硫代西罗尔二霉酸酯促进细胞溶质的获取和细胞内负荷结核分枝杆菌淋巴管内皮细胞
,1 ,1 ,1 ,2 ,2和
1 托马斯·勒纳
1英国西北部1AT伦敦米德兰路1号弗朗西斯·克里克学院
克里斯托弗·奎瓦尔
1英国西北部1AT伦敦米德兰路1号弗朗西斯·克里克学院
安东尼·费恩斯
1英国西北部1AT伦敦米德兰路1号弗朗西斯·克里克学院
乌尔斯卡·雷普尼克
2挪威奥斯陆Blindernweien 31，0371，奥斯陆大学生物科学系
加雷斯·格里菲思
2挪威奥斯陆Blindernweien 31，0371，奥斯陆大学生物科学系
马克西米利亚诺·古铁雷斯
1英国西北部1AT伦敦米德兰路1号弗朗西斯·克里克学院
1英国西北部1AT伦敦米德兰路1号弗朗西斯·克里克学院
2挪威奥斯陆Blindernweien 31，0371，奥斯陆大学生物科学系
通讯作者。 2017年7月10日收到；2017年12月13日接受。
摘要
背景
硫铈醇二霉酸酯（PDIM），是一种糖脂，发现于结核分枝杆菌（Mtb）复合物是Mtb发病机制的主要促成因素。骨髓细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，是感染后结核分枝杆菌的主要宿主，以前的研究表明PDIM在支持这些细胞中的结核分枝杆菌方面发挥着多种作用。然而，结核分枝杆菌可以感染其他类型的细胞。我们之前的研究表明，结核分枝杆菌在人类淋巴管内皮细胞（hLECs）中有效复制，并且hLEC胞浆充当人类结核分枝杆菌的储存库。在这里，我们研究了PDIM在结核分枝杆菌易位到hLECs胞浆中的作用。
结果
对无法产生PDIM的Mtb突变体的分析显示，细菌与膜损伤标记物半乳糖凝集素-8（Gal8）的共定位较少，表明PDIM对吞噬体膜损伤有很大贡献。缺乏这种结核分枝杆菌脂类还导致结核分枝杆菌与细胞内细菌宏自噬清除标记物（吞噬）共定位的比例降低，如泛素、p62和NDP52。hLEC成像和透射电子显微镜显示，缺乏PDIM的Mtb突变体很少定位在胞浆中，导致较低的细胞内负荷。
结论
PDIM用于破坏hLEC中的吞噬体膜，帮助结核分枝杆菌避免水解的吞噬体环境。它有助于Mtb转移到胞浆中，缺乏PDIM的Mtb的胞内负荷减少表明胞浆是这些细胞中Mtb首选的复制生态位。我们假设，靶向Mtb中PDIM合成的药理作用将减少人类Mtb淋巴储库的形成。
关键词：结核分枝杆菌、结核病、二聚果糖硫瑟醇、PDIM、淋巴内皮细胞、hLEC、巨噬细胞、吞噬体损伤、细胞质溶胶、色诺芬
背景
在世界范围内，结核病是一种传染病的主要死亡原因，2016年有130多万人死于结核病[1]. 结核病的病原体，结核分枝杆菌（结核分枝杆菌）有一个复杂而独特的细胞壁，其外表面有几个成分，结核分枝杆菌利用这些成分与受感染的宿主细胞相互作用[2,三]. 其中一组组分，二甲基果酸硫铈（PDIMs），是甲基支链脂肪酸类脂质，已在结核分枝杆菌复合物的所有致病成员中发现[4]和所有临床分离的结核分枝杆菌[5]. 相反，PDIM在体外培养过程中经常丢失[5,6]. 这表明PDIM是导致结核病发病的主要因素。事实上，缺乏PDIM的结核分枝杆菌突变体在豚鼠结核病模型中严重减弱[5]（与PDIM阳性菌株相比，复制减少，肺结节更少），以及小鼠结核病模型[7–9]. PDIMs与结核分枝杆菌感染期间的多种功能有关，包括但不限于：人类巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌[10]，减少H型空泡的补充+-ATP酶（v-ATP酶）和吞噬体-溶酶体结合减少[10]，保护巨噬细胞免受一氧化氮依赖性杀伤[11]，掩盖病原相关分子模式，减少杀微生物巨噬细胞的招募[12]和诱导宿主细胞死亡[13]. 最近，PDIMs被证明与ESAT-6分泌系统（ESX-1）协同作用，促进人类原代巨噬细胞的吞噬体破裂/损伤[14]，THP-1巨噬细胞[15]和小鼠骨髓源巨噬细胞[16]. 尽管这些研究得出结论，在没有PDIM的情况下，吞噬体膜破裂减少，但没有超微结构数据，也没有明确的证据证明这种情况会降低Mtb在胞浆中的定位程度。
骨髓细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）是感染后结核分枝杆菌的主要宿主[17]几乎所有PDIM生物学的体外研究都使用小鼠或人类巨噬细胞作为模型。然而，结核分枝杆菌可以感染许多其他类型的细胞[18]. 我们之前已经证明，初级人类淋巴管内皮细胞（hLECs）是人类结核分枝杆菌的贮存库[19]. 淋巴内皮细胞构成淋巴结和淋巴管壁的一部分[20,21]但也越来越多地被认为在对感染的先天性和适应性免疫反应中起着关键作用[22–26]. 我们在体外表明，结核分枝杆菌可以被hLECs摄取，在hLECs's中，它们破坏吞噬体膜并转位到胞浆，这一过程涉及到RD-1位点编码的VII型分泌系统ESX-1分泌ESAT-6[27,28]. 我们假设，在逃离吞噬体后，结核分枝杆菌优先在hLECs的细胞质中复制，并且在整个过程中，我们观察到宿主细胞死亡最少[19]. 鉴于细胞溶质定位对hLECs中Mtb高效复制的潜在重要性，以及PDIM在吞噬体损伤中的新作用，我们试图确定PDIM是否在hLECsMtb感染期间重要。
我们使用了一个体外模型，使用感染野生型（WT）Mtb或缺乏产生PDIM能力的突变株的原代hLECs。尽管超过50 kb的结核分枝杆菌基因组（>1%）专门用于生产PDIM[29,30]，几个生物合成或转运基因中的任何一个突变都足以阻止PDIM的生成或其转移到外表面[7,8,31,32]. 一个这样的生物合成基因(ppsE（磅/平方英寸），编码phthiocerol合成聚酮合酶I型）被证明对PDIM的生产至关重要[33,34]. 在这项研究中，我们使用了Mtb H37Rv株PMM100，该株具有ppsE公司[10]. 我们还使用了WT亲本菌株（Mtb WT）和PMM100突变体，并辅以ppsE（磅/平方英寸）[10]. 每个菌株还表达一个染色体整合绿色荧光蛋白（GFP）标签[10].
我们表明，PDIM对hLECs的吞噬体损伤过程有强烈的促进作用，缺乏PDIM导致吞噬体中Mtb相对于WT-Mtb的比例显著增加。我们还确定PDIM有助于诱导细菌选择性自噬（异种吞噬）。使用透射电子显微镜（TEM），我们证实缺乏PDIM会显著减少胞浆中的细菌数量。最后，我们表明，与在类似感染条件下巨噬细胞中未受影响的细菌负荷相比，缺乏PDIM的结核分枝杆菌负荷在hLECs中严重减少[10,14]. 我们认为，这种缺陷是由于hLECs中Mtb的主要复制生态位与巨噬细胞（即胞浆）相比存在根本性差异，而当PDIMs缺失时，巨噬细胞更难获得胞浆。此外，转移到胞质溶胶可能是Mtb用来避免在吞噬多胞体中被杀死的一种策略。
这项工作确定PDIM是结核分枝杆菌进入和转移到淋巴管内皮细胞胞浆的一个重要因素，从而进入一个潜在的有利于复制的环境。这种情况的一个重要后果是，以药物为靶点的PDIM合成可能会严重抑制人类Mtb淋巴储库的形成。
结果
PDIM增加了结核分枝杆菌破坏吞噬体的能力并避免hLECs中吞噬体的命运
我们用Mtb-GFP WT（Mtb-WT）、Mtb-GFP PMM100（MtbΔPDIM）或Mtb-绿色荧光蛋白PMM100:：pMVE（Mtb-ΔPDIM:：PDIM24h等），然后固定样品并用特异性抗体标记，以识别不同的细胞内标记物。
首先，我们使用标记物Galectin 8（Gal8）研究PDIMs是否参与hLECs的吞噬损伤[35,36]（图). 使用基于图像的无偏分析（请参见“方法’）为了量化Gal8与任一菌株的相关性，我们确定在5+2 hpi后，当PDIM缺失时，吞噬体中Mtb对该细胞质标记阳性的程度降低了50%（图). MtbΔPDIM菌株与PDIM的互补使Gal8-阳性细菌的比例恢复到WT水平。在随后的时间点（24–72小时），当没有PDIM时只有1–2%的Mtb吞噬体为Gal8-阳性时，这种影响更为深远，而PDIM存在时只有6–9%（图). 我们还使用相同的方法测量了泛素和其他吞噬标记物的相关性（见下文）。
PDIMs有助于吞噬体损伤，并有助于避免hLECs中的吞噬体命运，这些hLECs5小时后被Mtb WT、MtbΔPDIM或Mtb△PDIM:：PDIM（所有GFP标记）感染，然后所有非吞噬细胞细菌被冲走。固定前感染持续2、24、48或72小时。使用抗体对样本进行免疫荧光标记(一)半乳糖凝集素8（Gal8）或(c（c）)组织蛋白酶D（CtsD）。用DAPI对细胞核进行可视化。白色方框勾勒出荧光通道单独显示的缩放区域。比例尺为10μm。图像是5+24 hpi采样的代表性示例。图像，如中的(一)和(c（c）)使用ImageJ量化(b条)Gal8或(d日)每个时间点的每个Mtb菌株的CtsD。显示了在每种条件下对标记物[定义为在与单个Mtb颗粒（绿色通道）重叠的区域中具有至少100的平均像素强度的标记物（红色通道）]呈阳性的Mtb的百分比。每个重复每个样品至少成像六个视野，并执行三个独立的重复。还显示了每个条件下分析的Mtb颗粒总数(N个). 总体平均值用代表平均值标准误差的误差条表示。使用单向方差分析和Tukey的后验确定统计显著性。CtsD组织蛋白酶D、Gal8半乳糖凝集素8、GFP绿色荧光蛋白、人淋巴内皮细胞hLEC、感染后hpi小时、结核分枝杆菌结核分枝杆菌，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型***第页 < 0.001
吞噬体损伤是Mtb在细胞质中定位的先决条件，这一过程需要RD-1位点编码的VII型分泌系统[27,28]. 我们之前确定，缺乏RD-1基因座的Mtb存在于hLECs的吞噬溶酶体中的可能性是Mtb WT的三倍多[通过组织蛋白酶D（CtsD）关联测量][19]一些研究表明，无PDIM突变体被转运到巨噬细胞的酸性隔室[10,37,38]. 因此，我们推断，由于MtbΔPDIM菌株破坏吞噬体膜的能力较弱，因此它更容易定位于吞噬体（图). 事实上，我们发现在5+24 hpi后，与Mtb WT相比，Mtb与CtsD共定位的比例显著增加了1.5倍。这在5+48小时增加到1.8倍，在5+72小时增加到2.75倍（图). 因此，虽然PDIM增加了受损Mtb WT吞噬体的数量，但这种脂质的缺乏将Mtb保留在吞噬体内。
缺乏PDIM的Mtb对hLECs中NF-kB和IRF-1的激活没有差异
据报道，结核分枝杆菌PDIMs可屏蔽Toll样受体（TLR）配体[12]TLR激活可影响巨噬细胞吞噬体成熟[39]. 因此，我们研究了Mtb靶向吞噬小体的动力学增加是否是由于Mtb WT和突变体对hLECs的差异激活所致。如前所示，我们通过共焦显微镜监测了用Mtb WT、MtbΔPDIM和Mtb△PDIM PDIM感染hLECs后NF-kB（p65）和IRF-1的激活[40,41]. 我们发现，感染24小时后，Mtb诱导NF-kB活化，通过p65转位到细胞核进行测量，但Mtb WT和突变体之间的活化没有显著差异（图). 此外，结核分枝杆菌诱导IRF-1活化，通过IRF-1易位到细胞核进行测量（图). 然而，Mtb WT和缺乏PDIM的突变体之间的这种激活没有显著差异（图). 我们的结果表明，与巨噬细胞不同，PDIM不影响hLEC中TLR的激活。
PDIMs对人类淋巴管内皮细胞中NF-kB或IRF-1的激活没有差异性影响，这些细胞在任何非吞噬细胞细菌被冲走之前，感染了Mtb WT、MtbΔPDIM或Mtb△PDIM:：PDIM（所有GFP标记）5小时。固定前感染持续24小时。使用抗p65（NF-kB）或IRF-1抗体对样本进行免疫荧光标记。用DAPI对细胞核进行可视化。一受感染细胞的代表性图像。白色星号表示感染细胞有核移位。感染NF-kB的细胞百分比(b条)或IRF-1(c（c）)核定位。对至少100个感染细胞进行计数，并进行三个独立的重复。平均值以误差条显示，误差条表示平均值的标准误差。使用单向方差分析和Tukey后验确定统计显著性。GFP绿色荧光蛋白结核分枝杆菌，ns不显著，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型
当结核分枝杆菌在hLECs中缺乏PDIM时，异种吞噬相关蛋白的招募受到损害
色诺芬尼试图通过（选择性）自噬破坏细胞内病原体[42]. 它被证明是巨噬细胞控制结核分枝杆菌增殖的防御机制[43]和hLEC[19]. 对于结核分枝杆菌来说，这个过程被认为涉及对细菌本身的识别[44]细菌周围受损的膜[45]和/或结核分枝杆菌衍生产品，如细胞外DNA[46]. 泛素（Ub）作为一种自噬受体，在这些靶点上形成多泛素链，而连接蛋白如隔离体1（p62）和抗原核点52 kDa蛋白（NDP52）则在泛素链和称为吞噬体的形成双膜结构之间架起桥梁；后者对微管相关蛋白1A/1B轻链3B（LC3）阳性[46]. 最终吞噬体融合形成一个完全包裹细菌的结构；这被称为自噬体。
我们之前的研究表明，缺乏RD-1区域的结核分枝杆菌不能有效地被hLECs中的自噬体靶向[19]. 据推测，这是因为需要一个受损的吞噬体，以便通过选择性自噬机制识别结核分枝杆菌或受损的膜本身。因此，考虑到缺乏PDIM的结核分枝杆菌与Gal8的相关性显著降低，我们预测突变细菌与吞噬途径成分的相关性将降低。使用免疫荧光标记，我们测量了泛素的相关性（图)，第62页（图)和NDP52（图)WT和突变Mtb在2–72 hpi。最初，泛素与Mtb WT在5+2 hpi时的相关性非常低，但在5+24 hpi时增加到8-10%，并且始终保持在这个水平（图). 相反，从24到72 hpi，与WT菌株相比，MtbΔPDIM显示泛素水平非常低（24小时时减少63%到72小时时减少86%；图). 与PDIM在泛素识别中的作用一致，补充PDIM的菌株的水平与WT菌株相当。当p62（图)和NDP52（图)对定位进行了分析，得到了类似的结果。总的来说，在整个感染过程中，5-15%的WT细菌与自噬标记物相关，这与其他有关巨噬细胞的研究一致[46]. PDIM的缺失将这些水平降低到1-5%，表明PDIMs有助于外源性蛋白的招募。
当缺乏PDIM时，人类淋巴管内皮细胞中Mtb的异种吞噬标记物招募受损。三种与吞噬有关的蛋白质的免疫荧光定量分析：一泛素（Ub），b条第62页和c（c）NDP52。感染、免疫荧光标记、成像和定量的过程与图中解释的相同每个样品每个重复至少成像六个视场，并且进行三个独立的重复。还显示了每个条件下分析的Mtb颗粒总数(N个). 总体平均值用代表平均值标准误差的误差条表示。使用单向方差分析和Tukey后验确定统计显著性。结核分枝杆菌结核分枝杆菌，ns不显著，PDIM phthiocerol dimyocerosate，Ub泛素，WT野生型***第页 < 0.001, *第页 < 0.05
缺乏PDIM的结核分枝杆菌很少定位在hLEC的胞浆中
由于Mtb WT表现出比MtbΔPDIM更高的吞噬体损伤频率，下一个预测是WT菌株更有可能物理转移到细胞质。为此，我们对感染每种菌株的hLECs进行常规树脂包埋和透射电镜观察24小时（图). 我们之前已经在这些细胞中建立了条件，在这些条件下，完整吞噬体中的结核分枝杆菌可以与那些物理易位到细胞质中的结核分支杆菌明确区分[19]. 在这里，我们还区分了吞噬体/吞噬溶酶体中的结核分枝杆菌和被自噬结构包围的结核分枝病毒。用于区分三个不同亚群的超微结构标准在图的图例中进行了更详细的描述在获得电子显微镜图像后，我们使用无偏体视学方法量化位于三个不同隔间的细菌比例。数据显示，与Mtb WT相比，定位于胞浆中的MtbΔPDIM比例减少了60.4%，而膜结合（但非自噬）细菌的比例相应增加。因此，我们得出结论，Mtb WT中PDIM的存在有助于细菌逃离吞噬体内的特殊条件，并暴露于细胞质中的不同环境。
电子显微镜分析。缺乏PDIM的结核分枝杆菌在胞浆中的出现频率要低得多。用Mtb WT、MtbΔPDIM或Mtb△PDIM:：PDIM感染人淋巴管内皮细胞5+24h后固定。对样品进行树脂包埋处理，然后使用透射电子显微镜观察结核分枝杆菌的亚细胞定位。考虑并分类了三个潜在的位置。a–c细胞溶胶（定义为在表面可见的细菌囊样物质外，细菌周围没有明显的宿主膜）。d日–（f）吞噬体（定义为封闭在单个膜结合细胞器中的细菌）。其中大多数是较大的（膜结合的）液泡，通常有一个以上的结核分枝杆菌细胞，以及在不同降解阶段的额外不规则膜和内容物，典型的吞噬体。箭头表示吞噬体/吞噬溶酶体限制膜。克–我自噬。在这种情况下，细菌和周围的细胞质被一层或多层膜所包围，这些膜大多保存不良。与吞噬体相反，自噬体的内部内容物似乎没有被降解。这里的箭头表示在结构的外围上看不见的膜或膜的残留物。在所有的图像中，黑色恒星表示细菌。比例尺为500纳米。j个进行体视学分析以确定每个隔室中结核分枝杆菌的比例。数据是两个独立实验的代表，每个条件下至少分析32个感染细胞。结核分枝杆菌结核分枝杆菌，PDIM邻苯二甲酸二酯，野生型
hLECs中缺乏PDIM的结核分枝杆菌的细胞内负荷严重降低
尽管PDIMs已被证明对体内复制至关重要[5,7–9]在与本研究中使用的条件非常相似的情况下，PDIM缺乏不会影响人类巨噬细胞中的结核分枝杆菌负荷[10,14]. 然而，hLECs和巨噬细胞之间存在一些基本差异，这表明缺乏PDIM会影响hLECsMtb负荷。例如，与巨噬细胞相比，hLECs在细胞质中定位的结核分枝杆菌的比例要高得多[19,47]. 此外，与结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中观察到的大量细胞死亡相比，结核分枝杆菌对hLECs的感染导致宿主细胞死亡最少[19,48,49]. 由于这两株结核分枝杆菌都用GFP标记，我们可以使用每个细胞的总GFP信号作为细菌净生长的指标。因此，我们对每个Mtb菌株每hLEC细胞（GFP/cell）的总GFP信号从2到72 hpi进行了量化（图). 如前所述，由于结核分枝杆菌聚集导致的不准确，没有使用菌落形成单位的测量值[19]. 因为PDIMs已被证明是有效吞噬人类原代巨噬细胞所必需的[10]，我们首先检查了每个Mtb菌株在2 hpi时的摄取（图). 与之前的结果一致，与WT菌株相比，MtbΔPDIM的摄取平均减少38.2%。为了弥补这种减少，我们用MtbΔPDIM感染hLECs，MOI高出10倍，与WT菌株相比，平均摄取量增加了67.1%（图). 然后，我们测量了在感染72小时的过程中GFP/细胞信号的增加，并表明当hLECs中缺乏PDIM时，Mtb的复制受到严重抑制，WT平均增加11.1倍，而突变株增加2.12倍（图). 即使使用10倍高的MOI过度补偿摄取减少，平均GFP/细胞数也远低于具有正常MOI的WT菌株，并且显示出与正常MOI类似的2.03倍增加（图).
人类淋巴内皮细胞中缺乏PDIM的结核分枝杆菌的细胞内负荷严重降低。一每个时间点感染Mtb WT、MtbΔPDIM或Mtb△PDIM:：PDIM的人类淋巴管内皮细胞的代表性图像。此外，MtbΔPDIM的感染率是正常MOI的10倍，以过度补偿该菌株吞噬细胞摄取的减少。b条通过绘制5+2 hpi时每个细胞的总GFP信号（称为RAWIntDen），使用ImageJ测量每个菌株的吞噬细胞摄取量。每个重复至少分析六个视野，执行三个独立的重复。每个单元格的总平均GFP用代表平均值标准误差的误差条显示。使用单向方差分析和Tukey的后验来测试每个菌株的平均值之间的差异。c（c）每细胞GFP的测量方法与(b条)除了比较每个菌株的每个时间点（即细菌复制）。GFP绿色荧光蛋白，感染后hpi小时，MOI感染多重性，结核分枝杆菌结核分枝杆菌，ns不显著，PDIM phthiocerol dimyocerosate，WT野生型***第页 < 0.001, *第页 < 0.05
讨论
一些细胞内病原体（如结核分枝杆菌）会破坏吞噬体膜[35]. 当这种情况发生时，存在于细胞内膜小叶上的聚糖可以暴露于胞质溶胶中，并被胞质传感器（如半乳糖凝集素）识别[35]. 反过来，半乳糖凝集素招募选择性自噬机制，从而使病原体成为自噬途径的靶点，并最终在自噬体-溶酶体融合后被杀死。这一过程被称为异噬，即异物（本例中为Mtb）的选择性自噬。在本研究中，我们使用Gal8作为受损吞噬体的标记物，并结合自噬标记物（p62、泛素和NDP52），我们检测了PDIM在hLECs中Mtb的异种识别中的作用。与WT相比，噬菌体损伤和吞噬标记物与缺乏PDIM的结核分枝杆菌的相关性显著降低。对此结果的最简单解释是，吞噬体损伤可能是结核分枝杆菌自身暴露的先决条件，结核分枝杆菌衍生的成分，如DNA和宿主聚糖，位于吞噬体膜的内叶上，以排他性机制存在。事实上，标记异种吞噬标记物的Mtb-WT相关结构的较高比例与Gal8可接近的吞噬体的较高百分比一致。虽然标记与Mtb的关联性通常较低（例如，Mtb WT的6–10%和MtbΔPDIM的1–4%在2–72 hpi的每次快照中与Gal8共定位；图)吞噬体损伤、病原体识别和自噬小室靶向可能是动态和暂时的[36]，但这仍有待精确确定。重要的是，Mtb细胞内转运的差异可能与TLR激活无关，因为hLECs中的NF-kB和IRF-1激活与缺乏PDIM的Mtb WT和Mtb相似。
我们的数据显示，与Mtb WT相比，缺乏PDIM的Mtb与溶酶体标记CtsD共同定位的频率更高（24hpi时为54%对35%）（图). 这与已报道的人类巨噬细胞的情况不同，其中含有和不含PDIM的结核分枝杆菌与溶酶体标记物CD63的相关性相同（在24 hpi时约为25%）[10]. 尽管Mtb在巨噬细胞和hLECs中的运输可能不同，但我们假设这种减少是由于Mtb能够定位在hLECs的胞质溶胶中，从而避免吞噬溶酶体的命运。支持这一点，我们测量了PDIM对Mtb在吞噬体和胞浆中定位的影响（图)这是第一次。我们确定，约50%的细菌在24小时后成功转移到胞浆中，但在没有PDIM的情况下只有21%（图). PDIM参与吞噬体损伤的最新报道[14–16]由于这些技术和实验无法区分细胞溶质定位和进入，因此无法确定结核分枝杆菌向细胞溶质的易位是否受到影响。通过使用这些方法，单个受损吞噬体的形成将产生积极的结果，而不需要确定细胞溶质定位的程度，这是一个需要考虑的关键事件。在这里，我们使用了TEM，当仔细制备样品时，TEM确实显示了Mtb周围是否存在宿主膜。虽然化学固定和随后的脱水步骤可能会影响吞噬体膜的保存并增加膜受损的吞噬体总数，但不同突变体之间的比较明确表明，PDIM有助于hLECs中Mtb的胞质移位。这在巨噬细胞中尚未见。
我们假设在hLECs中，Mtb优先在胞浆中复制。与此一致的是，PDIM突变体逃逸到细胞溶质的距离较小，对hLECs的生长有明显抑制作用。虽然PDIM突变体在体内减弱[5,7–9]据我们所知，在使用PDIM突变体的结核分枝杆菌感染细胞模型中，在高MOI下，无PDIM菌株没有复制缺陷[10,14]. 此外，在低MOI下，缺乏PDIM的菌株仅表现出中度复制缺陷[13,14]或无显著差异[11]. 一项在PDIM基因座中使用转座子突变体的研究表明，五个菌株中有三个菌株的负担减轻，而五个中有两个与WT相同；然而，这些差异可能是由于非目标效应，这在使用转座子时是可能的[8]. 在本研究中，我们使用了较高的MOI，以与文献相一致，并与我们之前的研究相一致[19]. 我们表明，与巨噬细胞的报道不同，与WT相比，MtbΔPDIM的负担显著减轻。即使感染了10倍高的MOI（对ΔPDIM摄取减少的过度补偿），也不会导致比原始MOI时的WT负担更高。因此，当hLEC中没有PDIM时，会有明显的衰减。
PDIM突变体的体内衰减被认为是由于对巨噬细胞产生的活性氮中间产物的敏感性增加以及感染早期免疫反应的激活增强所致[11]. 无PDIM突变体已被证明在阻止v-ATP酶向吞噬体膜募集方面效率较低，并且更常见于酸化的隔室中。然而，这并没有导致Mtb在吞噬小体中的程度存在差异[10]也许可以解释为什么细胞内负荷没有差异。相反，我们观察到PDIM突变体与吞噬体标记CtsD共存的程度显著增加。这一结果与我们在相同模型和相同感染条件下观察到的RD-1突变相似。我们之前的研究表明，大部分结核分枝杆菌细胞转移到hLECs的胞浆中，而不会导致细胞死亡[19]. 我们推断，这种易位是一种避免被吞噬体杀死的机制。这种Mtb在hLECs中的胞质复制与巨噬细胞相比具有根本性差异，巨噬细胞的胞质易位与细胞死亡有关[49]以及在死细胞中广泛复制结核分枝杆菌[48]. 因此，PDIM菌株在胞浆中定位能力的降低将在很大程度上解释为什么PDIMs对hLECs的复制至关重要，而在巨噬细胞中则不那么重要（或根本不重要）。然而，细胞液中仍有21%的PDIM阴性结核分枝杆菌存在，但这似乎并没有增加细胞内负担。因此，PDIM可能通过其他机制间接或直接影响hLECs的复制。一种可能的机制可能与报道的PDIM阴性结核分枝杆菌菌株中结核分枝杆菌细胞壁的高渗透性有关[29]. 与Mtb WT相比，PDIM-less Mtb对抗菌细胞溶质成分更为敏感，例如内皮型一氧化氮合酶产生的一氧化氮，这是可行的，我们之前发现其靶向细胞溶质Mtb[19].
肺外结核占所有病例的25%，淋巴结感染是结核传播的关键阶段。因此，缺乏PDIM的Mtb缺乏hLECs的生长，这可能是导致细胞内巨噬细胞缺乏PDIMs仅产生轻微影响的报道与PDIM对体内毒力至关重要的报道之间存在不一致的许多原因。此外，这表明靶向PDIM合成在药理学上可以显著减少Mtb在体内的淋巴库，从而减少Mtb的传播和再激活。支持这一点的是，吡嗪酰胺（一线抗结核药物）的两种已知作用机制之一以PDIM合成为靶点[50]，但由于靶向PDIM合成，该药物对结核分枝杆菌淋巴池的影响尚不清楚。
随着人们越来越认识到PDIM是结核分枝杆菌与宿主相互作用的关键因素，有必要考虑用于感染的菌株的PDIM状态。此外，就PDIM/ESX-1的表达和分泌水平而言，结核分枝杆菌很可能以异质群体的形式存在，即使是作为克隆群体制备。这些因素可能解释了文献中关于细胞内贩运、复制、诱导宿主细胞死亡、宿主细胞死亡类型和细胞内/细胞外信号传递的许多差异，并应予以考虑。
结论
我们确定，当感染5+2小时后，hLECs中Mtb中没有PDIMs时，吞噬体损伤程度至少减少50%。吞噬体损伤的减少与吞噬体内结核分枝杆菌的增加有关。我们还发现，PDIM的缺乏导致了吞噬标记物招募的减少，这很可能是由于缺乏吞噬体膜损伤，因此，吞噬受体对结核分枝杆菌和/或结核分枝杆菌衍生核酸的胞质监测途径的获取减少。超微结构分析证实，缺乏PDIM的结核分枝杆菌在感染5+24小时后很少定位于hLECs的胞浆中。最后，我们确定hLECs中缺乏PDIM的结核分枝杆菌的细胞内负荷严重降低。这项工作强调PDIM是hLECs中结核分枝杆菌的一个关键毒力因子，并表明PDIM合成的药理靶向性可能导致人类淋巴系统中结核分枝菌的蓄积减少。对于更广泛的结核病领域，这项工作进一步强调了确保培养的结核分枝杆菌种群PDIM阳性的重要性，因为PDIM在体外培养过程中经常丢失[6]这可能会对赛璐珞产生多种有害后果。
方法
真核细胞培养
初级hLEC（ScienceCell研究实验室）按照供应商的指示培养，直至第5段。hLECs以每厘米5000个细胞的密度播种2放入涂有纤维连接蛋白（Sigma-Aldrich）的T-75烧瓶中，在37°C下过夜。hLECs在37°C和5%CO下培养2在补充有5%（v/v）胎牛血清（ScienceCell Research Laboratories）和1%（v/v）内皮细胞生长补充剂的内皮细胞培养基（ECM）（Science cell Resulting Laboratory）中过夜。然后用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，并更换培养基。细胞生长至90%融合，使用2.5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）从烧瓶中分离并用于实验（或传代到新烧瓶中）。对于共焦显微镜，将300μL中的10000 hLEC和完整的ECM接种到经纤维连接蛋白处理的1.5厚10-mm直径的玻璃盖玻片（Glaswarenfabrik Karl Hecht）上，盖玻片放置在经组织培养处理的24孔板的每个孔中。对于电子显微镜，在纤连蛋白处理的T-25烧瓶中，将300000个hLEC接种在5mL中，并具有完全的ECM。
细菌菌株和培养
本研究中使用的结核分枝杆菌菌株由C.Asterie-Dequeker善意提供，用于[10]. 这些菌株的详细描述，包括用于消除和补充ppsE（磅/平方英寸）基因，以及使用整合GFP标签荧光标记细菌，提供于[10]. 在本研究中，我们将Mtb-GFP WT菌株称为Mtb-WT，将Mtb-GFP PMM100菌株称为MtbΔPDIM，将Mtb-GFP PMM100:：pMVE菌株称为MtbΔPDIM:：PDIM。在添加了0.05%（v/v）甘油（Fisher Chemical）、10%（v/v）Middlebrook白蛋白脱羧酶（BD Biosciences）和0.05%（v/v）吐温80（Sigma-Aldrich）的Middle布鲁克7H9肉汤培养基中培养分枝杆菌。10 mL培养物在37°C下在50 mL Falcon试管中旋转培养。
结核分枝杆菌感染hLECs
结核分枝杆菌生长到中等指数阶段，并于2000年造粒克在室温（RT）下，在台式离心机中放置5分钟。用10 mL PBS清洗一次颗粒，用10 mL ECM清洗一次，每次清洗后重新装粒。向颗粒中添加五个2.5–3.5 mm无菌玻璃球（VWR，300米的慢速旋转克进行5分钟，将顶部的8毫升悬浮液小心转移到新的Falcon试管中。外径600并在ECM中稀释混合物以获得10个细菌对1个hLEC的MOI（假设OD 0.1的细胞悬浮液含有107分枝杆菌/mL；数据未显示），在24孔板中每孔的总体积为300μL ECM或每T-25烧瓶的2 mL ECM。感染5小时后（37°C，5%CO2)，用PBS洗涤细胞两次以去除细胞外细菌，然后添加1mL（对于24孔板）或5mL（对于T-25烧瓶）完整ECM，并培养2、24、48和72小时。
抗体
本研究中使用了以下主要抗体：山羊抗Galectin 8（R&D Systems，AF1305；AB_2137229；1:250稀释）、兔抗CtsD（由Andrej Hasilik提供；1:100稀释）、小鼠抗泛素FK2（Enzo，BML-PW8810；批号08101527；AB_10541840；1:100稀稀释）、家兔抗p62（GeneTex，GTX111393；批号40450；AB_10723101；1:500稀释）、兔抗NDP52（由J.Kendrick-Jones提供；1:250稀释）、家兔和ti-IRF-1（细胞信号，8478第2批；1；250稀释）和兔抗p65（Abcam，ab16502；批次GR3182233；1:250稀稀释）。在RT条件下，按所示稀释度将所有样品培养1小时。本研究中使用了以下二级抗体，稀释度为1:800：山羊抗兔Alexa Fluor-568（Thermo Fisher；A11036；批次1704462 AB_143011）、山羊抗鼠Alexa Fluor-633（Thermo-Fisher，A21052；批次1712097；AB_141459）和牛抗羊Cy3（Jackson ImmunoResearch；805-165-180；AB_2340880）。
间接免疫荧光
在要求的时间点，通过去除培养基，用1mL PBS洗涤一次，然后在4°C下加入含有3%（v/v）无甲醇多聚甲醛的PBS（电子显微镜科学）过夜，将感染Mtb的hLEC固定在玻璃盖玻片上。然后用1 mL 50 mM NH对样品进行淬火4室温下，PBS中的Cl（Sigma-Aldrich）保持15分钟，然后在室温下，用500μL 0.05%（w/v）皂苷（Sigma Aldrich。在盖玻片干燥之前，将50μl稀释的一级抗体（在含有0.05%皂苷和1%BSA的PBS中）添加到盖玻片上，然后在室温下用湿组织在黑暗中培养1小时。然后，将盖玻片转移回24孔板的孔中，并用1 mL PBS洗涤三次，每次洗涤5分钟。二级抗体的添加方式与一级抗体相同。再进行两次PBS洗涤后，在RT条件下，使用1 mL 300 nM DAPI（Life Technologies）在PBS中对DNA进行染色10分钟。再次清洗盖玻片，最后使用8μL DAKO贴装介质（DAKO Ceotomation）将盖玻片贴装到玻片上。
荧光成像和分析
我们使用的徕卡SP5激光扫描共聚焦显微镜配有声光分束器（徕卡微系统），该分束器配备HC PL APO CS2 63×，1.4 NA油物镜、紫外激光（405 nm激发）、氩激光（488 nm）、二极管泵浦固体激光（561 nm）、HeNe激光（633 nm）、，一个光电倍增管探测器和两个HyD探测器，用于固定样品的所有成像，使用徕卡F型（徕卡微系统）浸油。图像采集使用莱卡LAS AF专利软件（莱卡微系统），设置如下：氩激光设置为20%，扫描模式xyz，顺序采集，像素分辨率1024×1024，扫描仪频率200 Hz，平均线4，变焦1，8位采集。所有采集设置在重复之间保持不变。每个样本至少分析六个随机视野，至少进行三次独立重复（除非另有说明）。
徕卡SP5文件（lif）是使用FIJI打开的，FIJI是ImageJ（美国国立卫生研究院）的一个发行版。为了测量Mtb的细胞内复制（即每个hLEC的GFP信号），使用“线”工具绘制细胞轮廓以创建感兴趣的区域，并复制GFP通道。任何超出感兴趣区域的内容都被清除，GFP通道的像素阈值一致为50，因此创建了一个二进制图像，其中每个GFP像素的值为255。GFP像素的总和称为RAWIntDen。因为每个GFP像素是0.24×0.24μm，并且值为255，所以RAWIntDen可以转换为每hLEC的总GFP面积（μm2)使用以下方程式：（RAWIntDen×（0.24×0.24））/255。
为了测量标记（例如Gal8）与细菌的关联，我们测量了标记通道中与细菌通道中GFP重叠的所有像素的平均强度。这是通过将多通道图像分割成单独的通道并使GFP通道经受50的一致像素阈值以创建掩模来完成的。口罩使用“填充孔”、“扩张”（1像素）和“腐蚀”（1象素）工具，以创建细菌真实轮廓的良好表示。然后使用FIJI的“分析粒子”功能，并将测量结果重定向至标记通道。
超微结构分析
感染5+24小时后，通过向培养基中以1:1的体积比直接添加200 mM HEPES（pH 7.4）中温的2%戊二醛，将T-25烧瓶中感染Mtb的hLECs固定在培养基中。5分钟后，将其替换为200mM HEPES中的5 mL 1%戊二醛，并在4°C下保持pH 7.4过夜。随后，轻轻刮取细胞，并将其嵌入1%低熔点琼脂糖中（赛默飞世尔科技公司）。用含有1.5%铁氰化钾的2%四氧化锇溶液（电子显微镜科学）在冰上固定试块2小时，然后用1%单宁染色30分钟，用2%醋酸铀酰水溶液（电子显微科学）在室温下染色2小时。接下来，细胞在RT时脱水，首先使用分级乙醇系列（70%、80%、90%、95%和100%），最后使用环氧丙烷，然后用Spurr树脂（Polysciences）在2天内逐渐渗透。使用超薄切片机Ultracut EM UCT（徕卡微系统公司）和金刚石刀（Diatome）切割超薄切片（~70 nm），并与0.2%柠檬酸铅进行15秒的对比。用JEM-1400 TEM（JEOL）对切片进行分析。使用TemCam-F216相机和EM-MENU软件（TVIPS）拍摄图像。
每个样本至少有32个不同的感染细胞通过系统随机抽样成像。对于亚细胞定位分析，细胞溶质、吞噬体/吞噬体或自噬细菌被分类，如图图例所示它们的相对比例是通过计算细菌体视学测试网格的交叉点来确定的。比例是根据每个样本的总计数来计算的。
数据和统计分析
结果表示为三个独立实验的平均值（除非另有说明）±平均值的标准误差。使用Graphpad Prism 6（Graphpad Software Inc）绘制数据并进行统计分析。使用单向方差分析和Tukey后验对三个或更多组之间的平均值进行显著差异测试。
致谢
我们感谢John Kendrick-Jones提供的NDP52抗体和Andrej Hasilik提供的CtsD抗体。我们还感谢Catherine Astarie-Dequeker慷慨提供本研究中使用的结核分枝杆菌菌株以及奥斯陆大学生物科学系的电子显微镜实验室。
基金
这项工作得到了弗朗西斯·克里克研究所（MGG）的支持，该研究所的核心资金来自英国癌症研究所（FC001092）、英国医学研究理事会（MC_UP_1202/11，FC001091）和威康信托基金（FC00109）。德国研究基金会（DFG SPP1580）为GG和UR提供了额外资金。
数据和材料的可用性
本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文中。
缩写
| 方差分析 | 方差分析 |
| 英国标准协会 | 牛血清白蛋白 |
| CtsD公司 | 组织蛋白酶D |
| DAPI公司 | 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚 |
| 发动机控制模块 | 内皮细胞培养基 |
| ESAT-6型 | 6kDa早期分泌抗原靶点 |
| ESX-1型 | ESAT-6分泌系统 |
| 镀锌8 | 半乳糖凝集素8 |
| GFP公司 | 绿色荧光蛋白 |
| hLEC公司 | 人淋巴管内皮细胞 |
| 高性能指数 | 感染后小时数 |
| 生命周期3 | 微管相关蛋白1A/1B轻链3 |
| 内政部 | 感染的多重性 |
| 结核分枝杆菌 |
结核分枝杆菌
|
| 纳 | 数值孔径 |
| NDP52型 | 抗原核点52kDa蛋白 |
| 纳秒 | 不重要 |
| 第62页 | 后遗体1/核孔蛋白62 |
| 美国公共广播电视公司 | 磷酸盐缓冲盐水 |
| PDIM公司 | 二甲基果酸硫铈 |
| RT公司 | 室温 |
| 结核 | 肺结核 |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 |
| Ub（英国） | 泛素 |
| 重量 | 野生型 |
作者的贡献
TRL、UR、GG和MGG设计了实验并撰写了手稿。TRL、CJQ、AF和UR进行了实验。TRL、AF、UR和MGG分析了数据。所有作者阅读并批准了最终手稿。
伦理批准和参与同意
不适用。
出版商备注
Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。
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