葡萄糖利用率通过上调烟酰胺代谢控制小鼠3T3-L1脂肪细胞的脂肪生成

低血糖降低了总NADH/P水平

我们假设高葡萄糖可能是通过磷酸戊糖途径（PPP）的流量介导的合成代谢所必需的，用于NADPH再生，通过磷酸核糖焦磷酸（PRPP）的生成进行核苷酸生物合成，或两者兼而有之。为了评估PPP的重要性，在分化后第9天采集在Hi、Lo或Pyr培养基中D期处理的细胞，这些细胞不含或含有6-AN，6-AN是PPP的一种有效抑制剂，靶向6-磷酸葡萄糖脱氢酶。D期6-AN治疗完全抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化能力(图4一)表明在D期脂肪细胞分化和成熟需要PPP。

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图4。

低葡萄糖分化细胞NADH/P比率降低。 一诱导3T3-L1脂肪细胞分化，并用高糖、低糖或Pyr刺激，不含或含5 m米6-AN，并在细胞培养的P和M期在低葡萄糖培养基中培养。通过SDS-PAGE分离第9天脂肪细胞全细胞裂解物中的蛋白质，并对GLUT4、脂联素和微管蛋白进行免疫印迹。B–F类诱导3T3-L1脂肪细胞分化，用高糖、低糖或Pyr刺激，并在细胞培养的P期和M期在低糖培养基中培养。收集第9天的脂肪细胞并相应地进行裂解，通过HPLC纯化和随后的荧光分光光度法分析上清液。采用单向方差分析确定显著差异(第页<0.05n个=3个独立实验）。*，与高糖细胞相比的差异；#，与低葡萄糖细胞的差异。

在每种营养条件下，细胞的能量电荷都在正常的预期范围内(图4B类)支持ATP、ADP和AMP水平的变化并没有介导Lo的差异效应与高糖。因为已知6-AN可降低细胞NAD水平(21)，我们接下来测量了总NAD和NADP池。在D期用低葡萄糖处理的细胞，其总NAD和NADP库显著减少，而Pyr的水平与在Hi条件下分化的细胞的水平相当(图4,C类和E类). 尽管总NAD水平存在差异，但NADH/NAD水平没有显著差异⁺比率(图4D类)与能量电荷测量一致。相比之下，NADPH/NADP⁺Lo葡萄糖细胞中的比率降低，表明还原生物化学的能力降低。

烟酰胺促进脂肪细胞分化和脂联素

为了确定D期低葡萄糖导致总NAD/P水平降低的原因，我们评估了NAD/P合成途径的几个方面(图5一). 的表达式蓝蜉蝣mRNA，编码NAD激酶，从NAD产生NADP⁺，不受D期营养状况的影响(图5B类). 相反，在Lo和Pyr营养条件下，NAMPT蛋白的表达显著降低，该蛋白负责在补救途径中从NAM再生NAD(图5C类). 这表明这些细胞通过补救途径产生NAD的能力降低(22). 同样，当在D期结束的第3天进行测量时，在Lo和Pyr条件下，PRPP的总库显著减少(图5D类). 总之，在用Pyr脉冲的成熟脂肪细胞中，NAMPT表达的降低和PRPP水平的降低都不限制NAD/P的合成。

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图5。

NAMPT和PRPP水平的降低不足以损害Pyr细胞中NAD的合成。 一，NAD/P合成代谢途径图。诱导3T3-L1脂肪细胞分化，并用高糖、低葡萄糖或Pyr进行脉冲处理，并在细胞培养的P和M期在低葡萄糖培养基中培养。B类通过qRT-PCR分析第9天脂肪细胞中mRNA的相对表达纳克。C类，通过SDS-PAGE分离第9天脂肪细胞全细胞裂解物中的蛋白质，并进行Western blot以进行NAMPT。D类收集第9天的脂肪细胞并进行相应的裂解，通过ELISA分析上清液中的PRPP水平。95%置信区间用于确定免疫印迹密度测定的统计差异。采用单向方差分析确定显著差异(第页<0.05n个=3个独立实验）。*，与高糖细胞相比的差异；#，与低葡萄糖细胞的差异。

接下来，我们在D期用NAM（NAD合成的生物可利用前体）处理细胞，以促进通过通路的流量并增加NAD总库(图6一). 这成功地提高了分化第3天Lo葡萄糖细胞中NAD的水平。有趣的是，我们发现NAM治疗低血糖细胞部分恢复了GLUT4的表达，更重要的是，完全挽救了脂联素(图6B类). 综上所述，这些数据表明，NAD是脂肪细胞分化和成熟所必需的，这是由脂联素的表达决定的，在分化的第3天，NAD的总水平与高糖条件下的水平相匹配。NAM只能部分恢复葡萄糖转运蛋白4Lo葡萄糖细胞中的mRNA和蛋白质水平与热处理细胞中的水平相匹配，但与Hi葡萄糖细胞不匹配(图6,B类和C类). 最后，NAM治疗足以恢复帕帕γ和aP2型Lo葡萄糖细胞中的mRNA，表明NAM限制脂肪细胞分化的早期标记物(图6,D类和E类).

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图6。

补充NAM可部分挽救GLUT4的表达，并完全支持脂联素的表达。诱导3T3-L1脂肪细胞分化，并用高糖、低糖或Pyr刺激，不含或含15m米NAM，在细胞培养的P和M期在低葡萄糖培养基中培养一收集第3天的脂肪细胞并进行相应的裂解，通过ELISA分析上清液中的总NAD水平。B类通过SDS-PAGE分离第9天脂肪细胞全细胞裂解物中的蛋白质，并对GLUT4、脂联素和微管蛋白进行免疫印迹。C–E类通过qRT-PCR分析第9天脂肪细胞中mRNA的相对表达葡萄糖转运蛋白4,pparg（磅/加仑）、和应用程序295%置信区间用于确定免疫印迹密度测定的统计学差异。采用单向方差分析确定表达和ELISA数据的显著差异，与高糖细胞相比的差异；#，与低葡萄糖细胞相比的差异，NAM处理和未处理对照的差异。

GLUT4启动子中LXRE的缺失阻断了葡萄糖效应

D期的NAM或丙酮酸脉冲只能部分恢复GLUT4 mRNA和蛋白的表达，表明导致谷氨酸表达的另一种葡萄糖依赖性途径。为了确定葡萄糖转运蛋白4mRNA是由于转录机制，我们进行了体外glut4在D期生长于低葡萄糖中并用高糖或Pyr脉冲的第6天脂肪细胞中的启动子/荧光素酶报告子（-895-hGLUT4-Luc）转录检测。正如所料，荧光素酶活性在高糖脉冲细胞中最高，在吡咯脉冲细胞中居中(图7). 我们实验室以前的研究表明，代谢信号调节葡萄糖转运蛋白43T3-L1脂肪细胞中通过LXRE元件的启动子活性谷氨酸4基因启动子(23). 测试葡萄糖转运蛋白4LXRE，我们测试了在LXRE（ΔLXRE-Luc）中携带功能丧失突变的-895-hGLUT4-Luc突变版本。突变的ΔLXRE-Luc探针的葡萄糖依赖性活性消失，突变探针的表达仍处于激活的基础水平。这些数据表明，高糖通过LXRE激活glut4转录。

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图7。

的LXRE区域葡萄糖转运蛋白4启动子是葡萄糖依赖性分化所必需的。所示为的示意图荧光素酶报告基因在两种不同的调控下葡萄糖转运蛋白4启动子，仅因其包含LXRE区域而不同。诱导3T3-L1脂肪细胞分化，并用高糖、低糖或Pyr进行脉冲处理，并在细胞培养的P期和M期在低糖培养基中培养。收集第6天的脂肪细胞并相应地进行裂解，分析上清液荧光素酶表达式。95%置信区间用于确定统计差异(第页<0.05n个=3个独立实验。*，与高糖细胞相比的差异；#，与相同的低葡萄糖细胞相比的差异葡萄糖转运蛋白4启动子区。

全细胞裂解物和免疫印迹

在含有20 m的裂解缓冲液中制备全细胞提取物米HEPES，1%Nonidet P-40，2米米EDTA，10米米氟化钠，10 m米焦磷酸钠，1 m米原钒酸钠，1米米钼酸盐蛋白酶抑制剂混合物（完整的Mini-EDTA无蛋白酶抑制剂混合物，罗氏），1 m米PMSF和50 m米数字电视。使用考马斯Plus（Bradford）检测试剂盒（Pierce）测定蛋白质浓度。使用SDS-PAGE对裂解液进行分离，并将蛋白质转移到Immobilon-FL聚偏氟乙烯膜（EMD Millipore Corp.，Billerica，MA）。膜用抗GLUT4抗体（sc-1608，Santa Cruz Biotechnology）、抗脂联素抗体（Philipp Scherer赠送）、抗NAMPT抗体（A300–372A，Bethyl）、，抗SDH抗体（线粒体生物生成混合物，ab123545，Abcam）、抗过氧化物酶体过氧化氢酶抗体（ab15834，Abcam）、抗肌动蛋白抗体（线粒体生物合成混合物，ab123 545，Abcam）或抗α/β-微管蛋白抗体（2148，细胞信号技术）并用与Alexa Fluor 680（Invitrogen）偶联的适当二级抗体进行可视化。荧光用Li-Cor Odyssey成像仪（Li-Cor Biosciences）定量。蛋白表达数据被归一化为微管蛋白作为负荷控制。

RNA分离和qRT-PCR

使用异硫氰酸胍提取mRNA，并使用前面描述的CsCl梯度通过密度平衡离心纯化(40). 样品以乙醇沉淀的形式储存在−20°C下，直至进一步分析。RNA在260、280和320 nm处通过紫外吸收定量。通过定量实时PCR（qRT-PCR）定量GLUT4、aP2、PPARγ、SREBP-1c和FAS的信使RNA水平。引物序列如下：mGLUT4，5′-AAAAAGTGCCTGAAACCAGAG-3′（正向），5′-TCACCTCTCTCTAAAAGG-3′（反向）；maP2 5′-GCGGTGGAATTCCGATAAATCA-3′（正向），5′-CCCGCACATCTAGGTTATGA-3’（反向）；mPPARγ5′-GTGCCAGTTTCGATCCGTAGA-3′（正向），5′-GGCCAGCATC GTGTAGATA-3′（反向）；mSREBP-1c，5′-GTGGCCTGACAAGCAGCAATCA-3′（正向），5′-GGTGCTACAGCAAGAG-3′（反向）；mFAS，5′-GCTCGGAAACTTCAGGAAAT-3′（正向），5′-AGAGACGTCACTCCCTGGACTT-3′。使用对照3T3-L1脂肪细胞绘制的标准曲线计算相对mRNA水平。所有qRT-PCR均使用由C1000 Touch组成的模块化热循环平台完成^TM（TM）热循环底盘（Bio-Read）和CFX96^TM（TM）光学反应模块（Bio-Rad）。使用CFX管理器读取qRT-PCR的数据^TM（TM）软件（Bio-Read）。

NAD/P和PRPP测量

NAD总库使用比色定量试剂盒（ab65348，Abcam）进行估算，PRPP总库使用固相竞争ELISA（173862，USBiological）进行估算。如前所述，NAD+/NADH和NADP+/NADPH的比率通过HPLC纯化和随后的荧光分光光度法测定(41). 简单地说，使用HPLC（岛津LC-20A高精度二元梯度HPLC系统）和荧光或可见光二极管阵列光谱法来解析和检测NADH、NADPH、NAD⁺和NADP⁺流动相包括100 m米千赫₂人事军官₄和1.0米米pH 6.0（缓冲液A）和CH条件下的四丁基硫酸铵_三CN（缓冲液B），流速为1.0 ml/min，在Eclipse Plus C18柱上，带有直径为5μm、长度为4.6×150 mm的珠（安捷伦）。使用缓冲液A/B的下列梯度逐步分解NADH和NADPH（100-μl注射液）：100%/0%，2.5分钟；95%/5%，5分钟；85%/15%，7.5分钟；100%/0%，10分钟。NAD⁺和NADP⁺使用缓冲液A/B的以下逐步梯度进行解析（100μl注射）：100%/0%持续5分钟，85%/15%持续5分钟，100/0%持续10分钟。NADH和NADPH的浓度通过荧光（激发，340nm；发射，460nm）和NAD检测⁺和NADP⁺在254nm处进行吸收，并根据标准的积分面积进行量化。

葡萄糖测定

如前所述，使用蒽酮试剂测量葡萄糖浓度(42). 用添加10%FBS的无葡萄糖培养基代替水生成葡萄糖标准曲线。

荧光素酶报告分析

如前所述，分化3T3-L1脂肪细胞并电穿孔(38). 荧光素酶结构体-895-hGLUT4-Luc和ΔLXRE-Luc已在前面描述过，并在需要的地方使用(28,38)转染24小时后，使用双球荧光素酶试剂盒（Promega）进行荧光素素酶分析。

油红O染色

在室温下用10%福尔马林固定30分钟之前，在PBS中清洗两次的细胞进行油红O染色。固定后，用PBS冲洗细胞两次，然后在室温下在60%异丙醇中培养5分钟。然后在室温下用过滤过的0.3%油红O溶液在60%异丙醇中染色5分钟。去除油红O溶液，用水冲洗细胞五次，直到冲洗水变清。用2 ml 99%异丙醇洗脱油红O染色，并记录500 nm处的吸光度。用水冲洗细胞两次，并在室温下用5 mg/ml结晶紫水溶液复染30 min。去除结晶紫染色，用水冲洗细胞五次，直到冲洗水变清。用2 ml甲醇洗脱染色剂。记录540 nm处的吸光度。