国际分子科学杂志。2018年1月；19(1): 165.
过度内质网应激与肝脏和脂肪组织线粒体动力学、线粒体吞噬和细胞凋亡受损相关，但与肌肉无关
2弗罗茨瓦夫研究中心EIT+，ul。Stabłowicka 147，54-066 WrocÞaw，波兰
2017年12月18日收到；2018年1月4日接受。
摘要
如今，内分泌失调在人类医学和兽医学中都变得越来越频繁。在马身上，体力活动减少，加上碳水化合物和糖分超载，可能会导致所谓的马代谢综合征（EMS）。EMS的特点是胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血甘油三酯浓度升高，通常是肥胖。尽管EMS个体的表型特征众所周知，但疾病发展的分子机制仍不清楚。因此，在本研究中，我们分析了胰岛素敏感组织，即肌肉、肝脏和脂肪组织，以评估胰岛素抵抗和凋亡。此外，我们评估了这些组织中的线粒体动力学和线粒体吞噬，因为线粒体功能障碍与代谢综合征的发生有关。我们通过RT-PCR和Western blot的线粒体吞噬实验确定了胰岛素抵抗、内质网应激和线粒体清除相关基因的表达。用电子透射显微镜观察细胞超微结构。结果表明，EMS马的脂肪组织和肝脏的特点是线粒体损伤和有丝分裂增加，随后由于有丝分裂无法恢复细胞内稳态而触发细胞凋亡。然而，在肌肉中，细胞凋亡减少，这表明存在一种保护机制，允许该组织维持体内平衡。
关键词：代谢综合征、细胞凋亡、胰岛素抵抗、线粒体、自噬
1.简介
马代谢综合征（EMS）是一种日益常见的内分泌疾病，是一组主要与胰岛素抵抗相关的临床异常。这是由于体力活动减少，加上碳水化合物和糖超载，导致胰岛素抵抗（IR）和肥胖；然而，最近的研究结果表明，肥胖和/或区域性肥胖本身不应作为诊断标准[1]. EMS马表型的最典型特征是空腹高胰岛素血症、血甘油三酯浓度升高和胰岛素对外部葡萄糖（口服或静脉注射）的反应不足。
严重肥胖症和/或区域性肥胖症除了是EMS诊断中的一个特征性症状外，还是影响外周组织生理和细胞生理状况的一个重要代谢因素，除其他外，还会诱发炎症、自噬和凋亡。已经证实，受EMS影响的马和人的脂肪组织向外周血分泌促炎细胞因子和脂肪因子，这可能是导致胰岛素抵抗发展的主要因素[2,三,4].
我们在之前的研究中证明[5]在胰岛素抵抗的EMS小马中，“驼峰颈”衍生的脂肪组织分泌大量促炎细胞因子、脂肪因子和激素。这反过来导致低度全身炎症，这对椎板炎的发展至关重要。其他作者也发现EMS马项韧带附近的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）和白介素6蛋白水平较高；然而，与正常体重的健康个体相比，高胰岛素血症马的mRNA水平无统计学相关性。此外，EMS马不同脂肪库中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的表达与健康人相比无显著差异[6]. 这是令人惊讶的，因为EMS通常与脂肪组织炎症有关。然而，肝脏和肌肉中脂肪含量的增加被怀疑是导致全身炎症状态发展的主要因素，因为TNF-α的表达升高，同时伴有细胞因子信号传导抑制因子3（SOCS3）和Toll样受体4（TLR4）。在人类代谢综合征中，脂肪的异常堆积，尤其是在肝脏中，被认为是导致局部炎症的主要原因，因为它的脂肪毒性，进而导致肝纤维化和肝细胞凋亡。肝细胞、脂肪细胞和肌细胞的进行性炎症和氧化应激，以及EMS过程中的进行性凋亡，可能反过来是诱导自噬或/和线粒体自噬以拯救应激细胞的因素。
氧化应激（OS）与人类代谢综合征、糖尿病及其并发症的进展有关[7,8]. 活性氧（ROS）的过度积累已被证明会破坏胰岛素信号通路，从而导致胰岛素抵抗（IR）。研究表明，血脂异常、高血糖内质网应激和一氧化氮合酶是ROS过度生成的原因。此外，线粒体功能障碍通常与细胞器增加ROS分泌有关，或通过向内质网表面发送信号间接增加ROS，进而产生更多ROS。此外，它可以触发代谢综合征和糖尿病的全身炎症特征。然而，关于EMS马匹中操作系统的程度只有有限的数据。在本研究中，我们测定了血清ROS、一氧化氮和超氧化物歧化酶水平，以评估OS是否是EMS的特征。
自噬被认为是一种机制，负责受损细胞器的降解及其利用，并在维持细胞生理功能方面发挥关键作用[9]. 另一方面，有丝分裂一词与去除功能失调、受损的线粒体有关，以维持细胞内的能量平衡和体内平衡。激活自噬或溶酶体系统可以消除OS反应中的氧化细胞成分。最近的数据表明，营养诱导的内质网应激是发展肥胖相关炎症的一个重要因素，可能是自噬的有效诱导剂，能够回收受损的细胞器，包括线粒体[10,11]. 在我们之前的研究中，我们已经证明大自噬和有丝分裂参与EMS衍生祖细胞的存活。因此，自噬作为细胞器的重要质量控制，可能是代谢综合征中保护心肌细胞、肝细胞和脂肪细胞的关键机制。然而，在肥胖的II型糖尿病患者中，通过有丝分裂去除有缺陷的线粒体可能是使线粒体免于代谢过载的关键机制，代谢过载会导致β-氧化不完全、有毒脂质中间产物积累和氧化应激[12]. 然而，最近对人类的研究表明，在肥胖状态下，脂肪组织中的自噬过程确实上调，但可能会严重受损。在我们之前的研究中，我们已经证明了从EMS马身上分离的脂肪干细胞中自噬的重要性，自噬是一种保护机制，可以使这些细胞保持多能性。在这项研究中，我们旨在研究EMS马胰岛素敏感性组织中的自噬现象，并首次从分子水平检测这些动物的胰岛素抵抗。据我们所知，这是首次描述EMS在肝脏、肌肉和脂肪组织中的分子后果的研究。我们的主要目标是研究EMS与健康人相比如何影响这些组织的新陈代谢，因为有许多关于人类这种现象的数据。在本研究中，我们首次揭示了胰岛素敏感性组织的EMS相关恶化。我们评估了EMS马的肌肉、脂肪组织、肝脏以及细胞凋亡、炎症、内质网应激和自噬之间的相互作用，以首次修正这些假设。我们测定了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）、肿瘤蛋白p53（p53）、α-丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶（BAX）/B-细胞淋巴瘤2（Bcl-2）比率、p62、Beclin-1、PINK PARKIN和微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC-3）水平，以及具有自噬和自噬诱导凋亡特征的自噬体的存在。此外，我们评估了线粒体动力学和内质网应激的标记物。我们的结果表明，肝和脂肪组织中的细胞凋亡、内质网应激和有丝分裂受损之间呈正相关，但肌肉中没有。
2.结果
2.1. 氧化应激与炎症
在健康和EMS个体的血清中确定氧化应激因子和细胞因子水平。两个ROS(A） 和否(B） EMS马血清中的水平显著升高(第页< 0.01). 另一方面，抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性显著下调(C、，第页< 0.001). 采用ELISA法测定血清中白细胞介素10（IL-10）、TNF-α和IL-1β的含量。IL-10的量(D、，第页<0.01）减少，而TNF-α(E、，第页<0.001）增加了EMS马。各组间IL-1β水平无统计学差异(F） ●●●●。
健康（CTRL）和EMS马血清中的氧化应激和细胞因子水平。使用市售分光光度分析法，ROS(一个)，否(B类)和SOD(C类)对活动进行了评估。用ELISA检测IL-10评估细胞因子谱(D类)，肿瘤坏死因子-α(E类)和IL-1β(F类)。结果表示为平均值±标准偏差（S.D.）**第页< 0.01, ***第页< 0.001.
2.2. 胰岛素抵抗
采用RT-PCR方法，对健康马和EMS马的肌肉、肝脏和脂肪组织中胰岛素抵抗相关基因的表达进行了评估。在EMS马的肌肉中几乎检测不到胰岛素受体（IR）的表达，而在脂肪和肝脏中，其表达增加(A、，第页<0.05和第页分别<0.001）。同样，胰岛素受体底物表达(B） EMS马的肌肉明显减少(第页<0.001），而在脂肪组织中，胰岛素受体底物（IRS）的mRNA水平显著升高(第页< 0.001). 研究组之间的肝脏IRS含量无显著差异。核糖体蛋白S6激酶β-1（S6K1）的表达(C） 在从EMS个体分离出的所有组织中增强(第页< 0.001). 相反，葡萄糖转运蛋白4（GLUT-4）水平显著降低(第页<0.001）在EMS马的所有组织中，如图所示D.视黄醇结合蛋白4（RBP4）(E） 肌肉中未检测到；然而，它在EMS马的脂肪组织和肝脏中上调(第页< 0.001). 固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1C）的RT-PCR(F） 显示其在肌肉中的表达减少(第页<0.001），脂肪组织(第页<0.05）和肝脏(第页<0.05）。
马肌肉、脂肪组织和肝脏中胰岛素抵抗相关基因的表达。使用RT-PCR，IR的表达(一个)，IRS公司(B类)，S6K1系列(C类)，GLUT-4型(D类)、RBP4(E类)和SREBP1C(F类)已进行调查。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
2.3. 细胞凋亡
所有组织在Tri试剂中均质并提交进行RNA分离。使用RT-PCR，研究研究标本中凋亡相关基因的表达。p53的表达(A） EMS马的肌肉含量显著降低(第页< 0.01). 相反，两种脂肪组织中的p53 mRNA均上调(第页<0.01）和肝脏(第页<0.01）。p21的表达(B） 与健康受试者相比，EMS马的肌肉明显减少(第页< 0.01). 相反，在脂肪组织中，p21转录水平显著增加(第页< 0.001). p21在健康马和EMS马肝脏中的表达无统计学意义。行李(C） 肌肉中的表达显著上调(第页<0.01）和脂肪组织(第页<0.001），而其在肝脏中的表达在各组之间没有显著差异。抗凋亡Bcl-2的表达(D） 肌肉明显减少(第页<0.01）和脂肪组织(第页<0.001）。EMS马肌肉和肝脏中Bcl-2/BAX的比率显著降低(E） ●●●●。此外，使用Western blot检测样品中caspase 3的含量。结果如所示F.有趣的是，仅在肝脏中观察到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的裂解。
健康（CTRL）和EMS个体肌肉、脂肪组织和肝脏中细胞凋亡的评估。使用RT-PCR，我们评估了p53的表达(一个)，第21页(B类)，BAX（行李）(C类)，Bcl-2型(D类)和Bcl-2/BAX比率(E类)。此外，通过Western blot分析确定了样品中caspase-3的含量(F类)。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
2.4. 内质网应激
为了评估所研究组织中的内质网应激，我们对CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）进行了RT-PCR(A） ，真核翻译起始因子2-α激酶3（PERK）(B） 白细胞介素13（IL-13）(C） ●●●●。所得结果表明CHOP在脂肪组织中的表达增加(第页<0.001）和肝脏(第页<0.01），而肌肉减少(第页<0.001）。EMS马肌肉中PERK mRNA的数量下调(第页< 0.05). 然而，在这些人的脂肪组织中，它被上调(第页<0.001）和肝脏(第页< 0.05). IL-13的表达(D） 在肌肉中显著上调(第页<0.001）并在脂肪组织中下调(第页<0.001）和肝脏(第页<0.05）。为了进一步研究ER情况，我们对组织样品进行了透射电镜（TEM）分析(D） ●●●●。在TEM图像中，各组之间的ER超微结构没有显著差异。对于脂肪组织，在对照组中，ER几乎不可见；然而，在EMS组，内质网结构的体积增加，这是未折叠蛋白应激的典型结果（表示为eER（扩大内质网））。此外，在EMS动物的脂肪组织中发现巨噬细胞浸润。在EMS马的肝脏中也观察到类似的现象，同时还观察到ER增大。此外，它们的特点是脂质滴的积聚增强。此外，观察到细胞核固缩，这表明肝细胞凋亡增加。
健康和EMS马组织内质网应激的研究。使用RT-PCR，CHOP的表达(一个)、PERK(B类)和IL-13(C类)已检查。此外，TEM图像可以显示细胞超微结构和检测细胞器损伤(D类)。缩写：ER，内质网；eER，内质网扩大；LD，脂滴；PN，核固缩。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
2.5. 自噬
采用RT-PCR评估自噬相关基因的表达。雷帕霉素的机制靶点（mTOR）在各组之间没有差异(A） 在肌肉和脂肪组织样本中的表达。然而，在肝脏中，EMS组的表达上调(第页< 0.001). 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）(B） 肌肉中的mRNA水平下调(第页<0.001）和脂肪组织(第页<0.001）。相反，在肝脏中，PI3K(C） 表达显著上调(第页<0.001）。同样，肌肉中AKT表达下调(第页<0.001）和脂肪组织(第页<0.001）。肝脏中AKT mRNA数量没有差异。反过来，Beclin-3的表达也没有发现差异(D） 肌肉样本中。在脂肪组织中，Beclin-3的表达减少(第页<0.001），而肝脏增强(第页<0.001）。LC-3型(E） 尽管在EMS动物的肝脏中表达水平显著上调，但肌肉和脂肪组织中的表达水平相当(第页< 0.001). Beclin-3/LAMP2的比例(F） EMS患者肌肉和肝脏中的表达显著增加(第页<0.01和第页< 0.05). 脂肪组织样本的计算比率没有差异。溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）(G） EMS马的所有组织中的表达都大大减少。使用LAMP2荧光染色和共焦显微镜成像，我们评估了组织中LAMP2的数量。免疫荧光染色结果证实了PCR数据，因为在EMS马的组织中发现了低强度的LAMP2信号。此外，利用透射电镜，我们观察了样品中自噬体的形成。自噬体用红色箭头表示H。
健康和EMS个体肌肉、脂肪组织和肝脏自噬的评估。使用RT-PCR，mTOR的表达(一个)，PI3K(B类)、AKT(C类)，贝克林-3(D类)，LC3(E类)，Beclin/LAMP2的比值(F类)和LAMP2(G公司)已进行调查。利用免疫荧光技术检测样品中LAMP2的细胞内定位(H（H）)。TEM分析可以可视化自噬体的形成（用红色箭头表示(我)). LD，脂滴；AP，自噬体。结果表示为平均值±S.D*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001. 比例尺：共聚焦20µm，透射电子显微镜（TEM）200 nm。
2.6. 线粒体和线粒体动力学
使用RT-PCR，我们研究了参与线粒体自噬过程的基因的表达：PINK(A） 和Parkin连接酶（Parkin）(B） ●●●●。肝脏PINK表达无差异；然而，它在EMS马肌肉中的表达降低(第页< 0.001). 有趣的是，在EMS组，脂肪组织中PINK表达上调(第页< 0.001). PARKIN表达也有相同的趋势：在肌肉中表达减少(第页<0.001），脂肪组织中增加(第页<0.001）。肝脏样本中的PARKIN表达没有差异。为了评估组织中的线粒体动力学，我们研究了与线粒体融合和(C） 裂变(D） 。肌肉中丝裂原融合蛋白1（MNF）的表达下调(第页<0.001），而在肝脏中增加(第页<0.01）。各组间脂肪组织样本中的MNF mRNA数量没有差异。线粒体裂变1蛋白（FIS）在马肌肉中的表达没有差异，但在两种脂肪组织中表达上调(第页<0.001）和肝脏(第页<0.001）。此外，使用Western blot评估PARKIN量，如E.此外，使用PARKIN的免疫荧光染色，可以看到其在组织中的细胞定位(F） ●●●●。所得结果支持PCR数据，因为在EMS马的脂肪组织和肝脏中观察到最强的信号强度。此外，使用TEM，我们观察到了线粒体的形成（用黄色箭头表示，F） ●●●●。获得的数据表明EMS马肌肉中的线粒体退化（嵴紊乱、肿胀）（用红色箭头表示F） ●●●●。
健康马和EMS诊断马组织中的线粒体吞噬和线粒体动力学评估。使用RT-PCR，PINK的表达(一个)，停车场(B类)，百万立方英尺(C类)和FIS(D类)已进行调查。用Western blot检测PARKIN量(E类)和免疫荧光染色(F类)。TEM成像(F类)允许观察线粒体形成（用黄色箭头表示）和线粒体形态损伤（用红色箭头表示）。MP，线粒体；IM，线粒体受损。结果表示为平均值±S.D**第页< 0.01, ***第页< 0.001. 比例尺：共焦20µm，TEM 100 nm。
3.讨论
马代谢综合征的主要病理体征是肌肉、脂肪组织和肝脏的胰岛素抵抗，这是由于饮食中碳水化合物过多和体力活动减少所致[13]. 所有这些因素都会损害胰岛素信号，胰岛素信号是内分泌紊乱（包括EMS）的主要组成部分。
我们测量了马血清中的ROS、SOD和NO水平，以进一步研究OS和EMS之间的关系。许多研究工作表明，糖尿病患者的循环中ROS生成增加，抗氧化保护降低[14,15]. 在大鼠模型中，氧化应激增强了胰岛素抵抗[16]. 这与我们的数据一致，因为我们观察到EMS患者的血清ROS和NO水平升高。结果表明，糖尿病大鼠动脉中一氧化氮合酶（NOS）增加[17]. 此外，活性氧已被证明对胰岛β细胞特别有害，因为它们的抗氧化剂（如SOD或过氧化氢酶）含量很低[18]. 在本研究中，我们观察到血清SOD水平降低，这表明EMS马的抗氧化保护能力降低。这与Isogawa等人的结果一致[19]，他们观察到血清SOD活性与代谢综合征受试者的体重指数（BMI）呈负相关。在这种情况下，IR可以作为一种补偿机制，保护细胞免受葡萄糖和脂肪酸的摄入，从而受到氧化损伤[20,21]. 最近的研究表明，体力活动和饮食限制可能会改善OS[22]. 研究表明，抗氧化剂摄入与糖尿病风险增加相关[23]. 因此，补充马饲料中的维生素和自由基清除剂，再加上体力活动，可能会降低ROS的循环水平，从而减少炎症。
胰岛素信号的损伤对于内质网应激以及线粒体的生物发生和动力学也有重要意义[24,25]与EMS密切相关。在此，我们观察到EMS马肌肉、脂肪组织和肝脏中GLUT4和固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1）的表达降低，核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）的mRNA转录同时上调。我们的结果表明，与健康献血者相比，EMS马的胰岛素敏感性受损、脂肪酸稳态功能障碍以及肌肉、脂肪组织和肝脏肥胖症。此外，我们发现在EMS马的所有研究组织中S6K1转录物水平增加。据报道，高水平的S6K1 mRNA是营养过剩条件下决定胰岛素抵抗发展的关键因素[26]. 有趣的是，在EMS马的脂肪组织和肝脏中记录到视黄醇结合蛋白（RBP）4的表达增加，这与年龄、肥胖和胰岛素抵抗呈正相关，但在肌肉中没有记录到；然而，这种表达以前曾在啮齿动物肌肉中有报道[27]. 此外，研究表明，RBP4表达增加通过STRA6信号途径导致细胞凋亡[28]. 在这里，我们观察到脂肪组织和肝脏中RBP4转录物水平的增加之间存在正相关，这表明细胞凋亡正在进行。脂肪组织和肝脏中RBP4和p53的上调可能与胰岛素抵抗有关，因为据报道，抑制p53转录物可提高胰岛素敏感性并降低2型糖尿病样疾病小鼠促炎细胞因子的表达[29]. EMS马脂肪组织和肝脏中进行性p53相关凋亡可能是由内质网（ER）应激引起的，内质网应激导致ER稳态破坏，最终导致β细胞死亡[30]. 最近，有人认为慢性高血糖和高脂血症是内质网应激的主要组成部分，也是EMS症状的特征。在这里，我们观察到脂肪组织和肝脏中CHOP（C/EBP同源蛋白）和PERK（真核翻译起始因子2-α激酶3）转录物的水平显著升高，但EMS马的肌肉中没有。这与脂肪组织和肝脏中p53表达上调呈正相关，因为研究表明内质网应激导致死亡信号通路的诱导。反过来，与脂肪组织和肝脏相比，EMS马肌肉中CHOP和PERK的表达降低，可能与肌肉中IL-13转录物的高表达呈正相关。有文献证明，在内质网应激期间，通过eIF2α依赖性调节C/EBPβ转录因子，白介素4（IL-4）/白介素13（IL-13）信号被抑制，而白介素-13通过糖异生调节在调节葡萄糖稳态中发挥了意想不到的作用[31]. 这反过来可能表明，通过减少内质网应激和同时诱导IL-13表达，EMS马的肌肉可以抵抗p53诱导的细胞死亡，而不是脂肪组织或肝脏。此外，Bcl-2/BAX比率降低表明EMS马肌肉和脂肪组织中的细胞凋亡增加。有趣的是，在肝脏样本中没有发现显著差异。这可能表明肝脏通过外源性而非内源性途径发生凋亡。这与声称由于肝细胞死亡受体表达增加，肝细胞凋亡由外源性途径触发的观察结果相关[32]. 然而，这篇论文需要进一步的研究来支持。
众所周知，胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病是诱导自噬的有力因素，自噬是一种将应激细胞从死亡中拯救出来的机制。在这里，我们发现在肝脏中诱导了自噬，但在EMS马的脂肪组织和肌肉中没有。我们观察到，与脂肪组织和肌肉相比，EMS马肝脏中的Beclin-1、LC-3、PI3K和mTOR转录物水平显著升高。这些转录物是自噬的主要成分，观察到的上调清楚地表明了自噬诱导。此外，透射电子显微镜（TEM）可以观察到在脂滴周围的肝细胞中积聚的自噬双膜空泡的形成。有趣的是，在EMS马的肌肉、脂肪组织和肝脏中观察到LAMP2表达显著降低。溶酶体是参与细胞死亡、胞吐、内吞/吞噬以及自噬的重要细胞器。然而，据报道，在糖尿病过程中，它们的活动和/或功能障碍存在于啮齿类动物的大脑中[33]. EMS马的肌肉、脂肪组织和肝脏中的脂质积累可导致溶酶体功能障碍，最终损害碳水化合物、蛋白质、核酸或细胞碎片的降解。因此，增加的糖脂毒性通过氧化应激导致内质网应激，这反过来损害了线粒体的生物发生和动力学。我们观察到EMS马的肝脏和脂肪组织中PARKIN显著上调，这与在这些组织中观察到的进行性内质网应激（CHOP和PERK上调）密切相关。PARKIN是一种E3泛素蛋白连接酶，与PTEN诱导的推定激酶1（PINK1）一起参与线粒体自噬过程中的控制，从而促进细胞存活。EMS马脂肪组织和肝脏中PARKIN的增强表达与观察到的p53上调密切相关，这表明这些脂肪细胞和肝细胞的凋亡性质。此外，TEM研究表明，线粒体嵴和吞噬体形成受损是典型的有丝分裂现象。有趣的是，尽管我们在EMS马的肌肉样品中没有发现PARKIN表达增强和线粒体形成增强，但线粒体显示出严重的超微结构变化。可以推测，肌肉中可能存在另一种清除线粒体碎片形成细胞胞浆的机制。此外，我们发现FIS在肝脏和脂肪组织中的表达增强，但在EMS马的肌肉中没有。该观察结果与肌肉中p21和p53的低表达呈正相关，这可能表明与其他受试组织（即脂肪组织和肝脏）相比，肌肉在EMS条件下的凋亡最少。线粒体分裂被描述为一种通过改变质子泄漏和膜电位来调节线粒体生物能量和功能的机制[34]. 据报道，抑制线粒体分裂可减少糖尿病引起的氧化应激，因此可以成为一个有效的治疗靶点[35,36].
在这项研究中，我们首次表明，脂肪组织和肝脏受到EMS中渐进性p53相关凋亡的影响，并与内质网应激一起诱导自噬，以保护细胞免受糖脂毒性的影响。此外，这些组织中描述的有丝分裂可能是维持细胞能量和生存的修复机制。与这些发现相反，我们发现EMS状态下的肌肉受到p53相关凋亡的影响最小，必须存在自噬/有丝分裂以外的另一种机制来保护胰岛素抵抗细胞免受凋亡。由于这可能有助于开发EMS的未来临床治疗，因此迫切需要进一步的详细研究来探讨这个问题。
4.材料和方法
除非另有说明，否则本实验中使用的所有试剂均购自Sigma-Aldrich（波兰波兹南）。
4.1. 马的选择和EMS诊断
从位于波兰拉维茨的屠宰场挑选了8匹EMS和8匹健康的马，并在死后采集了肝脏、肌肉和脂肪组织的样本。这些马都是波兰的热血马，性别各异，年龄在9至14岁之间，符合该项研究的条件。EMS是根据2010年美国兽医学院制定的标准诊断的。EMS马的特征是基于胰岛素失调（ID）、身体状况评分（BCS）区域肥胖、体重（Wt）和椎板炎病史。在电子农业平台（德国埃森纳赫博世）上测量体重。BSC由三名经过独立培训的人员根据Henneke评分系统进行评估和确定，其中1代表极度消瘦的动物，9代表极度肥胖的动物。同样的研究人员也根据冠颈评分（CNS）系统对冠颈进行了评估，其中“0”表示颈冠缩小，“5”表示冠大到永久下垂到颈部一侧。在所有合格的马中，按照[37]. 口服糖（Karo）0.15 mL/kg剂量后，采集血样进行血糖和胰岛素测量。在以下时间点检测血糖水平：Karo给药后“0”、“60”和“120”分钟。空腹胰岛素水平>100毫国际单位每毫升（mIU/mL）被视为高胰岛素血症，服用Karo后60分钟胰岛素升高（>150毫单位/mL）则被视为ID的诊断提供了OST、基线血清胰岛素水平、空腹胰岛素和口服糖后60分钟胰岛素水平的数据。通过血糖仪（波兰华沙）进行血糖分析，并使用经实验生物学系（波兰弗罗茨瓦夫环境与生命科学，弗罗茨瓦夫）验证的市售试剂盒Mercodia（Equine insulin ELISA，Uppsala，Sweden，No.10-1205-01）测量胰岛素浓度根据制造商的程序，用于马血清样本。由同一技术人员重复测量三次。
表1
| 集团 | 年龄 | 基线血清胰岛素；（mIU/mL） | 口服糖后60分钟胰岛素（mIU/mL） | 基线葡萄糖（mg/dL） | 口服糖后60分钟的葡萄糖（mg/dL） | BCS公司 | 中枢神经系统 | LEP（纳克/毫升） | 重量（Kg） |
|---|
| 邮政特快专递 | 12±2 | 180 ± 20 | 260 ± 11 | 72 ± 11 | 163 ± 26 | 7.2 ± 0.2 | 3.9 ± 0.7 | 4.89 ± 1.2 | 680 ± 30 |
| 控制 | 11 ± 2 | 13 ± 4 | 36 ± 3 | 84 | 88 | 6.4±0.3 | 1.9±0.6 | 1.1±0.6 | 590 ± 20 |
4.2. 肌肉、脂肪和肝脏的采集
从健康马和患有马代谢综合征的马身上采集尸检肌肉、皮下脂肪组织和肝脏样本。收集后立即将组织放入无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，并运至弗罗茨瓦夫大学实验生物学系。
4.3. 肌肉、脂肪和肝脏蛋白质的分离
肌肉、脂肪和肝组织样本均化，然后在含有0.001%蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液中在冰上培养1小时。培养后，样品在4°C下以10000 rpm离心20分钟。收集上清液并将其储存在−20°C下。蛋白质浓度由Pierce™BCA蛋白质分析试剂盒（波兰华沙生命科技公司）测量。
4.4. 西方印迹法
通过Western blotting检测样品中是否存在特定蛋白质。每个样品使用30微克蛋白质。SDS-PAGE在100V下在Tris/甘氨酸/SDS缓冲液中进行90分钟。在Tris/甘氨酸缓冲液中，使用100 V、4°C的转移装置将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。转移后，用Tris/NaCl/Tween缓冲液（TBST）清洗膜，并在4°C下用5%的脱脂牛奶在TBST中封闭过夜。然后，用TBST清洗膜，用一级抗体孵育2小时：βAKT（Sigma-Aldrich，A5441）、PARKIN（Novus，Littleton，CO，USA，NB100-91921）和caspase-3（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA，437800），稀释度为1:500。然后，用TBST清洗膜，并添加次级抗体溶液。培养2小时后，用TBST清洗膜并用BCIP培养®/NBT-紫色液体基质15分钟。用水冲洗膜，停止反应。
4.5. 酶联免疫吸附试验
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定组织匀浆中的总蛋白浓度，检测IL-1β（My Biosource，San Diego，CA，USA）、IL-10（My Biosource（My Beosource），San Diego，CAUSA）和TNF-α（Thermo Fisher，Warsaw，Poland）。根据制造商的方案进行分析。每个样品制备两份。使用Epoch BioTek进行分光光度测定®（美国佛蒙特州Winooski）。
4.6. 免疫荧光和透射电镜
对于免疫荧光染色，样品固定在4%多聚甲醛中，并在蔗糖中进行低温保护。冷冻切片（10µm）在低温恒温器上切割，解冻后安装在玻璃载玻片上。固定切片在含有0.5%皂苷、0.2%Triton X100、0.1%叠氮化钠、2%山羊血清和抗体（1:200，PARKIN，Novus，Littleton，CO，USA，NB100-91921和LAMP2，Abcam，Cambridge，UK，ab25631）的缓冲液中培养过夜。第二天，用PBS清洗标本三次，每次10分钟，然后用Alexa Fluor 488标记的抗体孵育2小时。用DAPI（4′，6-二氨基-2-苯基吲哚）对细胞核进行复染。接下来在共焦显微镜下对样品进行检查（Cell Observer，Zeiss，Oberkochen，Germany）。
为了进行透射电子显微镜分析，样品的制备如前所述[38]. 收集并用2.5%戊二醛固定。然后，用蒸馏水清洗三次，用1%四氧化锇培养2小时，用柠檬酸铅和醋酸铀酰复染，在分级丙酮系列中脱水，并用琼脂低粘度树脂试剂盒（英国埃塞克斯琼脂科学有限公司）包埋。使用FE-STEM Auriga60在20 kV灯丝张力下进行观察。
4.7. 血清分析中的氧化应激因素
从马身上采集血清并进行进一步分析。如前所述测量氧化应激因子[39]. 简单地说，根据制造商的说明，使用Griess试剂盒（波兰华沙生命科技公司）和SOD检测试剂盒（Cu-ZnSOD-3）评估一氧化氮浓度。根据制造商的协议，使用2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA，Life Technologies，Warsaw，Poland）溶液估计活性氧物种（ROS）水平。使用Epoch BioTek进行分光光度测量®（美国佛蒙特州Winooski）。
4.8. 基因表达分析
肌肉、脂肪和肝组织样本用HBSS清洗，并用手术剪刀和手术刀切成小块。样品用TRI试剂均质。总RNA是使用Chomczynski和Sacchi（1987）之前描述的酚-氯仿法分离的。用分光光度计（Epoch BioTek）通过吸光度测量测量分离RNA样品的浓度和纯度®（美国弗吉尼亚州Winooski），波长260-nm。使用RevertAid RT Kit（Thermo Scientific，Warsaw，Poland）制备无DNA-free RNA并将gDNA-free总RNA转录为互补DNA（cDNA）。所有程序均按照制造商的说明执行。通过SensiFast SYBR（Bioline，Cincinnati，OH，USA），使用总体积为20μL的5μL cDNA进行定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）。在2.5µM最终浓度的引物下进行反应。引物序列见.qRT-PCR通过CFX Connect™实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在以下条件下进行：95°C 2 min，然后在95°C中50个循环15 s，60°C 15 s和72°C 5 s。每个循环后，对产品进行单次荧光测量。引物序列列于mRNA水平相对于作为看家基因的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）进行了标准化。数据由2−ΔΔC类t吨方法。此外，我们通过将Bcl-2的相对表达除以BAX的相对表达来评估各组中Bcl-2和BAX表达的比率。
4.9. 统计
结果显示为至少三个独立实验的方框图，测量为三倍或更多。使用未配对的t吨-测试（Prism5.04；GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）。第页<0.05被认为具有统计学意义。
5.结论
在目前的研究中，我们首次表明脂肪组织和肝脏受到EMS中进行性p53相关凋亡的影响。由于自噬和内质网应激的结合，在这些组织中触发自噬和自噬被认为是对抗糖脂毒性的保护机制。这些过程的激活可能是维持细胞能量和生存的修复机制。另一方面，EMS状态下的肌肉最不容易发生凋亡，必须存在不同于自噬/有丝分裂的机制来保护胰岛素抵抗细胞免受凋亡。
致谢
该研究由波兰国家科学中心资助，批准号：2016/21/B/NZ7/01111。该出版物得到了2014年至2018年弗罗茨瓦夫生物技术领先国家研究中心（KNOW）项目的支持。
缩写
| BCS公司 | 身体状况评分 |
| 中枢神经系统 | Cresty颈部评分 |
| 邮政特快专递 | 马代谢综合征 |
| 重量 | 重量 |
| 阿克特 | RACα-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 |
| 行李 | Bcl-2相关X蛋白 |
| Bcl-2型 | B细胞淋巴瘤2 |
| CHOP公司 | CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白 |
| 邮政特快专递 | 马代谢综合征 |
| 呃 | 内质网 |
| FIS公司 | 线粒体分裂1蛋白 |
| GAPDH公司 | 3-磷酸甘油醛脱氢酶 |
| GLUT-4级 | 葡萄糖转运子4 |
| IL-1β | 白细胞介素1β |
| 白介素-10 | 白细胞介素10 |
| 白介素-13 | 白细胞介素13 |
| 白介素-4 | 白细胞介素4 |
| 红外 | 胰岛素受体 |
| 美国国税局 | 胰岛素受体底物 |
| 灯2 | 溶酶体相关膜蛋白2 |
| LC-3型 | 微管相关蛋白1A/1B-轻链3 |
| MCP-1型 | 单核细胞趋化蛋白1 |
| 多国部队 | 丝裂霉素1 |
| mTOR公司 | 雷帕霉素的作用靶点 |
| 不 | 一氧化氮 |
| 操作系统 | 氧化应激 |
| 第21页 | 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 |
| p53基因 | 肿瘤蛋白p53 |
| 停车场 | 帕金连接酶 |
| PERK公司 | 真核翻译起始因子2-α激酶3 |
| PI3K系列 | 磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶 |
| 粉红色1 | PTEN诱导的假定激酶1 |
| RBP4模式 | 视黄醇结合蛋白4 |
| RICTOR公司 | 雷帕霉素哺乳动物靶点的雷帕霉素不敏感伴侣 |
| ROS公司 | 活性氧物种 |
| S6K1系列 | 核糖体蛋白S6激酶β-1 |
| 草地 | 超氧化物歧化酶 |
| SREBP1C公司 | 甾醇调节元件结合蛋白1c |
| 肿瘤坏死因子-α | 肿瘤坏死因子α |
作者贡献
Krzysztof Marycz和Katarzyna Kornicka设计了这项研究。Katarzyna Kornicka和Jolanta Szlapka-Kosarzewska进行了这项研究。Krzysztof Marycz、Katarzyna Kornicka和Christine Weiss分析了数据。Krzysztof Marycz和Katarzyna Kornicka撰写了论文，Katarzyana Kornica、Jolanta Szlapka-Kosarzewska和Christine Weiss编制了数字。Krzysztof Marycz贡献了试剂/材料/分析工具。所有作者阅读并批准了最终手稿。
工具书类
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