国际癌症研究分子力学杂志。作者手稿；2017年10月4日在PMC上提供。
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造血干细胞衍生脂肪细胞促进肿瘤生长和癌细胞迁移
,1,2,3 ,1,2 ,1,2 ,1,4和1,2,三，*
Y Xiong（Y熊）
1美国南卡罗来纳州查尔斯顿拉尔夫·H·约翰逊退伍军人事务医疗中心研究服务
2美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学病理学和实验医学系
3美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心
DL罗素
1美国南卡罗来纳州查尔斯顿Ralph H Johnson退伍军人事务医疗中心研究服务
2美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学病理学和实验医学系
LT麦当劳
1美国南卡罗来纳州查尔斯顿Ralph H Johnson退伍军人事务医疗中心研究服务
2美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学病理学和实验医学系
洛杉矶考沃特
1美国南卡罗来纳州查尔斯顿Ralph H Johnson退伍军人事务医疗中心研究服务
4美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学生物化学和分子生物学系
AC拉鲁
1美国南卡罗来纳州查尔斯顿Ralph H Johnson退伍军人事务医疗中心研究服务
2美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学病理学和实验医学系
3美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心
1美国南卡罗来纳州查尔斯顿Ralph H Johnson退伍军人事务医疗中心研究服务
2美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学病理学和实验医学系
3美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心
4美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学生物化学和分子生物学系
*通讯作者：美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心LaRue AC，电话：+1-843-789-6707；传真：+1-843-876-5381；ude.csum@creural 这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
- 补充资料
GUID:D64D9051-34D3-4849-8468-5DCFE0B3C915
摘要
脂肪细胞除了作为能量储存库的关键作用外，还有助于肿瘤微环境的组成。我们之前基于单一造血干细胞（HSC）移植模型的研究揭示了HSC脂肪细胞的新来源通过单核细胞/巨噬细胞祖细胞。在此，我们将这些研究扩展到检测HSC-衍生脂肪细胞（HSC-Ad）在肿瘤进展中的作用。在成脂条件下培养时，骨髓源性单核细胞祖细胞分化为脂肪细胞，脂肪细胞积聚含有甘油三酯的油滴。脂肪因子阵列和ELISA证实HSC-Ad分泌多种脂肪因子。这些脂肪细胞进一步发育体内皮下注射到C57Bl/6小鼠。当与黑色素瘤B16F1细胞或乳腺癌E0771细胞共同注射到同基因C57Bl/6小鼠中时，HSC-Ad不仅加速了黑色素瘤和乳腺肿瘤的生长，而且增强了两种肿瘤的血管形成。HSC-Ad条件培养基支持B16F1和E0771细胞增殖并增强细胞迁移在体外在HSC-Ad分泌的脂肪因子中，胰岛素样生长因子1（IGF-1）在E0771细胞增殖中起重要作用。肝细胞生长因子（HGF）对B16F1细胞迁移是不可或缺的，而HGF和血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）共同促进了E0771细胞迁移。IGF-1、HGF和PDGF-BB受体的表达水平与其在B16F1和E0771细胞增殖和迁移中的不同作用相关。我们的数据表明HSC-Ad通过不同的机制调节肿瘤行为。
关键词：造血干细胞、脂肪细胞、黑色素瘤、乳腺癌、肿瘤微环境
介绍
只有当复杂的组织环境为肿瘤细胞提供了一个允许和支持的环境时，肿瘤细胞才能够生长。因此，肿瘤的增殖、侵袭性、血管生成和转移潜能都依赖于肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞之间复杂的双向串扰。构成肿瘤基质的细胞包括成纤维细胞和脂肪细胞、招募的免疫细胞以及新生血管中的内皮细胞[1]. 脂肪细胞存在于多种组织中，其中一些组织具有富含脂肪细胞的环境，如乳腺和骨髓。迄今为止，大多数聚焦于癌细胞与癌细胞之间通讯的研究都强调了成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞的作用，而脂肪细胞在肿瘤进展中的作用需要更深入的研究。
新的证据表明，脂肪细胞除了作为最大能量储存库的关键作用外，还是内分泌细胞，产生激素、生长因子、趋化因子和脂肪因子，影响各种癌症的肿瘤生长、转移和化疗抵抗[2]. 例如，脂肪细胞对乳腺癌生长和转移的作用已被广泛研究[3–5]. 最近，脂肪细胞被证明以游离脂肪酸的形式向邻近的癌细胞提供脂质，以供其产生能量[6,7]. 脂肪细胞在与癌细胞相互作用过程中，会发生表型变化（如脱脂、脱分化）和功能改变（如白细胞介素-6的生成增加），因此被称为癌相关脂肪细胞[8,9]. 已有研究表明，癌相关脂肪细胞可能提供高水平的促炎细胞因子[4]，蛋白酶[10,11]和细胞外基质成分[12,13]从而加速肿瘤的进展。
从前体细胞生成新的脂肪细胞，对于理解正常或病理条件下脂肪组织的发育和周转，如肥胖和癌症，具有极大的兴趣。脂肪细胞通常被认为来源于常驻脂肪组织前脂肪细胞和间充质干细胞（MSCs）[14,15]. 包括我们实验室在内的几个小组已经发现了一种来源于骨髓源循环祖细胞的新型脂肪细胞群[16–18]. 骨髓为MSC和造血干细胞（HSC）提供了丰富的来源。在我们的实验室中，移植来源于单个EGFP阳性HSC的克隆细胞群表明，脂肪细胞来源于HSC，分化为通过单核细胞/巨噬细胞祖细胞[18]. 这得到了Klemm小组的工作支持，他们使用了一个非转基因小鼠模型，其中LacZ的表达仅限于髓系，证实了从头开始从骨髓造血/髓系祖细胞中产生脂肪细胞亚群[19].
为了更好地了解HSC-衍生脂肪细胞（HSC-Ad）对肿瘤进展的贡献，我们丰富了骨髓源性单核细胞祖细胞并将其分化为脂肪细胞。我们进一步分析了它们对肿瘤行为的影响，特别是对肿瘤生长和癌细胞运动的影响。在本研究中，我们证明HSC-Ad分泌生长因子和脂肪因子，它们对黑色素瘤、乳腺癌生长和癌细胞迁移有不同的调节作用。我们已经表明，这些影响取决于肿瘤模型中不同信号通路的参与。
材料和方法
老鼠
C57Bl/6-CD45.1育种家购自Jackson Laboratories（ME巴尔港）。转基因EGFP育种对（C57Bl/6-CD45.2背景）由Masaru Okabe博士提供[20]（日本大阪大学）。小鼠在退伍军人事务医疗中心（南卡罗来纳州查尔斯顿）的动物研究设施饲养。研究是根据公共卫生服务局《人类护理和实验动物使用政策》以及退伍军人事务部医疗中心机构动物护理和使用委员会制定的指南进行的。
细胞系
鼠黑色素瘤细胞系B16F1购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，Manassas，VA），鼠乳腺癌细胞系E0771购自Dennis Watson博士（MUSC，Charleston，SC）。在本研究中，两种细胞系均在37°C、5%CO的增湿环境中保持低传代（<10）2B16F1细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养。E0771细胞在含有20%FBS的DMEM中培养。
试剂
细胞培养基购自Life Technologies（纽约州格兰德岛）。FBS来自亚特兰大生物制品公司（佐治亚州Flowery Branch）。重组蛋白和中和抗体购自研发系统（明尼苏达州明尼阿波利斯）。藻红蛋白（PE）缀合的抗F4/80（T45-2342）和别藻蓝蛋白（APC）缀合的抗CD11b（M1/70）抗体来自BD Biosciences（San Jose，California）。PE结合抗c-Met（eBioclone 7）抗体来自eBioscience（加利福尼亚州圣地亚哥）。CD31抗体来自Abcam（马萨诸塞州剑桥）。western blot中使用的抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州丹弗斯）。抑制剂购自Selleckchem（德克萨斯州休斯顿）。
单核细胞前体的脂肪生成在体外
原始单核前体细胞按照斯坦利及其同事的描述被生成和扩增[21]. 简言之，提取小鼠骨髓细胞，并在含有20%FBS、15 ng/mL白细胞介素-3（IL-3）和0.6 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的最低必需培养基α（αMEM）中培养3天。用0.02%Pronase（EMD Millipore）处理非粘附细胞，然后在含有20%FBS和10 ng/mL M-CSF的αMEM中培养2天。将产生的粘附细胞补充100 ng/mL的M-CSF 3天，以分化为巨噬细胞，或经受下文所述的成脂条件。
为了将贴壁细胞分化为脂肪细胞，将完整的生长培养基替换为脂肪生成起始培养基，该起始培养基由αMEM、10%FBS、10%小鼠血清（MS）、100 ng/mL M-CSF、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤、1μM地塞米松和10μg/mL胰岛素组成。培养2天后，用含有αMEM、10%FBS、10%MS、100 ng/mL M-CSF和10μg/mL胰岛素的脂肪生成进展培养基替换培养基。两天后，用含有αMEM、10%FBS、10%MS和100 ng/mL M-CSF的脂肪生成维持培养基替换培养基，并持续培养至少5天。对于脂肪细胞条件培养基（Ad-CM），用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞两次，然后添加αMEM。24小时后，收集培养基，以2000 rpm离心5分钟，然后使用上清液量化分泌的脂肪因子，并确定对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。
提取成熟脂肪细胞
皮下脂肪组织被切除并切碎在含有1 mg/mL I型胶原酶（Sigma，St.Louis，Missouri）和0.1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM/F12培养基中，并在37°C下以100 rpm的转速在旋转振动筛上培养1 h。未消化的组织通过150μm网眼过滤器过滤后移除，然后通过200g离心5min将成熟脂肪细胞从基质血管细胞中分离出来。收集成熟脂肪细胞（顶层）并进行天花板培养[22].
脂肪含量和脂肪因子分泌的测定
使用5%NP-40从细胞中提取甘油三酯，并根据制造商的方案使用甘油三酸酯测定试剂盒（Abcam）进行定量。使用单个Quantikine ELISA试剂盒（研发系统）对Ad-CM中分泌的脂肪因子进行定量。使用运行Soft Max Pro软件的SPECTRAmax M2微孔板阅读器（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）对数据进行分析。
小鼠原位肿瘤实验
B16F1（2×105)用无血清培养基洗涤细胞，并用或不用HSC-Ad（8×105)在200μL Matrigel（科宁，特克斯伯里，马萨诸塞州）中注射，并皮下注射到C57Bl/6-CD45.1小鼠中。E0771（2×105)用无血清培养基洗涤细胞，并用或不用HSC-Ad（8×105)在50μL Matrigel中注入4第个C57Bl/6-CD45.1雌性小鼠的乳腺。在肿瘤生长过程中测量肿瘤面积（长×宽），并在小鼠被安乐死时测量肿瘤体积（0.5×长×宽×高）。在原位模型中，检查不同的肿瘤与基质比率：1:1与1:4。我们观察到B16F1/E0771:HSC-Ad比率1:1在检查的时间段内对加速肿瘤生长没有显著影响，因此肿瘤与基质比率1:4用于体内实验。
免疫组织化学和血管定量
肿瘤切片（5μM）在二甲苯中脱蜡，并根据标准程序在酒精中脱水。用兔IgG试剂盒（载体实验室）对切片进行CD31抗体染色，并用苏木精进行复染。每组三个肿瘤的切片在Nikon Eclipse 90i显微镜上成像。血管的数量和管腔面积被量化，并从每节3-4个高功率场（HPF，200X）中取平均值。
细胞增殖和迁移分析
为了进行细胞增殖试验，将肿瘤细胞以3×10的密度接种三份3根据制造商的协议，使用CyQUANT NF细胞增殖检测试剂盒（生命科技公司）在3天内对96 well板中每孔的细胞进行定量。使用8.0μm孔径的Costar Transwell嵌件（Corning）进行迁移分析，该嵌件涂有人纤维连接蛋白。B16F1（3×104)或E0771（5×104)将细胞重新悬浮在100μL无血清培养基中，并接种在涂有纤维连接蛋白的插入膜上。实验介质放置在插入物下方的孔中。在5%CO中孵育4小时后2在37°C下，用棉签去除未迁移的细胞，将迁移到膜另一侧的细胞固定并用Diff-Quick试剂盒染色（Siemens Healthcare Diagnostics，Malvern，PA）。计算每个插入物的10个HPF的细胞数并取其平均值。
荧光辅助细胞筛选分析
用APC结合抗CD11b和PE结合抗F4/80抗体对骨髓源单核细胞进行染色。用PE结合的抗c-Met抗体对肿瘤细胞进行染色。使用FACSCalibur（Becton Dickinson）分析碘化丙锭（PI）阴性活细胞。
蛋白质印迹
在含有50 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、1%NP-40和5 mM EDTA的裂解缓冲液中收集细胞。在4°C的裂解缓冲液中孵育30分钟后，通过4°C下13000 rpm离心10分钟来清除裂解产物。收集上清液，并使用BCA蛋白质分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定蛋白质浓度。加载总蛋白（40μg）并在SDS-PAGE凝胶上运行，转移到PVDF膜上，在5%牛奶中封闭，并在与ECL（Bio-Rad）孵育和膜暴露之前用适当的抗体和HRP-结合的二级抗体进行印迹。
统计分析
使用Excel进行统计分析。对于在体外在适当的情况下，所有数据均以平均值±S.D.表示。使用双尾Student’st吨测试。的值*p≤0.05，**第页<0.01，以及***第页<0.001被视为显著，而“n.s.”表示不显著。
结果
单核细胞前体产生脂肪细胞
使用移植[18]和非移植[19]小鼠模型，我们和其他人已经证明造血干细胞（HSC）能够分化为脂肪细胞通过单核细胞/巨噬细胞的祖细胞。为了进一步扩大这一初步观察，根据Stanley等人的研究，从骨髓中生成并扩增原始单核祖细胞[21]并在材料和方法中进行了描述(). 作为概念证明，在10 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）中培养2天后，非粘附细胞变得粘附，CD11b高的80层/四层-/暗淡(-中间面板）。在100 ng/mL的M-CSF中再培养3天，贴壁细胞表现出高水平的F4/80表达(-右侧面板）以及细长的形状(-顶面板），两者都表明细胞分化为成熟的骨髓源性巨噬细胞（BM-MΦ）。然而，当受到脂肪生成条件的影响时，这些HSC衍生细胞油红O（ORO）染色阳性(-底部面板）和积聚的含有甘油三酯的多个脂滴(). BM-MΦ细胞ORO-阴性(-顶部面板），不储存任何甘油三酯(). HSC-衍生脂肪细胞（HSC-Ad）也分泌脂肪因子，包括脂联素、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和血管内皮生长因子（VEGF）(,补充图S1). 虽然肝细胞生长因子（HGF）几乎无法被脂肪因子阵列检测到()但其存在已通过HGF-ELISA确认(补充图S1). 这些结果表明单核祖细胞能够分化为脂肪细胞在体外.
单核细胞前体在体外和体内产生脂肪细胞-（A）在白细胞介素-3（IL-3）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的存在下，从骨髓中富集单核细胞的前体。CD11b和F4/80染色的FACS分析显示巨噬细胞与单核细胞前体细胞的分化。（B） 骨髓源性巨噬细胞（BM-MΦ）和通过单核细胞前体细胞（HSC-Ad）从造血干细胞（HSC）分化的脂肪细胞用油红O（ORO）染色，并用相位对比成像进行可视化。（C） 从BM-MΦ和HSC-Ad中提取甘油三酯，并进行定量。NA，未检测到。（D） 将BM-MΦ或HSC-Ad饥饿过夜，所得培养基用作条件培养基，表示为MΦ-CM或Ad-CM。MΦ-CM和Ad-CM接受脂肪因子阵列（R&D系统），并比较分泌脂肪因子的分布。（E） EGFP公司+HSC-Ad包埋于Matrigel中，皮下注射至C57Bl/6小鼠。3周后，提取、培养成熟脂肪细胞并成像。箭头表示成熟的EGFP+来源于HSC的脂肪细胞。比例尺=25μm。
为了确定HSC-Ad是否可以进一步成熟并在细胞质中形成一个大的中央脂肪滴，从EGFP小鼠的骨髓中生成单核祖细胞并分化为脂肪细胞在体外将这些EGFP阳性脂肪细胞包埋在Matrigel中，并将混合物皮下注射到C57Bl/6小鼠体内。在植入后3周，从植入部位的脂肪组织中提取成熟的脂肪细胞，并进行天花板培养[22]. 2天后，分离的脂肪细胞松散地粘附在天花板表面，然后对培养物进行成像。几种具有单室形态的成熟脂肪细胞(-上部面板）EGFP荧光阳性(-这表明，在良好的微环境下，HSC-Ad可以充分发育并整合到脂肪组织中。
HSC脂肪细胞促进黑色素瘤和乳腺肿瘤生长
HSC-Ad对肿瘤生长的影响体内接下来进行了检查。本研究使用了两种类型的小鼠肿瘤细胞系，即黑色素瘤细胞系B16F1和乳腺癌细胞系E0771。将肿瘤细胞（皮下注射B16F1；乳腺脂肪垫-E0771）单独或与HSC-Ad以1:4的比例原位注射到同基因C57Bl/6小鼠中。B16F1的肿瘤可以进展到第14天，E0771的肿瘤可以发展到第32天，这是因为IACUC批准的人道终点，肿瘤直径不能超过2厘米。
在黑色素瘤模型中，每天测量肿瘤大小，并在第14天对小鼠实施安乐死。单独注射时，B16F1肿瘤在第10天可测量(). 通过HSC-Ad联合注射，在第8天可以测量B16F1肿瘤(). 此外，联合注射HSC-Ad导致显著增大（2.7倍，p<0.01）()和更重（2.7倍，p<0.01）()终点处的黑色素瘤。HSC-Ad不仅促进了B16F1肿瘤的发生，而且还加速了肿瘤的生长速度，因为B16F1的肿瘤生长速度从43.85±13.17 mm显著提高（p<0.01）2/单独注射时为69.53±8.44 mm2/与HSC-Ad联合注射的第天()。
关于乳腺肿瘤的生长，每周测量两次肿瘤大小，并在第32天根据批准的人道终点对小鼠实施安乐死。E0771单独注射在第10天形成可测量的肿瘤，E0771-HSC-Ad联合注射也一样(). 与B16F1肿瘤不同，联合注射HSC-Ad不会影响E0771肿瘤的发生，但有加速E0771瘤生长的趋势，导致肿瘤显著增大（1.9倍，p<0.05）()和更重（1.8倍，p<0.05）()终点处的乳腺肿瘤。单独注射HSC-Ad在两种模型中均未产生肿瘤()。
HSC脂肪细胞增强肿瘤血管生成体内
一个重要的促肿瘤过程是血管生成，它可以增强肿瘤的氧气和营养供应。我们观察到HSC-Ad分泌促血管生成因子VEGF()这使我们研究了HSC-Ad对黑色素瘤和乳腺肿瘤血管化的影响。肿瘤石蜡切片（5μm）用内皮细胞标记物CD31抗体染色(). 测量血管数和管腔面积。定量分析表明，在两种肿瘤模型中，无论是否联合注射HSC-Ad，血管数量都保持不变(). 然而，与单独注射肿瘤细胞相比，联合注射HSC-Ad导致血管形成，管腔面积显著增大（黑色素瘤增加约5倍，p<0.001；乳腺肿瘤增加约4.4倍，p<0.001）()在两种肿瘤模型中。HSC-Ad似乎对黑色素瘤中血管体积的增大有更大的影响，这与B16F1肿瘤的生长对HSC-Ad-联合注射的反应比E0771肿瘤的生长更灵敏一致。这些结果表明，HSC-Ad促进肿瘤生长，至少部分是通过增加肿瘤血管管腔面积来实现的。
HSC衍生脂肪细胞增强B16F1和E0771肿瘤血管化体内-将肿瘤细胞单独或与HSC-Ad联合原位注射到C57Bl/6小鼠体内。（A）肿瘤切片（5μm）用CD31抗体染色以显示血管，并用苏木精进行复染。（B） 血管数量（#）的量化。（C） 测量血管内腔面积，并将其表示为联合注射的折叠变化与仅注射肿瘤细胞。每组（n=3）的3个肿瘤的每个切片的3-4个高功率场（HPF，200X）的平均数据。***p<0.001。不另作说明，不重要。
HSC-脂肪细胞通过激活ERK和AKT通路支持癌细胞增殖在体外
除了HSC-Ad对肿瘤生长的促血管生成功能外体内，我们接下来检查了它们对肿瘤细胞增殖的影响在体外将HSC-Ad饥饿过夜，并将所得培养基用作条件培养基（Ad-CM）。B16F1或E0771细胞在Ad-CM中培养3天，每天定量细胞数量。两个B16F1()和E0771()与无血清αMEM中的细胞相比，Ad-CM使细胞数量增加。值得注意的是，在Ad-CM的存在下，B16F1细胞的增殖率高于E0771细胞（倍增时间为30.24±3.96 h与41.75±1.71小时，p＜0.05）。这与我们的研究结果相一致，即联合注射HSC-Ad对加速B16F1肿瘤生长比促进E0771肿瘤生长更有效。
为了确定哪些下游信号调节Ad-CM支持的肿瘤细胞增殖，我们选择检查ERK和AKT通路，因为它们是细胞生存和增殖以及黑色素瘤和乳腺癌进展的众所周知的调节器[23–25]. 我们观察到，向B16F1和E0771细胞中添加Ad-CM会导致ERK磷酸化，而MEK/ERK抑制剂UO126会完全消除这种磷酸化(-上部面板）。同样，Ad-CM也诱导AKT的磷酸化，而AKT抑制剂MK2206可以消除这种磷酸化(-下部面板）。当肿瘤细胞在UO126或MK2206存在的Ad-CM中培养时，在两种肿瘤模型中，Ad-CM支持的细胞增殖在第3天以剂量依赖性的方式受到抑制(). 这些发现表明，ERK和AKT通路的激活参与了B16F1和E0771细胞对Ad-CM刺激的增殖反应。
HSC-Ad分泌多种细胞因子(,补充图S1). 为了确定哪些因子介导B16F1和/或E0771细胞增殖，我们评估了Ad-CM中存在的几种细胞因子，包括HGF、IGF-1和VEGF。HGF或VEGF的重组蛋白都不能促进肿瘤细胞增殖，它们的中和抗体也不能抑制Ad-CM促进的肿瘤细胞增殖(补充图S2). 然而，与单独使用αMEM相比，100 ng/mL的重组IGF-1（rIGF-1）刺激E0771细胞增殖（p<0.05）(). 添加IGF-1中和抗体（1μg/mL）可在第3天将Ad-CM诱导的E0771细胞增殖抑制约50%（p<0.05）(). 相反，rIGF-1不刺激B16F1细胞增殖()IGF-1中和抗体也不抑制Ad-CM诱导的B16F1细胞增殖(). IGF-1与调节IGF-1作用的IGF-1受体（IGF-1R）具有高亲和力。蛋白质印迹证实E0771细胞表达的IGF-1Rβ水平显著高于B16F1细胞(). 因此，选择性IGF-1R抑制剂OSI-906（利尼替尼）以剂量依赖性方式抑制Ad-CM诱导的E0771细胞增殖（IC50~30nM），但对B16F1细胞增殖影响最小(). 这些结果表明IGF-1/IGF-1R信号轴对Ad-CM诱导的E0771细胞增殖很重要。不幸的是，HSC-Ad分泌的一种对B16F1增殖产生深刻刺激作用的单一因子在本文的研究中未被确定。
胰岛素样生长因子1（IGF-1）/IGF-1受体（IGF-1R）信号轴负责HSC-Ad刺激的E0771细胞增殖体外-（A） 肿瘤细胞在无血清MEM或添加100 ng/mL重组胰岛素生长因子-1（rIGF-1）的αMEM中培养3天。在第3天对细胞数量进行量化，并从多个实验中求出平均值。数据以αMEM的百分比表示。（B） 肿瘤细胞在Ad-CM或Ad-CM中培养3天，Ad-CM补充1μg/mL IGF-1中和抗体。在第3天对细胞数量进行量化，并从多个实验中求出平均值。数据以Ad-CM的百分比表示。通过western blot比较B16F1和E0771细胞中的（C）IGF-1R水平，β-actin作为负荷对照。（D） B16F1型(
)和E0771(
)细胞在添加不同浓度IGF-1R抑制剂OSI-906的Ad-CM或Ad-CM中培养3天。在第3天对细胞数量进行量化，并从三个独立实验中取平均值。数据以Ad-CM的百分比表示。*p<0.05。不另作说明，不重要。
HSC-脂肪细胞分泌HGF加速癌细胞迁移
除肿瘤生长外，肿瘤细胞迁移也是肿瘤转移和进展的一个重要方面，因此还研究了HSC衍生脂肪细胞对肿瘤细胞运动的影响在体外。如所示，Ad-CM促进B16F1细胞迁移()和E0771电池()高于对照组αMEM单独用药（分别为p<0.001）。检测HSC-Ad分泌的许多因子对B16F1和E0771细胞迁移的调节能力。我们观察到重组HGF（rHGF）与单独的αMEM相比，有效地促进了B16F1和E0771细胞的迁移（p<0.001）()并且HGF存在于Ad-CM中(). 用抗HGF抗体耗尽Ad-CM中的HGF可阻断Ad-CM诱导的B16F1细胞迁移()并显著抑制Ad-CM诱导的E0771细胞迁移（p<0.01）()然而，与单独使用αMEM相比，这种抑制是部分的（p<0.05）(). ELISA证实Ad-CM分泌的HGF完全耗尽()。
肝细胞生长因子（HGF）/c-Met对B16F1和E0771细胞迁移很重要-（A） 将未经处理或用1μM c-Met抑制剂PHA-665752处理过的B16F1细胞和（B）E0771细胞暴露在指定的培养基中4 h。对迁移的细胞进行计数，并从多个实验的10个HPF中平均细胞数。Ad-CM/del HGF，来自Ad-CM的HGF免疫完成。（C）将肿瘤细胞暴露于100 ng/mL重组HGF（rHGF）中4 h。对迁移的细胞进行计数，并从多次实验中求出平均值。（D） 使用HGF ELISA试剂盒（R&D Systems）对所示培养基中HGF的浓度进行量化，并从多次实验中求出平均值。NA，未检测到。（E） 通过FACS分析比较肿瘤细胞表面c-Met水平（实线），以同型IgG（虚线）为对照。（F） 将未处理或用1μM PHA-665752处理的E0771细胞暴露于100 ng/mL rHGF 4小时。对迁移的细胞进行计数，并从多个实验中取平均值。*p≤0.05，**p<0.01，***p<0.001。不另作说明，不重要。
受体酪氨酸激酶（RTK）c-Met是HGF的表面受体，介导HGF作用。使用流式细胞术，我们发现B16F1和E0771细胞在细胞表面均表达c-Met，其中B16F1细胞表达的c-Met明显多于E0771(). 当用c-Met选择性抑制剂PHA-665752（1μM）处理B16F1和E0771细胞时，Ad-CM诱导的B16F1细胞迁移被完全消除()而E0771细胞迁移仅受到部分抑制，与单独使用Ad-CM相比（p<0.05）(). PHA-665752处理后E0771细胞向rHGF迁移被阻断()证实HGF/c-Met通路完全阻断，并提示Ad-CM含有HGF以外的因子，这些因子有助于E0771迁移。然而，这些结果揭示了HGF/c-Met信号轴在HSC-Ad指导的B16F1和E0771细胞运动中的关键作用。
HSC-脂肪细胞分泌血小板衍生生长因子（PDGF）介导乳腺癌细胞迁移
为了揭示介导E0771细胞迁移的其他因子，用Ad-CM刺激E0771电池，裂解产物受到磷酸化RTK阵列（R&D系统）的影响，这表明PDGFα和β-酪氨酸激酶受体（PDGFR和PDGFRβ）被激活，酪氨酸磷酸化(补充图S3A-左侧面板）。相反，在Ad-CM刺激的B16F1细胞中检测到的主要事件是磷酸化c-Met增加，这加强了HGF/c-Met途径的重要性(补充图S3A-右侧面板）。为了验证阵列数据，用Ad-CM刺激E0771细胞不同的时间点，并用磷酸化PDGFRβ和PDGFRα抗体对裂解产物进行印迹。Western blot证实Ad-CM刺激确实导致PDGFRβ酪氨酸磷酸化和受体降解，这是RTK激活的两个标志(补充图S3B)。
PDGF家族由A、B、C和D多肽链的二硫键同源二聚体和异二聚体PDGF-AB组成[26]. Western blot显示PDGFRα和PDGFRβ在E0771细胞中表达，而在B16F1细胞中未检测到(). 与单独的αMEM相比，重组PDGF-BB能够促进E0771，但不能促进B16F1细胞迁移（p<0.01）(). 在Ad-CM中检测到PDGF-BB()。
血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）介导E0771细胞迁移-（A） 用western blot比较B16F1和E0771细胞PDGF受体α/β（PDGFRα/β）水平，β-actin作为负荷对照。（B） 将肿瘤细胞暴露于αMEM或100 ng/mL重组PDGF-BB（rPDGF-BB）中4 h。对迁移的细胞进行计数，并从多次实验中求出平均值。（D） 用PDGF-BB ELISA试剂盒（R&D Systems）对三种独立的Ad-CM制剂中PDGF-BB的浓度进行定量并取平均值。NA，未检测到。（D） 将未经处理或用100 nM PDGFRα/β抑制剂CP-673451或1μM PHA-665752和100 nM CP-67345的组合处理的E0771细胞暴露在指定的培养基中4小时。对迁移的细胞进行计数，并从多次实验中取平均值。**p<0.01，***p<0.001。不另作说明，不重要。
当用PDGFRα/β选择性抑制剂CP-673451（100 nM）处理E0771细胞时，Ad-CM诱导的E0771上皮细胞迁移明显受损（p<0.01），但抑制是部分的（p<0.001）(). 同时，CP-673451治疗完全消除了E0771细胞向rPDGF BB的迁移，表明PDGFR激活完全阻断(). 当用CP-673451和PHA-665752联合处理E0771细胞时，Ad-CM诱导的E0771电池迁移被进一步抑制（p<0.001）(). 值得注意的是，CP-673451和PHA-665752并没有完全消除Ad-CM诱导的E0771迁移（p<0.01）()，提示HGF和PDGF-BB以外的因子也可能在E0771细胞迁移中起作用在体外.
讨论
在此，我们研究了单核细胞前体中HSC衍生脂肪细胞的分化和成熟及其对癌症进展的潜在贡献。单核细胞前体的生成依赖于M-CSF[27]. 在缺乏M-CSF或M-CSF受体的小鼠中，血单核细胞和组织巨噬细胞的数量显著减少[28,29]. 有趣的是，M-CSF还参与脂肪细胞增生/肥大和脂肪组织生长的生理调节[30,31]强调单核细胞参与脂肪组织发育。我们的结果表明，单核细胞前体产生带有多房油滴的未成熟脂肪细胞，当其处于适当的脂肪环境中时，可以进一步成熟。成熟HSC-Ad不表达造血标志物CD45[19].
肿瘤血管化被认为可以加强肿瘤的氧气和营养供应，促进肿瘤生长。这一过程受到多种促血管生成因子的调节，包括VEGF，一种内皮细胞和祖细胞增殖的一般激活剂[32]. 我们观察到，HSC-Ad与肿瘤细胞共同注射导致血管腔扩大可能是由于HSC-Ad-分泌的VEGF，它可以增加血管周围内皮细胞的数量，从而使管腔面积扩大。
HSC-Ad分泌生长因子和脂肪因子，发挥肿瘤类型特异性作用。在癌细胞增殖、肿瘤生长和肿瘤血管形成方面，与E0771乳腺癌细胞相比，B16F1黑色素瘤细胞对HSC-Ad的影响更敏感。然而，研究中测试的单个因素均未显示出对B16F1细胞增殖的决定性贡献。我们推测HSC-Ad介导B16F1肿瘤生长通过多个生长因子及其同源受体的共同努力，没有任何一条途径占主导地位。另一方面，E0771细胞对IGF-1刺激有反应，IGF-1R表达水平远高于B16F1细胞，表明HSC-Ad更多地依赖IGF-1/IGF-1R信号通路调节E0771肿瘤生长。IGF-1R激酶的选择性抑制剂已被证明可抑制MCF-7人乳腺癌细胞的存活和锚定非依赖性生长[33]. 目前，有十多种IGF/IGF-1R抑制剂正在对包括乳腺癌在内的多种癌症进行临床研究[34]. 我们的发现表明了这些抑制剂可能发挥作用的另一种机制。
细胞迁移是与转移相关的癌症进展的一个关键方面。细胞表面受体酪氨酸激酶c-Met和PDGFR在其配体结合后激活多种信号级联，诱导细胞生长、存活和运动[35,36]. HGF/c-Met和PDGF/PDGFR信号通路的高活性发生在不同的癌症类型中，并与肿瘤细胞的不可控生长、上皮-间充质转化、侵袭性和转移有关[37,38]. 靶向c-Met酪氨酸激酶活性的小分子抑制剂已被证明可以预防包括黑色素瘤在内的几种癌症模型的转移[39,40]和乳腺癌[41,42]. 我们证明HSC-Ad主要通过HGF/c-Met信号轴促进B16F1细胞迁移，而除HGF/c-c-Met轴外，PDGF/PDGFR通路对HSC-衍生脂肪细胞促进E0771细胞迁移也有显著作用。PDGF/PDGFR信号转导的影响可能是由于与B16F1细胞相比，E0771细胞中PDGFRβ的高表达和c-Met的低表达，因此HGF/c-Met轴不是主要的，但对E0771的细胞运动仍很重要。抑制这两种途径可能会在抑制乳腺癌转移方面表现出更好的效果。
而这些在体外数据表明HSC-Ad分泌的因子具有促进肿瘤细胞增殖和迁移的潜力，这些作用可能会被复杂的肿瘤微环境所增强，从而导致联合注射组中的肿瘤生长增强体内试验。
HSC为脂肪细胞的生成提供了一种新的来源，但在正常条件下，HSC-Ad不是脂肪组织发育的主要途径[43]. 然而，HSC-Ad在肥胖和癌症等病理条件下是否具有潜在作用尚不清楚。我们假设，在肥胖的发展过程中，循环化学吸引剂（如MCP-1）水平的升高将向脂肪组织招募单核细胞并分化为成熟脂肪细胞。然后，HSC-Ad分泌脂肪因子、炎性细胞因子和趋化因子，从而进一步增强单核细胞前体招募、HSC-Ad积聚和免疫细胞浸润。研究表明，HSC-Ad在内脏脂肪组织（VAT）中的蓄积优先于皮下脂肪组织（SAT），在雌性小鼠中蓄积多于雄性小鼠[19]. 众所周知，VAT中的过度肥胖与2型糖尿病和某些形式的癌症特别相关，而过多的SAT导致这些疾病的风险要低得多[44]. 此外，人类在增值税中通常会不成比例地增加脂肪，体重指数的增加与黑色素瘤和乳腺癌呈正相关[45–47]. 因此，HSC-Ads可能在脂肪相关肿瘤的进展中起到不可或缺的作用，并且对女性来说，脂肪相关妇科癌症的风险更高。HSC-Ad可能是一种新的治疗靶点，旨在抑制癌细胞（尤其是肥胖患者）增强的攻击性和转移能力。更重要的是，我们的研究表明，未来治疗脂肪相关癌症的治疗策略应与仓库和肿瘤类型相关。
致谢
这项工作得到了NIH/NCI（R01 CA148772，A.C.L.）、退伍军人事务部生物医学实验室研究与发展计划（功绩奖，A.C.L）和霍林斯癌症中心（转化研究试点项目，P30 CA138313，A.C.L.）的部分支持。作者感谢Dennis Watson博士提供E0771细胞株，感谢Patricia Watson医生提供技术援助。
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