基于磷酸化AKT1的诺模图预测食管鳞癌患者局部复发

摘要

介绍

尽管外科技术有所进步，围手术期管理有所改善，但食管鳞癌患者的术后预后仍令人沮丧^1-2术后失败的主要原因是局部复发。即使在采用广泛的三野淋巴结清扫（3FLD）进行根治性食管切除术后，局部复发率也高达40%^三-4一些随机试验评估了更积极的局部治疗、手术结合术后放疗（PORT）加或不加化疗的作用，这是增加局部控制的重要策略之一^5-6.

然而，使用PORT改善局部控制和整体生存（OS）一直存在争议^7-8。这至少部分是由于缺乏有效的标准来预测局部复发和确定哪些患者更有可能从PORT中受益。在当前的临床实践中，我们主要依赖临床病理特征，如病理性肿瘤结节转移（pTNM）分期，将患者分层以改进术后治疗⁹然而，肿瘤生物学可能并不总是反映临床病理特征^10-11显然，确定有效的生物标记物来完善目前预测食管鳞癌患者局部复发的分层模型非常重要。

在之前的研究中，我们研究了表皮生长因子受体（EGFR）信号通路相关蛋白的表达对ESCC患者OS的影响。选择11个生物标记物进行免疫组化分析，包括EGFR、磷酸化（p）-EGFR、AKT1、AKT2、ERK1、ERK2、STAT3、p-AKT1，p-AKT2，p-ERK1/2和p-STAT3。我们发现p-AKT1的表达是OS的一个独立预后因素，p-AKT1的高表达与OS的较差相关¹²。本研究的目的是利用列线图评估p-AKT1表达与其他临床因素结合在预测食管癌根治术后食管鳞癌患者局部复发和指导有针对性的术后放疗策略中的作用。

材料和方法

免疫组织化学（IHC）和表达评估

如前所述构建组织微阵列（TMA）¹²使用标准的Envision方法，用p-AKT1（Ser473）的一级抗体（EP2109Y，稀释度1:100；Abcam）对来自TMA的4μm石蜡包埋切片进行IHC染色（图。​（图11).

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图1

食管鳞状细胞癌（ESCC）中p-AKT1表达的免疫组化分析代表性结果（核染色，放大×400）染色：0，阴性；1+，较弱；2+，中度；3+，积极性强。

组织切片由三名组织病理学家以盲法独立评估。通过协商一致解决了分歧。采用改良的半定量H评分法评估IHC染色¹⁶细胞质或核室染色均为阳性。对于每个组织核心，通过将阳性细胞百分比（0-100%）和染色强度相乘得出分数。IHC反应的染色强度分为：0，阴性；1+，较弱；2+，中度；和3+，很强。因此，总体H评分范围为0-300。

结果

LPFS的预后因素

所有患者的中位随访时间为36.8个月（范围2-127个月）。随时间变化的OS和LPFS速率如图所示。​图2A。2A.1、3、5年OS和LPFS的发生率分别为84%、56.9%、52.2%和82.2%、66.6%、63.9%。

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图2

181例患者整个研究人群的生存率（A）OS和LPFS的Kaplan-Meier曲线分析（B）根据病理N期分层的患者LPFS（C）根据淋巴结回收数分层的患者的LPFS（D）根据p-AKT1 H评分分层的患者LPFS。

p-AKT1表达的中位数H评分为70（范围：0-250），我们将其作为截止点，然后将患者分为低表达组（H评分≤70；n=95）和高表达组（H-评分>70；n=86）进行进一步分析。单变量分析中测试的变量显示，与LPFS相关的显著因素包括病理N类（p＜0.001）、淋巴结回收数（p＝0.003）、病理血管浸润（p＝0.005）和p-AKT1表达（p＜0.001）（表​（表3）。三). 然后在多元Cox比例风险模型中评估在单变量分析中具有统计意义的所有变量，以调整协变量的影响。

表3

食管鳞癌患者LPFS的单因素和多因素分析

特点	单变量分析	第页价值	多元分析	第页价值
	心率（95%置信区间）		心率（95%置信区间）
性别		0.059
男性	1
女性	0.442 (0.19-1.03)	0.059
年龄（岁）		0.777
< 60	1
≥ 60	1.078 (0.643-1.806)	0.777
肿瘤位置		0.412
上部	1
中部	1.926 (0.689-5.387)	0.211
下部	1.582 (0.525-4.768)	0.415
肿瘤长度（cm）		0.859
<5	1
≥ 5	0.954 (0.569-1.699)	0.751
肿瘤分化		0.424
嗯	1
中等	0.950 (0.401-2.248)	0.907
可怜的	1.415 (0.548-3.653)	0.474
病理性血管侵犯		0.005		0.169
否定	1		1
积极的	2.356 (1.289-4.304)		0.144 (0.009-2.277)	0.169
病理T期		0.363
T1类	1
T2段	0.454 (0.135-1.531)	0.203
T3航站楼	0.698 (0.213-2.282)	0.552
T4类	0.501 (0.112-2.240)	0.366
病理N期		<0.001		0.004
编号0	1		1
N1型	1.659 (0.8-3.44)	0.174	1.666 (0.798-3.478)	0.174
氮气	3.803 (1.881-7.687)	<0.001	2.82 (1.367-5.815)	0.005
N3号机组	4.281 (1.970-9.304)	<0.001	3.882 (1.757-8.581)	0.001
取回的淋巴结数量		0.003		0.001
≤20	1		1
<20 ~ ≤30	0.555 (0.297-1.036)	0.064	0.736 (0.385-1.405)	0.352
>30	0.299（0.151-0.594）	0.001	0.301(0.150-0.602)	0.001
辅助治疗		0.687
无	1
化疗	0.898 (0.534-1.512)	0.687
p-AKT1型		<0.001		<0.001
低水位	1		1
高级	4.626（2.599-8.234）	<0.001	4.156 (2.273-7.596)	<0.001

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多变量分析表明，p-AKT1表达（p<0.001）、病理N分类（p=0.004）和淋巴结转移数（p=0.001）是食管鳞癌患者局部复发的独立预后因素（表​（表3）。三). 根据N分期、检索到的淋巴结数量和p-AKT1的表达，使用log-rank检验比较LPFS曲线，如图所示。​图2。2此外，我们根据患者的淋巴结转移情况对患者进行分层，发现在淋巴结阴性患者中，p-AKT1低表达组的LPFS明显优于p-AKT1-高表达组(第页=0.002，图。​图3A）三A） 和淋巴结阳性患者(第页<0.001，图。​图3三B） ●●●●。

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图3

LPFS的对数秩检验，比较p-AKT1 H评分≤70的患者和p-AKT1H评分>70的患者（A）淋巴结阴性患者（n=68；第页=0.002）（B）淋巴结阳性患者（n=113；第页<0.001).

基于具有危险比的选定变量，建立了一个包含所有重要独立因素的诺模图，用于预测局部复发（图。​（图4）。4). 每个变量都会在分数表上打分。通过将底部量表中预测的总分相加，我们可以估计1年、3年和5年LPFS的概率。根据国际验证，LPFS预测的哈雷尔C指数为0.78（95%CI，0.74-0.82）。术后1年、3年或5年LPFS概率的校准图显示，诺模图预测与实际观察之间存在良好的相关性（图。​（图55).

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图4

诺模图根据p-AKT1的表达和临床变量预测LPFS。诺模图用于计算每个独立因子在标尺顶部确定的点的总和。然后在总分量表上识别该总分，以确定LPFS预测的概率。LPFS预测的哈雷尔c指数为0.78。

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图5

用于预测（A）1年时患者LPFS的校准曲线；（B） 3年和（C）5年的实习验证。在x轴上标出无图预期的局部区域无进展生存率；实际存活率绘制在y轴上。

讨论

在这项研究中，我们发现局部复发是治疗失败的主要模式。即使在3FLND扩大根治性食管切除术后，局部复发率也略高于血行转移，这与其他研究相似^三,19我们还证明，临床因素，包括病理学N分类和淋巴结转移数，结合p-AKT1表达，在预测局部复发方面更有价值，这可能会更准确地指导术后治疗；然而，还需要进一步调查。

参与肿瘤发生的PI3K/Akt信号在控制新陈代谢、细胞生长、增殖、存活或迁移以及膜运输或分泌中起着关键作用²⁰PI3K磷酸化膜结合的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）以产生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），从而允许在PDK1和mTORC2存在的情况下，分别在Thr308和Ser473残基处磷酸化（即活化）AKT²¹激活AKT可以诱导procaspase-9的磷酸化，从而抑制其蛋白酶活性。它还磷酸化Bcl-2家族的促凋亡成员Bad和促凋亡转录因子FKHR。因此，p-AKT介导了一系列生存信号，用于调节凋亡、增殖、细胞生长和血管生成^22-23.

越来越多的证据表明，p-AKT1在几种肿瘤中显著过度表达，并且与疾病复发的高风险相关^24-25Kreisberg等人。²⁶发现Ser473残基的AKT1磷酸化是前列腺癌的独立预后因素，p-AKT1蛋白的阳性表达预示着生存率降低。Ayala等人。²⁷据报道，前列腺癌中p-AKT1的高表达预示着较高的复发概率。另外，当分别分析Gleason 6和7例患者时，p-AKT1表达是生化无复发生存率的独立预后指标。

在本研究中，我们发现在食管鳞癌根治术后患者中p-AKT1的高表达与低LPFS之间存在显著相关性。多变量Cox回归分析表明，p-AKT1表达强烈且独立地预测LPFS（危险比=4.335，[95%CI，2.327-8.076]，p<0.001）。此外，p-AKT1的高表达预示着LPFS的降低，与淋巴结状态无关。即使在淋巴结阴性患者中，我们也可以通过检测肿瘤组织中p-AKT1的表达来进一步预测LPFS。p-AKT1的表达水平可能使具有类似临床病理因素的患者的局部复发风险分层。据我们所知，这是第一项基于PI3K/Akt信号通路建立诺模图预测ESCC术后LPFS的研究。在以前的一些文献中，开发了不同的模型来预测食管癌根治术后患者的总体生存率或远处转移^28-29在Hayashi等人的另一项研究中。³⁰为了预测术前放化疗后淋巴结转移，我们开发了一个结合临床参数的诺模图，该诺模图可用于选择手术方式和解释患者手术的必要性。

以前的数据表明，一般来说，切除的淋巴结越多，生存率越高^31-32使用SEER数据库，Schwarz等人。³³检查了5600多名接受食管切除术的患者的淋巴结数据，发现总淋巴结计数越高，OS越好，与淋巴结状态或组织学无关。为了消除之前讨论的基于人群的研究的固有局限性，Altorki等人。³⁴在使用标准化手术技术的单个高容量机构的背景下，在大样本研究中获得的概括结果表明，食管癌的总淋巴结计数与生存率之间存在关联。结果表明，较高的淋巴结计数有利于食管切除术后的生存。即使在淋巴结阴性患者中，当切除40多个淋巴结时，存活率的益处也具有统计学意义。在本研究中，我们还研究了淋巴结取回数对LPFS的影响。根据各种数据，发现最佳淋巴结切除取决于T分类：pT1-2约20个淋巴结，pT3-4约30个淋巴结或更多。因此，我们选择20和30个淋巴结作为我们研究中检索到的淋巴结数量的截止点。通过单变量和多变量Cox回归分析，我们确定检索到的淋巴结数量是LPFS的独立预后因素。如图所示。​图2C，2C、 淋巴结数量越多，LPFS越好。

本文提出了淋巴结总数对生存率影响的几个可能原因。一个原因是，在更广泛的淋巴结解剖的背景下，可能会发生阶段性迁移。此外，取回更多的淋巴结更有可能清除含有微转移疾病的淋巴结部位。此外，取回的淋巴结数量可能反映手术、病理和机构护理的充分性，所有这些都会影响治疗结果^34-36一些研究报告称，淋巴结转移率也是食管癌OS的独立预测因子^37-38在我们的研究中，我们分析了局部控制与淋巴结转移率以外的淋巴结转移数的关系。淋巴结转移率由阳性淋巴结的数量（病理N期）和回收的淋巴结总数（分母）决定。由于分母是可变的，因此淋巴结转移率的预后价值可以被稀释³⁹特别是在淋巴结阴性患者中，淋巴结转移率的预测值可能优于淋巴结转移数。

应该承认我们研究的几个局限性。首先，本研究采用回顾性设计，对有限数量的患者进行分析。其次，诺模图只包含一个生物标记。在未来的研究中，应根据其与食管鳞癌不同肿瘤机制的相关性分析更多的生物标记物。多种生物标记物的存在可能会增强风险分层诺模图的威力。此外，我们没有进行外部验证，因此有理由担心通用性。因此，在临床实践中实施之前，需要复制所提出的诺模图，然后进行前瞻性验证。

总之，p-AKT1的表达、病理N分类和淋巴结转移数是食管癌根治术后LPFS的潜在预后因素。诺模图整合了p-AKT1的表达和临床病理因素，并可能产生新的分层系统。它可用于准确预测食管鳞癌患者的局部复发（C指数=0.78），并帮助临床医生制定更明智的个性化治疗建议。

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