血液透析动静脉瘘形成术中静脉的组织病理学

新生内膜形成

我们对所有静脉样本进行了组织学分析。图1和​和22图示有或无新生内膜的所选环周静脉样本。然而，因为许多扩张的新生内膜在分布上是偏心的(图3)我们将新内膜形成导致管腔狭窄程度的形态计量学分析局限于371例具有完整环向结构的样本，但进一步排除了6例在组织切片平面上用瓣膜无法准确测量新内膜面积的病例。

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图1。

正常静脉和异常静脉的特征标志图。异常静脉（右）IEL附近有新生内膜和内侧胶原积聚（黄色染色）。在异常静脉中，对指示的标志物进行形态计量学测量，以确定新生内膜（Movat五色染色）对管腔的损害程度。

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图2。

静脉同心新生内膜形成。低倍图像位于左侧（A），高倍图像位于右侧（B）。（A） 新生内膜含有大量蓝色染色物质（蛋白聚糖、箭头），而紧邻IEL的培养基中有显著的胶原同心聚集（黄色染色、长箭头）。未发现明显的炎症浸润。（B） 在新生内膜内观察到混合胶原蛋白（黄色）和蛋白多糖（蓝色）的离散微结构域，如箭头所示。一些微域似乎含有新生血管生成成分（箭头）。（莫瓦特五色染色）

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图3。

静脉异常，新生内膜形成偏心，Movat五色染色。（A） 是低倍图像，（B）是中右侧所示静脉截面的高倍图像图1此样本的新生内膜中蛋白质多糖较少（蓝色染色），血管壁中胶原较少（黄色染色）。血管壁的任何一层都没有炎症浸润。

对剩下的365条静脉进行形态计量分析，其中大多数（88%）显示内膜层有一定程度的扩张（新生内膜形成）。全断面样品中的管腔狭窄从轻微或轻微（新生内膜占管腔总面积的20%或以下）到严重（新生内膜占据管腔总区域的80%以上）不等(图4). 大多数病例（57%）的新生内膜占管腔总面积的20%以上。

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图4。

通过形态计量学分析对365条静脉中新生内膜形成的管腔狭窄程度进行图形描述。大多数静脉（57%）显示新生内膜侵犯管腔面积达20%或更多。近10%的静脉显示80%或更多的严重管腔狭窄。

表2管腔狭窄与患者的特征和AVF的位置有关。新生内膜增生所占管腔面积的平均百分比增加了0.24%/岁(P（P）=0.03）和2.13%(P（P）=0.002）每年用于透析。当年龄和透析时间相互调整和/或采用Tweedie回归（一种专门针对零结块偏斜反应的方法）时，结果基本相似。与其他种族相比，黑人的内脏狭窄程度较低。吸烟者与非吸烟者相比，在有心血管和外周动脉疾病史的参与者中，新生内膜占管腔面积的比例更高，并且在上臂静脉与前臂静脉中。总的来说，用于造瘘的贵要静脉狭窄程度最高（平均[SD]%，39.5[30.4]），肱静脉狭窄程度最低（21.2[23.4]）(P（P）<0.001），当局限于上臂AVF时，头静脉低于其他静脉（30.6[27.4]对40.3[30.2]；P（P）=0.01). 性别、糖尿病病史、冠状动脉、脑血管和静脉血栓栓塞疾病、体重指数和目前的维持性透析状态与管腔狭窄无显著相关性(表2).

新生内膜的组成

这些静脉中的新生内膜主要由细胞外基质和混合的间充质细胞组成，主要表达α–平滑肌肌动蛋白(补充图1–4)，并且没有表现出动脉粥样硬化特有的泡沫细胞、单核细胞/巨噬细胞和脂质核心的大量积聚(图2,​,3,三,​,5,5、和​和6）。6). 对部分静脉样本进行的免疫组织化学检测显示，绝大多数新生内膜细胞表达α–平滑肌肌动蛋白，从而将这些细胞识别为平滑肌细胞、肌成纤维细胞或“肌纤维母细胞样”细胞(补充图3). 用内皮细胞（CD31）和周细胞（PDGF）标记物对复制组织切片进行染色β)显示周细胞与新生内膜内的毛细血管共定位，但平滑肌肌动蛋白表达细胞的绝大多数优势不是周细胞，因此不是平滑肌细胞就是肌成纤维细胞(补充图4).

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图5。

静脉示例，用Movat五色染色，显示管腔新生内膜阻塞程度最高。（A） 该静脉显示胶原（黄色基质，箭头）在整个培养基中聚集。（B） 图（A）中的静脉高倍镜显示新生内膜表面有小血栓（箭头）。新生内膜细胞较多的区域内有几条小血管（箭头所示）。IEL（黑色斑点）在血栓附近的静脉部分被破坏。

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图6。

一个静脉样本，用Movat五色染色，新生内膜层非常古怪。左（A）为低倍图像，右（B）为同一静脉段的高倍图像，该图像是从（A）中黑色轮廓所示的血管区域获得的。该样品的新生内膜和外膜层含有大量胶原蛋白（黄色染色），蛋白聚糖含量极低（蓝色染色）。

运动染色切片显示，细胞外基质由弹性纤维、胶原蛋白和蛋白多糖组成。虽然这些成分通常占据扩张内膜内的离散病灶，但在一些样品中，我们还发现了混合胶原蛋白和蛋白多糖的离散微域，这些微域通常紧邻内弹性层（IEL），与新生内膜的其余部分不同(图2和​和66).

在48条静脉的子集中研究了炎症的存在，其特征是内膜内存在单核细胞/巨噬细胞。大约一半（25/48=52.1%）用于免疫组织化学的静脉样本在内膜内含有至少一个表达CD68的单核细胞/巨噬细胞(补充图2B). 然而，CD68的平均数量⁺任何受累内膜中的细胞都很小（每受累内膜7.7个细胞），很少观察到这些细胞聚集在一起。当CD68⁺细胞呈簇状，与新生血管形成灶相关，以CD31排列的微血管簇为特征⁺-表达内皮细胞。这些微血管也存在于48个检查过的新生内膜中的25个（52.1%）；在有微血管的新生内膜中，我们观察到平均每个新生内膜有20.4条微血管(图7). 免疫组织化学显示细胞周转的证据有限。几乎一半（22/48=45.8%）的新生内膜含有至少一个Ki-67⁺-增殖细胞，受累新生内膜中平均4.2个细胞(补充图2A). 我们很少通过裂解caspase 3的表达来识别凋亡细胞（4/48=12.5%的新生内膜，平均2.0个细胞/受累的新生内膜，补充图2C).

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图7。

用抗CD31抗体免疫染色检测内皮细胞。铁锈色表示免疫染色阳性。低倍图像位于左侧（A），高倍图像位于右侧（B）。静脉管腔内的内皮细胞突出显示。（B）中可见新生内膜和外膜微血管的免疫阳性染色，提示这些区域有新生血管生成。

媒体的构成

所有静脉样本(n个=554），无论组织切片上的环向结构如何，均用于此分析。我们在静脉的内侧发现了显著的胶原蛋白聚集体(图2和​和8）。8). 大多数静脉（79.2%）显示胶原聚集体局限于IEL附近的介质部分。在大约三分之一（33.6%）的静脉中，观察到胶原蛋白位于IEL附近的培养基中，但在整个取样培养基中没有形成连续的环。在另外35.7%的静脉中，这种胶原蛋白形成了一个环形的、连续的环，有时由宽阔的胶原蛋白带组成，而在另外9.9%的静脉中这种胶原蛋白环足够大，相对于正常的静脉结构，可以增加中膜厚度。其余115条静脉（20.8%）在培养基的亚IEL部分没有胶原聚集。表3显示了所有样本中IEL邻近胶原的患病率，与几个患者特征有关。IEL邻近的内侧胶原聚集体在上臂静脉中比前臂静脉中更普遍，具有统计学意义；尽管肱静脉样本数量较少（肱静脉，5/11=45.4%；贵要静脉，137/162=84.6%；头静脉，297/381=77.9%；精确检测P（P）<0.01); 吸烟者比非吸烟者更常见。年龄也与胶原蛋白患病率增加相关（患病率比值比[OR]，1.02/decade，95%可信区间[95%CI]，1.004-1.034；P（P）=0.01).表4将连续且明显全周向的IEL相邻胶原与患者因素联系起来，但仅限于426个样本的子集(n个=371）或以其他方式评估包括≥75%的全横截面(n个=55），对他们来说，可以最可靠地观察到广泛的连续性。在这一亚组中，全周胶原在老年患者中也更常见（OR，1.02；95%CI，1.002至1.031；P（P）=0.03）和上臂静脉与前臂静脉；肱静脉最常见（肱静脉，0/7=0.0%；基底静脉，68/143=47.6%；头静脉，151/276=54.7%；精确测试P（P）<0.01），尽管在上臂样本中，头静脉的这种情况比贵要静脉或肱静脉少见(表4). 全环向胶原蛋白在烟草使用者和非使用者以及糖尿病或心血管疾病患者中更常见(表4).

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图8。

一个静脉样本，用Movat五色染色，新生内膜层非常古怪。低倍图像位于左侧（A），高倍图像位于右侧（B）。该样品在IEL附近的介质和外膜中有大量胶原蛋白聚集体（黄色染色），在新生内膜中有大量蛋白聚糖含量（蓝色染色）。

除了与IEL相邻的胶原蛋白聚集体外，可以在内侧平滑肌层的其余部分发现胶原蛋白，尽管其分布更为分散，且不集中于离散聚集体。只有极少数（2.7%）的患者没有观察到内侧平滑肌层内的胶原积聚；在这些病例中，Movat染色未检测到正常存在于培养基中的少量胶原蛋白。从拍摄的组织学标本中半定量地评估胶原占据的内侧区域的范围。在238条静脉（43.0%）中，高达25%的内侧区域被认为被如此占据；260条静脉（46.9%），26%～50%；41条静脉（7.4%），51%～75%。表5显示了与研究参与者和瘘管的选定临床和人口统计学特征相关的半定量中间区类别的序数比例优势模型的OR；这些也仅限于截面≥75的426个样品。尽管胶原蛋白在男性和女性中的流行程度相似，但在男性中的分布更为广泛（比例优势模型OR，1.98/介质范围的增加类别[0，≤25%，26%-50%，51%-75%]；95%CI，1.32至2.96；P（P）=0.001）和上肢瘘管（比例优势模型OR，2.03；95%CI，1.30至3.17；P（P）=0.002).

组织学

在造瘘时，手术切除紧邻造瘘静脉部分的5-10mm静脉段，并在15分钟内细分为四个离散样本，其中一部分放入10%中性缓冲福尔马林中，如前所述，¹⁰并用于本手稿中描述的所有组织学研究。固定24-72小时后，将福尔马林固定组织置于70%乙醇中进行短期储存，并从每个参与中心运送至中央组织学核心实验室。收到后，按照标准方案处理组织并将其嵌入石蜡中。将四个微米切片放在载玻片上，用Movat五色程序进行组织学染色，用茜素红S进行钙评估。¹⁹5例未手术病例和54例符合研究标准，并被纳入病理评估。两名患者拒绝接受标本采集，另外46名患者在手术过程中未获得静脉标本。

Movat五色染色

Movat五色程序将胶原蛋白黄、蛋白多糖和粘蛋白蓝、细胞核和弹性纤维染色为黑色、肌肉红和纤维蛋白深红色，从而使构成静脉结构的各种元素清晰可见。这种染色可以在单个组织切片中区分构成静脉壁的三层(补充图1). 内膜是最靠近管腔的区域，通过IEL与静脉的剩余部分隔开。培养基由均匀的平滑肌细胞群组成，单个细胞周围有精细分布的弹性组织，位于黑色IEL和外部弹性层（EEL）之间。外膜由松散结缔组织和微血管组成，位于EEL外部。这些功能如所示补充图1通过这些染色特征，可以确定任何新生内膜增生所占据的静脉腔和空间，并对扩张的新生内膜所占据的管腔面积进行形态计量学分析(补充图1)以及病理改变的定位，如白细胞积聚和/或小血管增生。

对获得静脉全周组织切片的所有病例的Movat五色染色玻片进行形态分析(n个=371），不包括六个内部结构被阀门遮挡的样品n个=365.每张幻灯片的照片均以40倍放大率拍摄，并导入ImagePro Plus软件。获得了IEL长度、EEL长度、管腔面积、最大管腔面积（开放管腔面积加上新生内膜所占管腔面积）和总静脉面积的校准测量值，如补充图1当胶原可以定位于紧邻IEL的血管壁内侧部分的区域时，通过Movat染色的染色质量确定胶原的存在。这种IEL邻近的内侧胶原进一步表现为是否呈环状分布，是否以大聚集体形式出现。血管壁内侧层（但不靠近IEL）胶原积聚的程度被评分为无（Movat染色检测不到数量太少），或胶原占内侧区域的25%、26%-50%和51%-75%。

用茜素红S试剂染色的组织切片中发现钙沉积。钙的存在进一步表现为存在于新生内膜、中膜、外膜微血管和/或血管外外膜中。此外，记录了钙聚集物或细点状分布的染色模式。

代表整个队列的50例患者的子集用于额外的免疫组化分析。该子集取自至少75%估计横截面可用的静脉标本，从结合临床部位、完整或部分横截面以及显著（≥20%）与非显著（<20%）管腔狭窄形成的地层中按比例选择。在这50例病例中，有两例随后被从这部分研究中删除，因为它们是在术后瘘管病干预研究中收集的，并且错误地被纳入了样本库。免疫组织化学和适当的对照组使用前面描述的一般程序进行。^20,21用CD68抗体（克隆PGM1；Dako，Carpindia，CA）对这些病例进行染色，以评估组织内单核细胞含量，作为炎症的一般衡量标准；CD31（克隆JC70A；Dako），内皮细胞标记物作为新生血管生成的通用标记物；Ki67（克隆Sp6；ThermoFisher Scientific，Waltham，MA）作为细胞增殖的标志物；裂解半胱天冬酶3（兔子多克隆，#9661；细胞信号，丹弗斯，MA）作为凋亡标记；α-平滑肌肌动蛋白（克隆1A4；Dako）作为具有平滑肌细胞或肌成纤维细胞或肌纤维母细胞样表型的间充质细胞的标记；血小板衍生生长因子β作为周细胞标记物（Epitomics[目录号ab32570，兔单克隆克隆Y92]；Abcam）。脱蜡切片在pH为6的柠檬酸盐缓冲液中进行热介导抗原回收（HIER-L；ThermoFisher Scientific），用2.5%的正常马血清封闭，在4°C下与一级抗体孵育过夜，然后与宿主匹配的ImmPress马萝卜过氧化物酶试剂孵育（加利福尼亚州伯林盖姆向量实验室），用QuantoDAB基底（ThermoFisher Scientific）开发，用苏木精复染，脱水，盖玻片。对每个抗体的新生内膜和培养基中的阳性染色进行定量（阳性细胞总数），CD31和α–平滑肌肌动蛋白。当存在时，CD68表达细胞定位于静脉的特定解剖部位（内膜、新内膜、中膜、外膜）。每个隔间内，CD68⁺以该隔室的总面积对细胞进行定量。CD68独特模式的定性评估⁺细胞定位(例如在胶原优先堆积的部位，发现明显的细胞增殖部位或新生血管形成部位）。CD31的免疫组织化学染色允许通过对每个微血管的内皮衬里进行CD31染色来量化每个腔室（新生内膜或中膜）内的微血管数量。α-平滑肌肌动蛋白表达细胞太多，无法计数，并对静脉内的总体分布模式进行了定性评估。

血液透析瘘管成熟研究由国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的拨款U01DK066597、U01DK082179、U01K082189、U01DK082218、UO1DK082232、U01丹麦082236和U01DK0082240资助。

2012年10月30日至11月4日，在加利福尼亚州圣地亚哥举行的美国肾脏学会肾脏周上介绍了这项工作的部分内容。

血液透析瘘管成熟研究小组成员：宾夕法尼亚大学指导委员会主席：H.Feldman。波士顿大学临床中心：L.Dember（PI）、A.Farber、J.Kaufman、L.Stern、P.LeSage、C.Kivork、D.Soares、M.Malikova；阿拉巴马大学：M.Allon（PI）、C.Young、M.Taylor、L.Woodard、K.Mangadi。辛辛那提大学：P.Roy‐Chaudhury（PI）、R.Munda、T.Lee、R.Alloway、M.El‐Khatib、T.Canaan、A.Pflum、L.Thieken、B.Campos Naciff；佛罗里达大学：T.Huber（PI）、S.Berceli、M.Jansen、G.McCaslin、Y.Trahan；德克萨斯西南大学：M.Vazquez（PI）、W.Vongpatanasin、I.Davidson、C.Hwang、T.Lightfoot、C.Livingston、A.Valencia、B.Dolmatch、A.Fenves、N.Hawkins；犹他大学：A.Cheung（PI）、L.Krass、D.Kinikini、G.Treiman、D.Ihnat、M.Sarfati、I.Lavasani、M.Maloney、L.Schlotfeldt、C.Terry、Y-T Shiu；华盛顿大学：J.Himmelfarb（PI）、C.Buchanan、C.Clark、C.Crawford、J.Hamlett、J.Kundzins、L.Manahan、J.Wise。克利夫兰诊所数据协调中心：G.Beck（PI）、J.Gassman、T.Greene、P.Imrey、L.Li、J.Alster、M.Li、J.MacKrell、M.Radeva、B.Weiss、K.Wiggins。核心：华盛顿大学组织学核心：C.Alpers（PI），K.Hudkins，T.Wietecha。伯明翰阿拉巴马大学超声中心：M.Robbin（PI）、H.Umphrey、L.Alexander、C.Abts、L.Belt。血管功能核心波士顿大学：J.Vita（PI，已故），M.Duess，N.Hamburg，A.Levit。储存库：NIDDK生物样品储存库——Fisher生物服务：H.Higgins，S.Ke，O.Mandaci，C.Snell。NIDDK DNA Repository-Fred Hutchinson癌症研究中心：J.Gravley，S.Behnken，R.Mortensen。外部专家组：G.Chertow（主席）、A.Besarab、K.Brayman、M.Diener-West、D.Harrison、L.Inker、T.Louis、W.McClellan、J.Rubin。NIDDK：J.Kusek、R.Star。