育而出[25–27]. 由此产生的卵泡经历了14个不同的发育阶段，最终形成可受精卵母细胞[19].

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果蝇属卵巢生殖系干细胞促进卵子发生。(a、 b条)果蝇属卵巢由15-20个卵泡组成（其中一个表现为一)，由一个病菌库组成(b条)以及不同发育阶段的一系列渐进卵泡。生殖病院有两个干细胞群体：生殖系干细胞（GSC；深绿色)卵泡干细胞（FSC；深红色). GSC位于由终丝细胞和帽细胞组成的体细胞生态位中(粉红色). 护送细胞(蓝色)帮助引导生殖系囊肿向后发育，在那里被卵泡细胞包裹(红色)形成卵泡（也称为卵泡室）。生殖细胞(绿色)分化为卵母细胞（oo）或滋养细胞（nc）。(c（c）)标记有抗血管紧张素的生殖菌的共焦显微照片（所有生殖细胞；绿色)抗Hts（梭形体和滤泡细胞膜；红色)、抗LaminC（帽细胞核膜；红色)和DAPI（所有核）。虚线指定GSC。比例尺=10微米

靶向RNA干扰（RNAi）是一种广泛使用的基因沉默实验技术，已成功应用于识别控制干细胞命运和增殖的新基因果蝇属[28–32]. 虽然基因突变等位基因的创建可能耗时费力，但针对感兴趣的目标生成RNAi相对容易且成本低廉[32–34]. 此外，虽然完全丧失功能的基因突变等位基因是有用的工具，但它们可能导致难以解释或发育致命的严重表型，从而妨碍对成体细胞的基因功能进行分析。相反，RNAi经常减少但不消除靶mRNA，从而导致低形态表型。通过使用无人机-GAL4系统，很容易实现发育中或成虫组织中基因敲除的空间控制(图2a). 在这个系统中，启动子或增强子元件驱动酵母转录因子的表达镀锌4[35]. 一旦表达，Gal4结合DNA反应元件，即上游激活序列(无人机)，位于包含与给定感兴趣基因完全互补的反向重复序列的基因片段之前。反向重复序列的表达导致双链RNA发夹的形成，在其表达的细胞中触发序列特异性RNAi沉默反应[36–39]. 因此，RNA发夹是在组织或细胞特异性驱动因子的控制下生成的，允许特定细胞群体中感兴趣的基因被靶向敲除。RNAi实验可以与额外的遗传工具相结合，将敲除限制在特定的时间窗口(镀锌80吨。;图2b)或在野生型环境中克隆细胞群体（用可抑制细胞标记进行镶嵌分析；MARCM）[40–42]. RNAi输入果蝇属因此，卵巢GSC提供了一个优雅的实验系统，以发现体内干细胞命运和功能的分子调控。

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使用无人机-GAL4系统。(一)处女组织特异性镀锌4驾驶员苍蝇被传给男性上游激活序列(无人机)-RNA干扰应答苍蝇（UAS-IR），导致发夹表达和RNAi介导的基因敲除在所有子代的特定细胞中。(b条)用于临时控制镀锌4表达式，镀锌4驾驶员苍蝇也携带一种转基因，其中Gal4抑制剂，高尔夫球80支，被普遍表达。在产生的后代中，Gal4的表达与温度有关。18°C，Gal80ts秒结合Gal4，抑制发夹生成。在29°C下，Gal80的构象ts秒蛋白质发生变化，使其不再与Gal4结合，从而使Gal4可以启动无人机系统RNAi

在该方案中，我们提供了一种实验策略，利用靶向RNAi敲除果蝇属卵巢GSCs。该协议可用于分析GSC及其子代中任意数量基因的功能，特别适用于基因发现。通常，协议的阶段包括（1）选择或创建适当的无人机系统RNAi针对感兴趣基因的转基因株系，（2）选择种系特异性镀锌4驾驶员（3）果蝇属饲养产生转基因苍蝇，（4）解剖成人卵巢，（5）免疫染色，（6）共焦显微镜图像采集，以及（7）图像分析。该基本协议还为进一步分析干细胞功能提供了一个平台，包括基因表达、细胞周期进展以及已知的GSC自我更新和子细胞分化标记。结合其他最近出版的方法[43–49]，该协议突出了果蝇属卵巢GSC作为在其自然环境中研究干细胞功能的模型。

2材料

2.1果蝇菌株和培养

  1. 果蝇属菌株(看见 附注1)，包括种系兼容无人机系统RNAi应答株和一种种属特异性镀锌4应变。
  2. 瓶装和小瓶装标准苍蝇培养基（玉米粉/糖蜜/酵母/琼脂）(看见 附注2).
  3. 酵母膏：1–1干活性酵母混合物(看见 附注3)和蒸馏水混合成光滑花生酱的稠度。在4°C温度下用Parafilm覆盖储存，以防干燥。
  4. 解剖体视显微镜，双鹅颈照明，0.6–4倍放大范围，平坦的黑色解剖底座，配备飞垫和空气针以输送CO2(果蝇属麻醉剂；看见 附注4).

2.2卵巢解剖和免疫染色

  1. 1.5 mL预涂微量离心管(看见 附注5).
  2. 15-mL聚丙烯离心管。
  3. 50毫升聚丙烯离心管。
  4. 玻璃或有机玻璃解剖盘。
  5. Kimwipes公司。
  6. 巴斯德玻璃吸管和灯泡。
  7. 两对锋利的镊子（INOX，Dumont#5，Biologie尖）。
  8. 两个27×1¼规格的针头，带1 mL注射器。
  9. 冷室安全轨道章动器（也称为陀螺混合器）。
  10. 不含添加剂的Grace昆虫培养基（Lonza；看见 附注6).
  11. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
  12. 洗涤溶液：PBS中0.1%Triton-X-100。
  13. 固定剂：格雷斯培养基中5.3%的甲醛(看见 附注7). 解剖前进行新鲜准备。对于每个样品，添加300μL 16%甲醛（Ted Pella；看见 附注8)和600μL Grace的介质。保持在冰上。
  14. 封闭溶液：5%牛血清白蛋白（BSA），5%正常山羊血清，0.1%Triton-X-100在PBS中(看见 附注9). 使用无菌技术制备，并在4°C下保存。如果多云，则丢弃。
  15. 初级抗体：在几乎所有的初始实验中，我们使用两种初级抗体来识别卵巢中的生殖系和体细胞(看见 图3c、d). 小鼠抗-Hts（1B1-s；发育研究杂交瘤库）在封闭溶液中稀释至最终浓度为1:10，并标记种系特异性融合体和卵泡细胞质膜。小鼠抗层粘连蛋白C（LC28.26-s；发育研究杂交瘤库）在封闭溶液中稀释至最终浓度1:100，并强烈标记帽细胞的核膜(看见 附注10和11).
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    针对德国的RNAi击倒砰结果小卵巢充满未分化生殖细胞。(a、 b条)完整控件的亮场图像(一)和种属特异性砰击倒(b条)子房羽化后5天。(c、 d日)标记有抗Hts（梭形体和滤泡细胞膜；红色）、抗LaminC（帽细胞核膜；红色)和DAPI（所有核）。While期间编号Gal4控制病菌(c（c）)包含GSC(虚线)，成膀胱细胞(实心箭头)和分化生殖细胞（由分支梭形体识别；开放箭头），砰击倒的生殖细胞在整个生殖细胞库中积累了GSC-和类囊胚细胞，以牺牲分化的生殖细胞。此外，砰敲除导致卵子发生受阻，缺乏逐渐发育的卵泡就证明了这一点(d’)通常在对照卵巢中发现(c’).比例尺=200微米(a、 b条)，10微米(c、 d日)

  16. 二级抗体：带有荧光标记的种配对二级抗体。用于检测抗Hts和抗LaminC(看见 图3c、d)，我们使用Alexa Fluor山羊抗鼠-568（Life Technologies；看见 附注12)，在封闭溶液中稀释至最终浓度1:200。
  17. 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）：对于工作浓度，制备5.0 mg/mL DAPI储备溶液的1:500稀释液(看见 附注13)PBS中0.1%Triton-X-100。
  18. 安装介质：20 mg/mLn个-甘油中的没食子酸丙酯(看见 附注14). 在50 mL锥形管中，合并1.0 gn个-没食子酸丙酯（Sigma）与5 mL PBS；涡流混合。添加45 mL 100%甘油。用箔片盖住锥形管，在室温下用螺母旋转一整夜。介质应该是透明但非常粘稠的。在4°C下避光储存。工作原料可以倒入不透明的滴管瓶中，以便于使用。

2.3样品制备和共焦显微镜

  1. 两个带磨尖钨丝针的持针器；一个应该在顶端有一个“L”形弯曲(看见 附注15).
  2. 玻璃显微镜载玻片和盖玻片（1μm厚，22×22 mm）。
  3. 钢重量，约250 g。
  4. 指甲油（Sally Hansen Tough as Nails，任意颜色）。
  5. 倒置激光扫描共焦显微镜，配备63×浸油透镜（n.a.=1.4）和1.5–3×光学变焦(看见 附注16).
  6. 共焦图像采集与分析软件(看见 附注17).

3方法

3.1果蝇菌株和培养

3.1.1选择基因特异性UAS-RNAi应答器转基因

尽管有多种特定目标无人机系统RNAi转基因可用于果蝇属[32]，必须注意确保成功敲除女性GSC中感兴趣的基因。各种常用的果蝇属基因工具，包括阿拉伯联合酋长国在体细胞中促进强烈表达的应答株在雌性生殖系中无效[39,40,50,51]. 为了避免这个问题，Ni和同事开发了两种RNAi载体(缬氨酸20和缬氨酸22)专为RNAi发夹在生殖系中的最佳表达而设计[50].缬氨酸20促进卵巢生殖系和胞体的强烈敲除；相比之下缬氨酸22基于种系相容性的向量UASp公司矢量[51]，促进生殖系中的强表达，但仅在体细胞中中度至弱表达[50,52]. 针对特定目标的大量集合缬氨酸20-和缬氨酸22-基于无人机系统RNAi转基因品系（以下简称“无人机系统RNAi应答者”）现在可以从哈佛医学院转基因RNAi项目（TRiP；网址：www.flyrnai.org;看见 附注18)通过布卢明顿果蝇属库存中心(看见 附注1;表1). 另一大系列无人机系统RNAi响应者可从维也纳果蝇库存中心（VDRC）获得。VDRC维护两个库无人机系统RNAi主要在插入位置不同的应答器无人机系统RNAi进入果蝇属基因组[36]. 尽管这两个文库都不是在种系优化载体中创建的，但通过Dicer2的共表达，在种系中实现了基因特异性RNAi发夹的可靠表达(无人机-Dcr2) [29,30].

表1

RNAi介导的基因敲除资源果蝇属卵巢GSC和体细胞支持细胞

转基因来源成人卵巢表达模式工具书类
镀锌4驱动程序
生殖系编号Gal4:：VP16（III）一土地管理局b条#4937GSC中度表达，生殖系囊肿强表达[51,55]
nos-NGT40；无人机-Dcr2土地管理局#25751GSC中的表达很弱[29,30]
MTD-半乳糖4BLM编号31777GSC中适度表达，生殖系囊肿中强烈表达[54]
ET-Flpx2Gal4–168型果蝇属社区生殖系克隆[41]
利基bab1-镓4土地管理局#6802；果蝇属社区帽细胞和护卫细胞[61,62]
c587-镀锌4果蝇属社区护送细胞、卵泡干细胞、卵丘前细胞[69]
Tj-Gal4公司KYO公司c（c）#104055终端灯丝和帽电池[70]
ET-Flpx2Gal4-688A型果蝇属社区护送细胞克隆[41]
13C06-镀锌4土地管理局#47860护送细胞、卵泡干细胞和卵泡前细胞[71]
ET-Flpx2镀锌4-398A果蝇属社区护送细胞、卵泡干细胞和卵泡前细胞克隆[41]
无人机RNAi响应者
长发夹VDRC KK公司VDRC公司d日生殖系表达无人机-Dcr2[36]
VDRC GD公司VDRC公司生殖系表达无人机-Dcr2[36]
短发夹TRiP公司e（电子）缬氨酸10土地管理局仅限于体细胞表达[39]
TRiP缬氨酸20土地管理局体细胞和生殖细胞中的表达[50]
TRiP缬氨酸22土地管理局种系细胞表达强，体细胞表达弱[50]
一请注意，在X（X）染色体；然而，它的表达弱于三
b条布卢明顿果蝇属印第安纳大学股票中心，美国印第安纳州布卢明顿
c（c）日本京都京都理工大学京都库存中心
d日维也纳果蝇属奥地利维也纳资源中心
e（电子）美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院转基因RNAi资源项目

尽管越来越多的细菌兼容无人机系统RNAi响应者正在公开(看见FlyBase、，网址：www.flybase.org，对于当前列表），这些工具可能还无法用于某些感兴趣的基因。在这种情况下，可以创建缬氨酸20-或缬氨酸22-基于无人机系统RNAi使用标准分子克隆技术进行转基因，并将此转基因商业性注射到胚胎中以建立转基因系(看见 附注19). 创建自定义时无人机系统RNAi建立新的转基因株系确实需要时间，这是一个可行且成本低廉的选择，因为现有的工具很少。TRiP提供了详细的协议、克隆载体和引物序列(网址：www.flyrnai.org) [50].

使用目标时会出现三个常见问题无人机系统RNAi方法。首先，敲除感兴趣基因的强度可能在无人机系统RNAi转基因。这可以通过使用各种技术测量RNA或蛋白质水平进行评估，但如果有合适的试剂，则最好通过针对感兴趣蛋白质的免疫荧光在体内进行可视化。其次，给定的RNAi发夹可能以多个基因为靶点，导致表型不是由于感兴趣的基因丢失（“非靶点效应”）。VDRC KK库尤其如此[53]. 为了最大限度地减少偏离目标的影响，选择多个发夹，针对感兴趣基因的不同区域进行RNAi分析。最有效的控制方法是设计与实验发夹具有高序列相似性的发夹，但有几个不匹配的碱基，从而阻止RNAi的诱导[33,34]. 最后，对于编码多个亚型的基因，发夹可以针对mRNA的一个、多个或所有亚型，具体取决于靶区。识别发夹序列相对于预测转录本的位置很重要，因为这可能会影响结果的解释。

3.1.2选择种特异性Gal4驱动基因转基因

与无人机系统RNAi应答器，兼容细菌镀锌4还必须选择驱动因子以实现GSC中的基因特异性击倒。如上所述无人机RNAi应答者可能导致发育性致死，从而妨碍成人GSC表型分析。此外，一些被认为“无处不在”的驱动程序（例如hs镀锌4用于许多体细胞实验）在生殖系中不起作用[35,40,51]. 因此，一种细菌特异性镀锌4要求驾驶员限制无人机系统RNAiGSC应答器表达。不幸的是，很少有种系特定的驱动程序存在，GSC中的驱动程序表达更是少之又少；然而，一些品系可以在不直接修饰周围体细胞的情况下，成功地敲低GSC及其子代的基因表达(表1).

也许是果蝇属卵巢是编号Gal4:：VP16和“母性三重性”MTD-镀锌4[43,51,54,55]. 然而，在使用编号Gal4:：VP16GSC实验中的驱动程序。第一，编号Gal4:：VP16表达不限于成人GSC[51,55]. 该驱动因子在发育中的原始生殖细胞、幼虫/蛹生殖细胞前体、成年GSC和几乎所有GSC子代中表达。因此，很难最终证明特定的感兴趣基因仅在成人GSC中起作用（即GSC功能与GSC建立）。（不幸的是，Gal80温度。系统在这方面无能为力，因为镀锌4：：VP16缺少Gal80结合位点[56].) 第二，虽然编号Gal4:：VP16在成人GSC中表达，在分化的子细胞（尤其是2-、4-、8-和16-细胞囊肿）中表达水平更高[51,55]. 因此，任何导致表型影响种系分化的敲除实验都必须仔细解释。例如，编号Gal4:：VP16-分化因子的介导敲除一袋弹珠(砰)使用靶向RNAi会导致生殖系分化受阻，导致单个生殖细胞和2细胞生殖囊的积累，而4、8和16细胞囊的损失(图3). 作为一个单独的实验，这些结果可能表明砰是分化2细胞囊肿所必需的；然而，对Bam蛋白表达和砰遗传无效等位基因清楚地表明砰是直接GSC子细胞（成囊细胞）初始分化所必需的[57–60]. 使用时应考虑类似因素MTD-镀锌4，由三个独立的镀锌4插入(编号Gal4:：VP16加pCOG-Gal4：：VP16和编号NGT40-Gal4) [43,51,54]. 有趣的是，两者都不是pCOG-Gal4：：VP16（也称为otu-Gal4:：VP16)也不是编号NGT40-Gal4在成人GSC中高度表达（E.Ables未出版，参考文献[51]); 然而，一些研究小组在使用该驱动因子（与无人机-Dcr2)在大屏幕上[29,30]表明在某些情况下，低水平的转基因表达足以诱导表型。最后，一个新特征镀锌4驾驶员，ET-Flpx2镀锌4-398A，也可用于克隆表达无人机系统RNAi生殖系中的应答者[41]，但尚未得到广泛应用。

多种体细胞镀锌4也可以使用驱动程序来识别影响GSC功能的微环境因素(表1). 其中大多数是体细胞镀锌4司机大力推广各种无人机系统RNAi转基因（缬氨酸22系列）。然而，研究人员应该注意到，其中许多驱动因子在重叠的体细胞群体中表达，也可能在卵巢外表达。例如，bab1-Gal4合金经常用于驾驶无人机系统RNAi在卵巢体细胞帽细胞中表达，但在卵子发生较发育阶段的体细胞极性细胞和柄细胞中也有强表达[61,62]. 研究人员应在任何击倒实验之前测试驾驶员在多个组织中的表达，以排除非自主效应，并在实验过程中检查驾驶员的表达模式，以确保模式不会因苍蝇的遗传操纵或营养状况而改变。

3.1.3果蝇饲养

  1. 使用标准程序维持苍蝇培养(看见 附注20).
  2. 培养至少两瓶镀锌4驱动线和同型控制（通常yw；看见 附注21)和一瓶无人机系统RNAi应答器线路(看见 附注22). 从中收集处女镀锌4驱动线和同种型对照。
  3. 设置控件(镀锌4带的驱动程序yw公司雄性；无人机系统RNAi应答器yw公司女性处女）和实验(镀锌4带的驱动程序无人机系统RNAi应答器）交叉(图2a)装在小瓶中，每个小瓶的密度为五对苍蝇(看见 附注23). 交叉应设置为重复。在培养基中添加干酵母可提供增加产蛋量的最佳条件。将瓶子保持在25°C，每3天将成年人转移到新瓶子。新的苍蝇应该在这个日期的10天内出现（在这个温度下）。对于使用高尔夫球80支阻遏物(图2b)，交叉点应保持在18°C，新蝇类将在18-20天内出现。
  4. 允许杂交种羽化1-2天。收集将要解剖的雌性苍蝇和等量的伴生雄性苍蝇（通常每瓶12至15对苍蝇），并将其添加到添加湿酵母糊的新鲜小瓶中(看见 附注24).
  5. 每天将成年人转移到新鲜酵母瓶中，并保持恒定温度（通常为25°C或29°C；看见 附注25)直到解剖那天。对于使用高尔夫球80支阻遏剂，苍蝇应保持在29°C。苍蝇解剖时的年龄（由羽化后的天数决定）由实验者决定。对于GSC自我更新的分析，宜在一系列时间点（即羽化后0天、4天、8天和12天）收集苍蝇，以绘制GSC随时间的维持情况。羽化后解剖的时间取决于被筛选的品系数量和预期/发现的确切表型，应通过实验确定。

3.2卵巢解剖和免疫染色(图4)

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卵巢免疫染色的实验工作流程。准备果蝇属概述了用于共聚焦成像的卵巢，强调了一级和二级抗体以及核复染的添加

  1. 使用CO2麻醉苍蝇。取出公头并丢弃。在玻璃或有机玻璃解剖盘中，用冷格雷斯培养基解剖雌性苍蝇的卵巢。解剖卵巢(看见 附注26)，左手持镊子抓住女性腹部前端。用右手中的镊子捏住女性腹部的最后一条条纹，然后将其从身体上拔出。镊子不仅能抓住角质层，还能抓住泌尿生殖系统（通常包括卵巢）。对小瓶中的所有雌性动物重复解剖。将切除的卵巢收集在凉爽的Grace培养基中，迅速打开卵巢周围的外肌鞘，分离单个卵巢。使用玻璃巴斯德吸管，将BSA从贴有标签的、预先涂层的微滤管中取出并丢弃。使用同样的吸管（现在也涂有BSA），将Grace培养基中的剖宫卵巢移到微量离心管中。把管子放在冰上。
  2. 用额外的小瓶苍蝇重复解剖。在解剖第一只苍蝇后一小时内继续固定（见下文）。
  3. 让卵巢在重力的作用下聚集在微型离心管的底部。尽可能多地删除Grace的媒体(看见 附注27)，并添加1.0 mL固定剂。将微量离心管倒置数次，以确保所有卵巢悬浮，并在室温下在螺母上旋转13分钟。
  4. 将固定剂移到适当的废物容器中，并迅速加入1.0mL洗涤溶液。将管倒置数次，并将冲洗液移到废物容器中。加入新鲜洗涤液，倒置试管，使卵巢悬浮，并在营养器上旋转15分钟。
  5. 丢弃溶液，在1.0 mL洗涤液中再将卵巢洗涤两次以上，时间超过10分钟。
  6. 丢弃溶液，并添加1.0 mL封闭溶液。在室温下，在营养器上旋转卵巢3小时。
  7. 丢弃溶液，并添加400μL初级抗体混合物(看见 附注28和29). 在4°C的温度下，在营养器上培养卵巢过夜或两晚以上。
  8. 清除抗体(看见 附注30)将卵巢在1.0 mL洗涤液中洗涤四次，每次在营养器上洗涤至少30分钟。
  9. 丢弃最后一次清洗，并添加500μL二次抗体混合物。在室温下，在营养器上培养卵巢1-2小时。从这一步开始，应保护所有样品免受光照，以尽量减少荧光损失。
  10. 丢弃抗体，将卵巢在1.0 mL洗涤液中洗涤四次，每次在营养器上洗涤至少30分钟。
  11. 丢弃最后一次洗涤，加入500μL DAPI。在营养器上培养卵巢15分钟。
  12. 丢弃DAPI，将卵巢在1.0 mL洗涤液中洗涤两次，每次10分钟，放在营养器上。
  13. 丢弃最后一次清洗，尽可能多地清除液体。直接在卵巢顶部滴入四滴固定液。样品可以在4°C下直立存放一个月。

3.3样品制备和共焦成像

  1. 在成像前的第天或第天，在玻璃载玻片上制备样品进行成像(看见 附注31).
  2. 用玻璃巴斯德吸管将卵巢和培养基移到载玻片上。清除多余的安装介质。分离（挑逗）单个卵巢。要获得GSC的最佳成像效果，请移除所有大卵泡(看见 附注32). 将卵泡分散在滑梯上，确保没有大团块。
  3. 一旦所有大的卵泡都被移除，卵泡在玻片中心充分分散开来，再在玻片上滴1-2滴安装介质。将一个玻璃盖玻片放在玻片的中心，让毛细作用将安装介质和卵形膜扩散到盖玻片上。如果盖玻片和载玻片之间仍有空气，请使用巴斯德移液管在盖玻片边缘缓慢添加更多的安装介质。
  4. 将Kimwipes和一个钢锤放在盖玻片/滑块的顶部，以压平卵巢。10–15分钟后，卸下砝码，并用指甲油将盖玻片密封到玻片上。成像前让幻灯片干燥。
  5. 使用带有63倍浸油透镜和光学变焦（1.5–3倍）的倒置共焦显微镜对样品进行成像。将图像收集为共焦z堆叠（1μm光学切片）。幻灯片上的每个病菌都应进行成像分析（通常每张幻灯片上有75-100个病菌）。

3.4表型分析、量化和后续步骤

RNAi介导的基因敲除果蝇属生殖系可能产生多种表型。在生殖系建立的早期阶段（即在发育过程中）或生殖系分化中发挥作用的基因的表达缺失可能会导致卵子发生的完全阻断。击倒维持GSC命运的基因可能会导致GSC（以及所有子生殖细胞）的完全丧失，从而导致缺乏生殖细胞的原始卵巢。在早期囊肿生长中起作用的基因的表达缺失（与GSC功能或种系分化无关）可能导致卵巢缺乏更发达的卵泡。尽管这些可能的情况都会导致类似的“小卵巢”表型，但某些基因的敲除可能会导致不改变总体卵巢形态的微妙表型。因此，作为更详细的分子分析的起点，对卵泡结构和细胞组成进行彻底的表征是非常重要的。

在抗Hts和抗LaminC的免疫荧光检测后，Hts阳性融合体的存在可以识别早期生殖细胞(看见 图3c，c'). GSC通过其邻近帽细胞（表达高水平的层粘连蛋白C）的前定位融合体明确识别。虽然融合体的形状通常是圆形的，但融合体形态的变化（伸长和断裂）与GSC细胞周期的不同阶段相关，可以用作细胞周期进展的指标[20,23]. 当GSC分裂形成成囊细胞时，一个新的融合体形成，位于成囊细胞的后部，但其形状与GSC融合体相似（箭头，图3c). 随着囊胚母细胞继续分裂并伴随不完全胞质分裂形成多细胞生殖系囊肿，融合体分支使得单个分支端点位于每个细胞细胞质中（开放箭头，图3c). 因此，在分化的每个阶段（GSCs、成膀胱细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞囊肿）对生殖细胞数量的初步定量可以提供GSC维持和子生殖细胞分裂和分化能力的快照。

GSC或成囊细胞数量的改变是GSC功能改变的最初表型指标。GSC的减少或完全丧失（量化为每个病菌库的GSC平均数量）表明未能维持GSC种群。然后可以进行其他分析，以阐明GSC损失的原因。例如，凋亡分析（例如TUNEL或裂解半胱天冬酶的免疫荧光）可以指示GSC是否因细胞死亡而丢失，并且可以评估每个分化阶段的分子标记，以确定GSC是否由于过早分化而丢失。这些标记物可能包括磷酸化的Mothers Against Decapentaplastic（pMad，在GSC中高度表达）、Bam（在成囊细胞和2细胞和4细胞囊肿中表达）、Ataxin-2结合蛋白1（A2BP1，在4细胞和8细胞囊肿中表示）[63]、C-3-G和Orb（在卵母细胞中表达）。每个生殖道中GSC和/或成囊细胞样细胞数量的增加可能表明GSC增殖率增加或直系子细胞未能启动分化。为了评估GSC增殖的差异，可以在分析中添加S相指示剂5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）或M相指示剂磷烯酮H3。这些标记物也有助于检测成囊细胞分化和增殖的变化。靶向RNAi敲除卵巢的免疫荧光分析可以通过卵巢的分子分析来补充，包括基因表达（RT-PCR、RNA-seq或原位杂交）或蛋白质分析（Western blotting）。来自靶向RNAi的所有表型都应使用其他基因功能丧失模型进行验证，包括通过镶嵌克隆分析对遗传突变体进行表型评估[45,48].

鸣谢

多谢托德·奈斯图尔、丹妮拉·德拉蒙德·巴博萨、阿凯莫·冈萨雷斯-雷耶斯、布卢明顿股票中心、京都股票中心、维也纳果蝇属资源中心和发育研究杂交瘤库提供苍蝇种群和抗体。还感谢哈佛医学院的TRiPpVALIUM公司载体、有价值的协议、生物信息学资源和构建我们自己的建议无人机RNAi响应者。这项工作得到了东卡罗来纳大学托马斯·哈利奥特艺术与科学学院、研究与研究生部以及Dimes基金会（2014-62财年5月）的支持。

脚注

1许多这些线可以从布鲁明顿果蝇库存中心获得(http://flystocks.bio.indiana.edu)，维也纳果蝇资源中心(http://stockcenter.vdrc.at)或京都果蝇库存中心(http://www.dgrc.kit.ac.jp).

2我们建议使用Nutri-Fly MF，按照制造商的说明混合，并补充Tegosept，以防止霉菌生长。Nutri-Fly MF是Genesee Scientific提供的一种基于糖蜜的培养基配方(https://geneseesci.com)使用浸入式搅拌器和对流热板很容易混合。因为它可以以相对较小的批量生产，所以对于较小的果蝇属实验室。新鲜使用的蝇类培养基最好（倒入后3-4周内）。我们使用6盎司的方形底部聚丙烯瓶和狭窄的聚苯乙烯瓶，都用Flugs密封。

三我们使用Fleischmann的速溶干酵母，每包1磅，可从Sam的俱乐部购买。

4果蝇属饲养和麻醉用品可以从Genesee Scientific购买。

5试管预先涂上3%的牛血清白蛋白（BSA）溶液[在蒸馏水中用30%的溶液（Sigma）稀释]，以防止卵巢粘附在试管侧面。向微量离心管中添加250μL 3%BSA。将管子放在室温下的章动器上1小时，以确保管子内部完全覆盖。将管子储存在4°C。

6我们制作50 mL无菌的格蕾丝培养基小份，并在4°C下保存，直至准备好解剖。如果等分样品看起来浑浊，则应使用新的批次。

7最佳固定剂浓度和固定时间可能因主要抗体而异，应通过实验确定。我们发现这里给出的浓度和孵育时间对于本方案中使用的初级和次级抗体是最佳的。

8甲醛与空气接触时会迅速降解。为了获得最佳结果，我们订购了10 mL超纯16%甲醛安瓿，将液体转移到15 mL锥形管中，并在4°C下储存不超过1周。

9理想的封闭溶液有助于减少背景染色，并且可能因一级和二级抗体而异。选择与免疫染色反应中使用的二级抗体的宿主物种相匹配的封闭溶液的血清是很重要的。

10我们还发现，一些浓缩的LC28.26小份也会标记GSC、生殖细胞的核膜，偶尔也会标记卵泡细胞（微弱）。

11该方案可适用于其他分子标记物染色，包括凋亡检测（TUNEL）和增殖标记物（EdU）或其他初级抗体。只需调整抗体浓度（如有必要）并选择适当的二级抗体，以保持特异性并避免交叉反应。

12到达后，我们将等量的100%甘油添加到每个商业二级抗体中，充分混合，并将其储存在−20°C的100μL小份中。

13根据制造商的说明，在去离子水中制备5 mg/mL DAPI（Life Technologies，类别号D1306）储备溶液。

14虽然市面上有多种基于甘油的防褪色安装介质，但我们更愿意自己制作解决方案。我们发现它比商业品牌便宜，荧光强度保持不变（如果不是更好的话）。我们以前使用过直接补充DAPI的固定培养基，但发现这些制剂不能很好地渗透到卵巢中，导致核染色不均匀。

15我们实验室的不同成员使用不同的方法分离卵巢（“挑逗”）。用一根“L”或“shepherd's crok”形状的针帮助我们的一些实验室成员左右移动卵巢上的最大卵泡（想想在老电影中用藤条把一个人从舞台上拖下来）。

16我们建议使用蔡司LSM700系统，尤其是用于常规使用的小型实验室。

17我们使用蔡司黑色图像采集软件和蔡司蓝色图像分析软件。许多常见的分析也可以在ImageJ中进行，ImageJ是免费提供的(http://imagej.nih.gov/ij/).

18用于生成无人机系统RNAi点击“inserted element”链接，然后点击“associated sequence features”链接，可以在FlyBase中找到感兴趣的内容。一般来说，无人机系统RNAi以“JF”或“HMS”开头的行在非种系兼容载体中创建(缬氨酸1或缬氨酸10)，而“HMJ”、“HMC”、“GL”或“GLC”是在缬氨酸20或缬氨酸22向量。

19现在，许多公司为果蝇属，包括BestGene(www.thebestgene.com)，彩虹转基因苍蝇公司(网址：www.rainbowgene.com)和遗传服务公司(www.geneticservices.com).

20的方法果蝇属其他地方也描述了文化维护和畜牧业。

21y1w1号机组（缩写）yw公司在本协议中）经常被用作近交系同种型对照，因为它在生成转基因苍蝇中广泛使用。可从布卢明顿库存中心（BLM#1495）购买。

22两个对照杂交是合适的，以确保任何实验表型都是相关基因敲除的结果。自从无人机系统RNAi不应在缺少Gal4时表示，交叉无人机系统RNAi男性应答者yw公司女性处女。同样镀锌4不应因基因组插入位点或背景突变而导致卵巢缺陷。因此，交叉镀锌4驾驶女性处女yw公司男性。

23实验组和对照组应始终保持相同的饮食、环境温度和年龄匹配。

24卵子的形成与雌性苍蝇的饮食有着微妙的关系[64]. 为了确保确定的任何表型都是基因敲除的结果，而不是次优饮食的影响，必须仔细培养苍蝇。每天用新鲜酵母糊喂苍蝇是必要的，以保持产卵的最佳条件。尽管瓶子被浪费了，但丢弃装有旧的干酵母糊的瓶子也很重要：如果没有新鲜酵母，苍蝇会减少产蛋量。

25与任何情况一样UAS/镀锌4实验表明，即使没有Gal80系统，RNAi敲除的强度也与温度有关。这个编号Gal4:：VP16驾驶员对温度特别敏感；将苍蝇保持在29°C而不是25°C，可以增强苍蝇的弱表型。

26各种评论最近发表了对卵巢解剖技术的极好描述[65–68]; 因此，我们向读者推荐卵巢剥离和卵泡分离的其他照片。特别是，我们发现Scott Ferguson的YouTube视频(https://www.youtube.com/watch？v=T94be2i5qb4)有助于首次卵巢解剖。

27在整个方案的其余部分中，每次液体交换时，在取出溶液之前，让卵巢在重力作用下下降到微量离心管的底部，等待几分钟。除了固定剂和一级抗体溶液外，我们使用配有细吸管尖端的真空捕集瓶去除卵巢中的液体。在本方案中，我们通常在任何给定的时间将约50–100μL溶液留在解剖的卵巢上。这有助于避免卵巢意外吸入废物，并防止样本干燥。

28尽管该方案详细说明了同一物种中产生的两种一级抗体的免疫染色（因此使用一种二级抗体检测），但我们通常使用多种抗体来定位卵巢中不同的蛋白质或细胞标签。理论上，通过在这一步将所有一级抗体结合在一起，不同物种的多种抗体的免疫染色应该能够很好地工作。然而，我们通过连续几晚培养初级抗体，并通过广泛的清洗步骤（每次4次30分钟）将其分离，从而大大减少了背景染色。实际上，初级抗体是在样本顶部分层的。相反，针对不同物种的二级抗体通常被组合成一种溶液。

29如果在同一物种中产生了两种抗体，但有必要分别对其进行成像，则应用一种抗体，然后进行清洗，然后再使用适当的二级抗体，如文中所述。然后在洗涤液中清洗卵巢五次，每次30–45分钟，再封闭1小时，然后应用第二个一级抗体。孵育后，继续进行洗涤和第二次二次（使用不同的荧光团）。

30可以收集给定浓度的抗-Hts和抗-LamC混合物，并将其储存在4°C下，然后再次用于另一个实验。

31载玻片上的样品会随着时间的推移而变干，从而降低荧光强度。由于图像采集通常是这些实验的瓶颈，我们将所有样本存储在安装介质中，直到成像前一天。

32卵泡可以根据各种形态特征分期[19]. 在解剖立体显微镜下很容易识别出10级卵泡，因为卵母细胞的大小约为整个卵泡的一半。我们移除了所有大于10级的卵泡，以实现GSC的最佳成像。

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