基质硬化和TGF-β1对特发性肺纤维化患者成纤维细胞胶原平衡失调的影响：FAK/Akt的作用

2.2. TGF-β1和基质硬化联合作用对致密三维胶原Ⅰ凝胶培养的正常成纤维细胞COL1A1和胶原溶解性MMPs表达的影响

将外源性TGF-β1添加到3D培养物中并维持约4天，这足够时间扩散到胶原蛋白-I水凝胶中[34]. TGF-β1显著增强COL1A1公司对照组织原代成纤维细胞的表达(n个=3）在3D胶原蛋白-I凝胶中培养，使正常（浮动）凝胶中的mRNA水平增加约300%(图2A） 在纤维样（附着）凝胶中增加约400%(图2B） 具有统计学意义。此外，我们注意到，在TGF-β1缺乏（约25%）或存在（约50%）的情况下，与漂浮凝胶相比，附着的总mRNA水平略高，因此表明基质硬化与TGF-α1之间存在积极的协同作用。这些结果表明COL1A1公司TGF-β1的表达，在标准2D组织培养塑料中已被广泛报道[7,17]，可延伸至3D胶原蛋白-I凝胶诱导的正常软微环境。

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图2

转化生长因子-β1对qRT-PCR评估的mRNA水平的影响COL1A1公司来自对照组织的原发性肺成纤维细胞中的MMP胶原酶(n个=3，自发性气胸患者）在3D漂浮/附着胶原蛋白I凝胶中培养。(一,B类)COL1A1公司漂浮状态下的mRNA水平(一)和附件(B类)凝胶。(C类,D类)基质金属蛋白酶1漂浮状态下的mRNA水平(C类)和附件(D类)凝胶。(电子,F类)基质金属蛋白酶2漂浮状态下的mRNA水平(C类)和附件(D类)凝胶。(G公司)显示分泌型MMP2活性的典型明胶酶谱图（左图）。活性MMP2相对于总MMP2（pro-MMP2+MMP2）百分比的相应量化（右侧面板）*第页≤ 0.05, **第页≤ 0.01, ***第页此处及之后≤0.005由配对学生的t吨-测试。除非另有说明，否则所有成纤维细胞在此处和之后用TGF-β1治疗约4天。

不同COL1A1公司，TGF-β1诱导基质金属蛋白酶1在纤维化前（附着）凝胶中（约−40%，图2D） 尽管没有达到统计学意义。相反，TGF-β1增强了平均基质金属蛋白酶1mRNA水平在正常（浮动）凝胶中约为140%，具有统计学意义，并且在所有供体的成纤维细胞中均观察到这种增加(n个= 3) (图2C） 。这些发现首次揭示了COL1A1公司和基质金属蛋白酶1由TGF-β1在这里和其他地方的硬培养基中报告[14,15]不适用于表现出正常硬度的软3D胶原蛋白-I凝胶。

不同基质金属蛋白酶1,基质金属蛋白酶2在漂浮（约60%）和附着（约30%）凝胶中，TGF-β1刺激后略有增加，尽管在前一种情况下这种增加仅具有统计意义(图2E、 F）。此外，与基质金属蛋白酶1和COL1A1公司,基质金属蛋白酶2漂浮凝胶和附着凝胶中的mRNA水平非常相似。明胶酶谱也观察到，在漂浮和附着条件下，活性MMP2的百分比相似，TGF-β1的调节较弱(图2G、 右侧面板）。鉴于弱转录调控基质金属蛋白酶2通过TGF-β1或基体硬化，我们将分析限制在COL1A1公司和基质金属蛋白酶1在随后的实验中。

2.3. TGF-β1和基质硬化联合作用对2D胶原Ⅰ包被PAA凝胶培养的正常成纤维细胞COL1A1和MMP1表达的影响

为了分析成纤维细胞在纤维样机械微环境中对TGF-β1的转录反应，对照组织中的成纤维细胞培养在2D胶原蛋白I包被的PAA凝胶中，显示出正常或纤维样硬度，如图1B.在3D培养中，TGF-β1增强了COL1A1公司在软（正常样）和硬（纤维样）PAA凝胶中具有统计意义(图3A、 B）。然而，与3D文化不同COL1A1公司无论PAA凝胶的硬度如何，TGF-β1诱导的mRNA（~230%）和mRNA水平的范围都非常相似。此外，我们注意到2D PAA凝胶中的mRNA水平比3D胶原蛋白I凝胶平均高约3.5倍，这表明微环境的维度调节TGF-β1的转录活性。

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图3

转化生长因子-β1对qRT-PCR评估的mRNA水平的影响COL1A1公司CCD-19Lu成纤维细胞和来自外科肺癌患者未累及区域的原发性肺成纤维细胞中MMP1和MMP1的表达(n个=6）在胶原蛋白I包被的2D PAA凝胶中培养。(一,B类)COL1A1公司凝胶中的mRNA水平呈正常状态(一)或纤维状(B类)刚性，如所示图1B(C类,D类)对应基质金属蛋白酶1如B-C中培养的成纤维细胞的mRNA水平图2.

与3D培养不同，TGF-β1下调基质金属蛋白酶12D软（类正常）和硬（类纤维）PAA凝胶中的mRNA分别减少了约−30%和约−40%，在后一种情况下，这种下调具有统计学意义(图3C、 D）。此外基质金属蛋白酶1与软PAA凝胶相比，硬PAA凝胶中的mRNA略高，总的来说，3D培养中的mRNA平均比2D PAA凝胶高9倍，进一步扩大了TGF-β1的转录活性受培养条件维度的调节。

总之，我们的结果表明，TGF-β1依赖性的反调节COL1A1公司和基质金属蛋白酶1mRNA在纤维化前3D胶原蛋白-I凝胶或纤维化样2D PAA凝胶诱导的僵硬条件下定性相似，但定量不同。相比之下基质金属蛋白酶1TGF-β1在最温和的条件下诱导的细胞增殖与培养分析的维度密切相关。

2.4. TGF-β1和基质僵化在基因表达中联合作用的线性模型

定量分析TGF-β1与基质硬化在调节特定基因mRNA中的潜在相互作用(R（右）)，我们使用了一个简单的线性模型，形式如下：

哪里R（右）_o个是指在缺乏TGF-β1的软微环境中的基础mRNA表达，Δ电子和ΔC类凝胶硬度的增加(电子)或TGF-β1浓度(C类),一和b条是基因表达和僵硬性之间的比例因子(一)或TGF-β1浓度(b条)、和ξ是刚度和TGF-β1浓度之间的相互作用或耦合系数。每个条件的实验值与模型之间的关系如下：R（右）_软的=R（右）_o个,R（右）_软+TGF-β1=R（右）_o个+b条ΔC类,R（右）_僵硬的=R（右）_o个+一个Δ电子和R（右）_{刚性+TGF-β1}=R（右）_o个+一个ΔE+b公司ΔC+ξΔ电子ΔC类.

根据我们的线性模型，软组织中含有或不含有TGF-β1的基因表达差异（ΔR（右）_软的=R（右）_软+TGF-β1−R（右）_软的)和刚度（ΔR（右）_僵硬的=R（右）_{刚性+TGF-β1}−R（右）_僵硬的)凝胶应该是

因此，模型预测为ΔR（右）_僵硬的/ΔR（右）_软的=1在没有相互作用的情况下（即。，ξ=0），而ΔR（右）_僵硬的/ΔR（右）_软的否则≠1(ξ≠ 0).

为了将模型的预测与我们的数据进行比较，我们计算了比率ΔR（右）_僵硬的/ΔR（右）_软的对于每个患者和化验，相应的平均值显示在图4这些计算表明，平均比率ΔR（右）_僵硬的/ΔR（右）_软的持续增长约1.5倍COL1A1公司在这两种3D文化引发的最严酷的条件下(图4A） 和2D PAA凝胶(图4B） 虽然仅在前一次检测中达到了统计学意义。同样，ΔR（右）_僵硬的/ΔR（右）_软的对于基质金属蛋白酶1在这两种分析中，硬度始终低于-0.5，且在最硬的条件下具有统计学意义(图4C、 D）。因此，该分析表明TGF-β1和基质硬化在转录水平上对COL1A1公司和消极的基质金属蛋白酶1相反，我们发现TGF-β1和基质硬化之间只有适度的积极协同作用基质金属蛋白酶2在3D文化中(补充材料图S1).

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图4

TGF-β1与基质硬化之间潜在转录协同作用的分析COL1A1公司和基质金属蛋白酶1对照组为原代肺成纤维细胞。(一,B类)平均差异COL1A1公司在每个患者的软基质和硬基质中测量不含TGF-β1的我们的表达，并将其归一化为使用3D胶原蛋白-I凝胶在软基质中获得的相应差异(一)或2D PAA凝胶(B类). 患者与图2和图3. (C类,D类)相应的褶皱变化基质金属蛋白酶1。水平虚线表示没有折叠变化。更多细节见正文*第页对于无变化（1），≤0.05由Student’s确定t吨-测试。

2.5. TGF-β1对COL1A1和MMP1mRNA水平的反向调节与FAK/Akt通路的激活有关

大量工作强调了整合素ECM受体在传感机械微环境并将其转化为成纤维细胞和其他细胞类型的生物反应中的关键作用[27,35,36]. 此外，我们最近报道，单独的基质硬化通过在tyr397（FAK）处磷酸化粘着斑激酶（FAK）来增加肺成纤维细胞中的整合素机械感应^Y397年)从而增强了下游目标Akt的活动[37]通过S473的磷酸化（Akt^第473页) [35]. 此外，其他研究组也表明TGF-β1增加了FAK^Y397年和Akt^第473页在2D培养的成纤维细胞中[38]. 此外，Akt抑制剂持续诱导减少COL1A1公司伴随着基质金属蛋白酶1成纤维细胞中[15]. 因此，所有这些先前的观察结果都提出了以下可能性：COL1A1公司和基质金属蛋白酶1β1可能参与FAK/Akt途径。为了检验这种可能性，我们首先对在标准组织培养塑料基质（即2D培养基）中培养的成纤维细胞中TGF-β1刺激后，通过Ser473磷酸化对Akt激活进行了时间进程分析，发现Akt在6小时时有强烈激活(图5A和补充材料图S2). 接下来，我们利用了一个基于小鼠胚胎成纤维细胞（FAK野生型（FAK））的成熟遗传模型^+/+)或FAK空（FAK^−/−) [39]. TGF-β1刺激诱导Akt增加^第473页FAK中6小时后^+/+但不是FAK格式^−/−成纤维细胞在标准2D培养基提供的僵硬条件下培养(图5B） ●●●●。同样，TGF-β1治疗4天也增加第1a1列同时减少百万帕FAK中的mRNA水平^+/+成纤维细胞(图5C、 D），相当于鼠标COL1A1公司和基质金属蛋白酶1分别是。相比之下第1a1列其中FAK值低两个数量级^−/−与FAK相比^+/+成纤维细胞，在TGF-β1刺激下未能增加(图5C） ，而百万分之一无法在FAK中检测到^−/−即使在qRT-PCR系统中将cDNA数量增加5倍后，成纤维细胞(图5D） ●●●●。这些结果表明，FAK对于逆调节第1a1列和百万帕TGF-β1在僵硬微环境中的mRNA水平，与Akt活性增加有关。

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图5

反转录调控中FAK-Akt串扰的分析第1a1列和百万帕在FAK野生型（FAK）的僵硬微环境中通过TGF-β1^+/+)和FAK空（FAK^−/−)成纤维细胞。(一)显示Akt时间进程表达的典型Western blot^第473页TGF-β1刺激6小时后成纤维细胞中的总Akt和β-actin(B类)Akt的代表性Western印迹^第473页FAK的总Akt和α-微管蛋白^+/+和FAK^−/−TGF-β1刺激成纤维细胞6h；（右）Akt的相应密度分析^第473页/阿克特(n个= 3). (C类,D类)相应的mRNA水平第1a1列(C类)和百万帕(D类)TGF-β1刺激成纤维细胞约4天。百万帕无法在FAK中检测到^−/−成纤维细胞。Student’s进行了两组比较t吨-测试。

3.2. 基质硬化和转化生长因子-β1之间转录协同作用的第一个直接定量证据以及FAK/Akt途径的潜在作用

很少有先前的研究从以下方面检验了单独的基质硬化对成纤维细胞的影响COL1A1公司转录[7,17,18,43]甚至更少基质金属蛋白酶1[7]. 在缺乏TGF-β1的情况下，2D PAA凝胶和3D培养物诱导的COL1A1公司在约10–25%的范围内，这与COL1A1公司在2D PAA凝胶培养的心脏和肺成纤维细胞中报告[7,18]. 然而，我们观察到COL1A1公司低于其他使用3D培养物或2D PAA凝胶的研究中报告的150-190%的增长[17,18,43]这可能与不同的实验条件或来源组织有关。另一方面，我们发现在没有TGF-β1的情况下，基体硬化增加基质金属蛋白酶1在3D培养中减少了约1%基质金属蛋白酶12D PAA凝胶减少约80%，与其他地方报道的2D PAB凝胶减少70%类似[7]. 然而，据我们所知，这是第一个为成纤维细胞中基质硬化和TGF-β1之间的逆转录协同作用提供直接定量证据的研究，这对COL1A1公司和负值基质金属蛋白酶1.

就机制而言，有四种证据支持FAK/Akt途径可能在TGF-β1和基质硬化对胶原稳态的转录共同调节中发挥重要作用。首先，Akt是通过PI3k进行FAK活动的已知下游目标[37,44,45]. 第二，FAK的活动^Y397年和Akt^第473页受到两种矩阵刚度的上调[19,35]和TGF-β1[38,46]. 第三，药物抑制Akt或其下游靶点mTOR一直导致成纤维细胞中胶原蛋白I下调，同时MMP1上调[15,47,48]. 第四，其他部位通过机械拉伸增加胶原蛋白表达需要Akt[49]. 然而，除了FAK/Akt途径外，我们可以根据先前的观察，设想基质硬度和TGF-β1通过转录调节胶原稳态的其他潜在机制，包括基质硬化诱导的TGF-α表达的直接变化[50,51]，骨桥蛋白上调[52]或基质硬化敏感转录因子YAP/TAZ和调节性SMAD之间的串扰[53]. 因此，关键机制的最终阐明需要进一步研究。

3.3. 利用2D和3D培养分析比较成纤维细胞对基质硬化和TGF-β1的反应，为基质维度在调控成纤维细胞转录反应中的作用提供了新的见解

3D培养物有望比传统2D培养物在生理上更具相关性，因为它们提供了来自组织微环境的关键线索，包括与天然ECM组件的粘附和3D架构[41,42]. 然而，目前基于胶原蛋白I凝胶的3D培养在纤维化背景下的机械生物学研究中有一定的局限性，因为它们无法捕捉到肺纤维化中报告的完全硬化[7,24,54]. 相比之下，2D PAA凝胶覆盖了肺纤维化的硬化，但忽略了组织的3D结构。尽管存在差异，但3D培养物和2D PAA凝胶一致显示第1列伴随着下调基质金属蛋白酶1在最硬的凝胶条件下刺激TGF-β1，但在最软的条件下不刺激。这种差异表明TGF-β1转录调控基质金属蛋白酶1强烈依赖于成纤维细胞微环境的维度。同样，我们发现在COL1A1公司和基质金属蛋白酶1在3D培养物和2D PAA凝胶之间，其中COL1A1公司更高基质金属蛋白酶1后一种凝胶中含量较低。较大的mRNACOL1A1公司2D PAA凝胶中的水平与先前报道的2D培养细胞的代谢和转录活性与3D凝胶相比增加的研究一致[55,56]这在一定程度上与前一种情况下对内源性ECM的需求增加有关[56,57]. 相比之下，较大的基质金属蛋白酶13D培养中的表达可能反映了这些凝胶中胶原蛋白I的过度浓度。另一方面，值得注意的是，之前的一项研究报告了使用2D PAA凝胶和3D漂浮/附着凝胶对基质硬化的细胞反应，这两种凝胶在分化标记物表达方面定性一致，但定量不一致[27]. 总的来说，后一项研究和我们的结果支持，比较具有可调弹性的2D和3D凝胶是一种合适的方法，可以识别那些主要由基质硬化而非基质维度驱动的细胞响应。

4.2. 标准2D组织培养塑料中的细胞培养（2D培养）

如前所述，在标准2D培养基中培养正常人成纤维细胞系CCD-19Lu（ATCC）和原代成纤维细胞[35,40]. 简言之，将成纤维细胞快速解冻并保存在含有DMEM的成纤维细胞培养基中，DMEM补充有10%FBS（FBS Gold，PAA Laboratories，GE Healthcare，Little Chalfont，UK）和抗生素。原代成纤维细胞最多使用5-6代以防止复制性衰老。野生型（FAK）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）^+/+)或FAK缺陷（FAK^−/−)正如其他地方报道的那样，小鼠（ATCC）在DMEM培养基中培养[39]. 所有培养物都保存在5%的CO中₂37°C下的增湿培养箱。对于2D培养实验，MEF被播种为12×10^三细胞/厘米²（传真^+/+)或20×10^三细胞/厘米²（传真^−/−)在无血清培养基中加入或不加入5 ng/mL人TGF-β1（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）约4天。

4.3. 三维胶原蛋白I凝胶中的细胞培养

如前所述，实验当天刚制备了用于3D培养的胶原蛋白-I溶液[29,34]. 简而言之，在DMEM中中和酸溶性胶原蛋白I（Cellagen IAC-50，Koken，Tokyo，Japan）以获得4 mg/mL胶原蛋白溶液。所有3D培养均在24孔板中进行。首先，用一层薄薄的胶原蛋白I溶液预先覆盖微孔，以防止细胞迁移。其次，将成纤维细胞胰蛋白酶化，并用胶原蛋白I溶液在0.9×10的条件下重新悬浮⁶将细胞/mL和215μL该混合物添加到孔中，在37°C下培养30分钟，并立即用90μL无血清培养基水合。所有样品在使用前均保存在培养箱中。24小时后，用无菌抹刀将一半凝胶轻轻地从微孔容器边缘分离，而另一半凝胶保持附着[27]用新鲜无血清培养基代替培养基，在无或存在5 ng/mL人TGF-β1（R&D系统）的情况下培养约4天。

4.4. 二维PAA凝胶中的细胞培养

胶原蛋白-I包被聚丙烯酰胺（PAA）凝胶是按照其他地方描述的类似方案获得的[27,35,71]. 简言之，凝胶是通过混合不同比例的丙烯酰胺（AA；3-12%）和双丙烯酰胺（bis；0.22-0.6%）制备的（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。聚合后，用Sulfo-SANPAH（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）衍生PAA凝胶表面，并涂覆0.1 mg/mL胶原蛋白I（Millipore，Billerica，MA，US）。成纤维细胞接种于8×10^三细胞/厘米²在含有或不含5 ng/mL人TGF-β1（研发系统）的无血清培养基中培养约4天。

4.5. 原子力显微镜测量弹性纳米压痕

杨氏弹性模量电子如其他地方详细描述的那样，使用自制的适用于倒置光学显微镜的独立AFM对3D胶原蛋白-I凝胶和2D PAA凝胶进行评估[27,36]. 简言之，AFM纳米压痕测量是使用带有锥形尖端（标称k个=0.03 N/m）（Microlever，Veeco，Santa Barbara，CA，USA），使用热噪声法进行校准[36]. 对于每个凝胶位置，三条力-位移曲线(F-z公司曲线）是在中等加载力（~1nN）下获得的；电子每个的F-z公司曲线通过接触弹性模型的最小二乘拟合计算，并在三个模型上取平均值F-z公司曲线[27]. 相同的方案应用于至少9个随机凝胶位置，以得出最终结果电子水凝胶的估计。

4.6. qRT聚合酶链式反应

细胞培养分三次进行qRT-PCR分析，如其他地方报道的那样[40]. 简单来说，使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN）分离每个样品的总RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒和RNase抑制剂（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）将总RNA逆转录到cDNA中。除非另有说明，否则使用TaqMan基因特异性引物对和人类基因编码探针对每个cDNA样本进行20–50 ng的实时PCR反应COL1A1公司（Hs00164004_m1），基质金属蛋白酶1（Hs00233958_m1），基质金属蛋白酶2（Hs01548724_m1）和波兰2A（Hs00172187_m1，用作参考基因）和小鼠基因编码第1a1列（Mm00801666_g1），百万帕（Mm00473485_m1）和波尔2a（Mm00839502_m1，用作参考基因）（应用生物系统）。在7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）中进行40个周期的反应（95°C 21 s，60°C 20 s）。相对基因表达波兰2A（针对人类）或波尔2a（对于小鼠成纤维细胞）评估为k个·2^{−Δ计算机断层扫描}，其中k个是分别用于目标基因和内源基因的阈值数之比，以及ΔC类t是平均值之间的差值C类靶基因和参考（内源性）基因的t[72].

4.7. MMP-2活性测定

如其他地方所述，明胶酶谱图显示了MMP-2的活性[73]. 简单地说，将蛋白酶抑制剂添加到每个细胞培养物中（完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒，瑞士巴塞尔罗氏公司），收集并浓缩相应的条件培养基（超滤Amicon，Milipore，美国马萨诸塞州伯灵顿），并在10%明胶凝胶中进行电泳（Invitrogen，Carlsbad，美国加利福尼亚州）。然后，用复性缓冲液（Invitrogen）复性蛋白质，并在37°C下与显影缓冲液（Initrogen）培养18小时后观察明胶酶活性。作为阴性对照，向显影缓冲液中添加10 nM EDTA。明胶凝胶用考马斯蓝染色。酶活性区域（蛋白水解）在深色背景下呈现为清晰的条带。

4.8. 西方印迹法

如其他地方报告的那样，通过Western blotting对FAK和Akt活动进行评估[35]. 简言之，在补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中裂解成纤维细胞。在10%Mini-PROTEAN TGX预制凝胶（Bio-Rad）上分离等量的蛋白质，转移到PVDF膜（GE Healthcare，Marlborough，MA，USA）上，封闭并与Akt，Akt的主要抗体孵育过夜^第473页（9272和4060；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）和α-微管蛋白（2144，Cell Signoling）或抗β-肌动蛋白（Sigma，Saint Louis，MI，USA。后两种蛋白质被用作负荷控制。蛋白质条带通过化学发光标记和可视化（ImageQuant LAS 4000，GE Healthcare），相应的条带强度通过图像J量化。

我们感谢塞萨尔·皮卡多、诺米·雷瓜特（IDIBAPS-Clininic）、杰马·福斯特（Cellex）、丹尼尔·纳瓦贾斯（Daniel Navajas）和拉蒙·法雷（UB）的支持。这项工作得到了经济竞争力部（MINECO/FEDER，UE）（SAF2009-13243、PI13/02368和SAF2016-79527-R，给Jordi Alcaraz；PI060064给Antoni Xaubet）、加泰罗尼亚政府（Generalitat de Catalunya AGAUR）（661新加坡元，给Joddi Alcaraz）的进一步支持，西班牙巴塞罗那协会理事会（AECC B16-917 to Jordi Alcaraz），以及意大利国家科学部（Ministerio de Ciencia e Innovación）（给Alícia Giménez）和法国基金会（给Marta Puig）的博士前研究金。