纳米颗粒的细胞摄取：细胞内的旅程

3.1吞噬作用

吞噬作用主要发生在专业吞噬细胞中(例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞），负责宿主防御和吸收死亡细胞和细胞碎片。然而，一些其他类型的细胞(例如成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞）也具有吞噬活性，但程度较低，称为旁吞噬细胞。³¹

NP的吞噬作用通常由调理作用启动：调理蛋白如免疫球蛋白(即、抗体）、补体蛋白或其他血液蛋白(例如层粘连蛋白和纤维连接蛋白）被吸附到NP表面^31,32（请参见图1). 然后，Opsonized NPs被吞噬细胞识别，并通过特定的配体-受体相互作用附着到吞噬细胞上。这启动了一个信号级联，可以触发肌动蛋白的组装，形成细胞表面延伸，随后吞噬和内化颗粒，形成所谓的“吞噬体”。³³上述事件需要30分钟到几个小时，具体取决于细胞类型和粒子表面的性质。参与这一过程的吞噬细胞受体包括Fc受体、补体受体和其他受体，如甘露糖/果糖受体和清道夫受体。

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图1

调理过程的示意图，由免疫球蛋白或其他补体蛋白（调理蛋白）吸附到纳米颗粒表面启动。随后通过吞噬细胞上的受体识别Opsonized颗粒并内化。

吞噬途径的吸收受NP的物理化学特性（包括大小、形状和表面性质）的控制。³³吞噬作用的确切机制以及随后的事件也取决于所涉及的受体类型；例如，Fc受体依赖性吞噬作用会产生促炎介质，而补体受体依赖性吞噬作用则不会。³⁴因此，相关受体不仅影响NP的传递，还影响其毒性（即炎症反应）。

一般来说，较大的颗粒被吞噬细胞更有效地吸收。例如，当使用200-1500nm大小范围内的放射性标记白蛋白NP时，较大的颗粒在与人类单核细胞孵育时明显具有较高的吞噬能力。³⁵这与另一项关于聚苯乙烯NP的研究一致，聚苯乙烯NPs的大小在460到2100纳米之间，其中小鼠腹腔巨噬细胞的最大摄取量在1000到2000纳米之间。^36,37

此外，还发现形状对NP的细胞摄取有深刻影响。^38,39例如，Arnida的一项研究等人。在与小鼠巨噬细胞孵育6小时后，比较聚乙二醇化金纳米棒和纳米球的细胞摄取。对细胞进行洗涤、裂解和分析金含量。金纳米棒的积累程度低于纳米球。这些发现有助于解释体内研究的一部分是，与纳米球相比，在卵巢癌小鼠体内注射金纳米棒后，金纳米棒的循环时间更长。^38,39

控制吞噬细胞摄取NPs的另一个关键参数是其表面特性(图2)首先影响调理作用，然后与促进吞噬作用的细胞膜受体相互作用。NP与空间屏蔽聚合物（如亲水PEG）的功能化可改变细胞摄取。⁴⁰聚乙二醇化NP可以通过阻止或最小化蛋白质吸附到其表面来排斥调理作用。这可以用PEG分子在溶液中的构象来解释：它们的延伸形式往往会在NP之间形成排斥屏障。这种力量可以平衡或克服预期调理的吸引力。有趣的是，这种排斥需要最小的层厚，这取决于聚合物的分子量、构象和吸附链的密度。⁴¹聚乙二醇化可以通过避免网状内皮系统（RES）摄取，将NP的循环半衰期从几分钟延长到几个小时。⁴²一个有趣的例子是第一个FDA批准的抗癌脂质体（多西利^®)其中聚乙二醇化减少吞噬细胞的摄取，从而延长载阿霉素脂质体的半衰期，改善纳米载体的整体药代动力学。⁴³相反，具有带电或疏水表面的NP会吸引补体蛋白，从而被吞噬细胞吸收。³³

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图2

表面特性对纳米颗粒调理和随后内化到细胞中的影响。图中比较了PEG涂层纳米颗粒和未涂层纳米颗粒。PEG外壳排斥补体蛋白质，从而最大限度地减少蛋白质吸附，从而减少细胞摄取。因此，未涂层纳米颗粒的细胞摄取量更大。

极易受调理作用影响的NP可优先积聚在RES器官，如肝脏和脾脏。这种积累可用于选择性治疗影响这些器官的疾病，如肝癌和肝脏感染。³⁰一个有趣的例子是将抗癌剂阿霉素加载到200–300 nm的聚烷基氰基丙烯酸酯NP中。交付后，这些颗粒大量积聚在肝脏枯否细胞中，枯否细胞起贮存器的作用，随着颗粒降解，阿霉素缓慢释放。⁴⁴当给小鼠注射时，与游离形式的药物相比，这种NP表现出较低的全身毒性，这表现在动物存活率更长且没有器官萎缩。⁴⁵这些颗粒的摄取并不是完全通过吞噬途径实现的，这表明可能还涉及其他机制。³⁰该制剂已通过一期临床试验⁴⁶目前正在进行名为Transdrug的三期临床试验^®.32另一个例子是将抗真菌剂两性霉素B封装成纳米脂质体（AmBisome^®)治疗利什曼病，一种由隐藏在肝巨噬细胞中并存活的真菌引起的感染。⁴⁷然而，肝库普弗细胞对NP的快速捕获在递送到非巨噬细胞群体时可能是有问题的；因此，延长循环可以通过应用一种或多种巨噬细胞逃避技术来实现，例如干扰蛋白质吸附和调理，管理脾脏过滤，以及在脉管系统内进行各种颗粒限制的尝试。⁴⁸

3.2氯氰菊酯介导的内吞作用（CME）

氯菊酯介导的内吞作用是细胞获得营养和质膜成分（如胆固醇）的主要机制通过通过转铁蛋白载体的低密度脂蛋白（LDL）和铁(图3). CME或通过受体特异性摄取或非特异性吸附摄取，也称为受体依赖性CME。在受体依赖型CME中，摄取发生时没有与膜成分直接结合；相反，非特异性的疏水或静电相互作用最终会引发摄取。⁴⁹

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图3

网格蛋白介导的内吞作用示意图。该过程由配体识别启动，然后形成氯氰菊酯包被的凹坑。在三氯氰菊酯的帮助下，形成六边形晶格，诱导质膜内陷。然后，dynamin（一种断裂蛋白）将囊泡释放到细胞质中，在那里进行脱膜。

CME发生在富含氯氰菊酯的质膜区域；这些区域覆盖了细胞表面约0.5–2%的区域。⁵⁰氯氰菊酯组装单元被称为triskelion，它有一个由三条重链和三条轻链组成的三能级结构(图3).⁵¹这种独特的蛋白质和其他蛋白质（如下所述）负责自发地共同组装成一个复杂的结构，生成并稳定膜曲率，然后形成出芽囊泡。衔接蛋白是几种不同货物和分拣信号的识别位点；它们被用于质膜细胞质表面的对接位点。衔接蛋白和辅助蛋白负责膜内化位点的网格蛋白成核的协调。⁵²成核促进了网格蛋白三重离子组装成由五边形和六边形组成的弯曲晶格；这导致膜内陷到氯氰菊酯涂层的凹坑中，从而稳定膜上的变形点。⁵³辅助蛋白质类(例如、epsin、两性激素、SNX9）有助于生成和稳定膜曲率。Bin-amphiphysin-rvs-BAR蛋白可以与膜断裂蛋白dynamin结合，并将其补充到出芽囊泡的颈部，将囊泡释放到细胞质中。⁵⁴在CME期间，形成直径为100–150 nm的囊泡，吞噬与形成囊泡的可用内部体积成比例的细胞外液体积。然而，通过这一途径进入细胞的颗粒往往最终进入降解溶酶体^28,55并且可能不适合涂覆由易被溶酶体酶降解的材料制成的NP。

研究了几种NP通过CME途径的摄取情况。例如，发现由D，L-聚乳酸（PLA）和聚乙二醇-聚乳酸（PEG-co-PLA）组成的NP通过CME途径和小窝介导的内吞作用被内吞（小窝介介导的途径将在下文中详细讨论）。此外，观察到表面电荷对摄取机制和细胞内命运具有主导作用。例如，在HeLa宫颈癌细胞中，阴离子颗粒通过这两种机制表现出细胞摄取，而带正电的颗粒则严格遵守CME。⁵⁶在相同的背景下，利用MDA-MB-231细胞，通过氯氰菊酯（作为CME标记物）和溶酶体追踪（跟踪溶酶体摄取）的共定位，研究了硅纳米管（SNT）的摄取机制。共焦显微镜显示，与未修饰的裸SNT相比，带正电的粒子实现了更高的细胞相互作用和吸收。⁵⁷

3.3腔泡依赖性内吞

小泡依赖性内吞在许多生物过程中起着关键作用，例如细胞信号传递、细胞内吞、脂质、脂肪酸、膜蛋白和膜张力的调节。此外，小窝介导的内吞作用被认为与多种疾病有关，包括癌症、糖尿病和病毒感染。^58–65

Caveolae是存在于上皮细胞和非上皮细胞中的烧瓶状膜内陷，散布在锚定细胞骨架的致密体区域之间。在非上皮细胞如脂肪细胞和平滑肌细胞的情况下，小窝在细胞膜中占很大比例，使表面积增加了75%(图4).^66,67

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图4

小窝介导的内吞示意图。小泡蛋白在曲率形成中起主要作用。与CME中一样，动态蛋白是一种断裂蛋白，可以使囊泡萌芽并释放到细胞中。

小窝的大小为50-80纳米，内衬小窝蛋白，这是一种二聚蛋白，参与形成其特有的烧瓶形状。另一种被称为小窝蛋白2的小窝蛋白参与结构稳定。^58,59,61其他蛋白质也在小窝介导的过程中发挥重要作用。例如，cavin蛋白有助于膜弯曲，dynamin介导萌发囊泡的断裂和释放，囊泡相关膜蛋白（VAMP2）和突触体相关蛋白（SNAP）参与随后的囊泡融合。^68,69商用纳米治疗药物阿布烷^®紫杉醇是一种蛋白结合形式的紫杉醇，通过小窝介导的内吞作用被癌细胞吸收。白蛋白对制剂有很大的附加价值，因为它与gp60结合，gp60是内皮细胞小泡中的白蛋白受体，促进其运输到肿瘤间质空间，并在那里对癌细胞发挥作用。³⁰

由于颗粒通过这种依赖小窝蛋白的机制进入细胞有时可以逃避溶酶体降解，因此一些病原体（如病毒）利用这种进入途径来逃避降解⁷⁰在药物传递方面，该途径似乎有助于传递可降解材料，如基因和蛋白质。⁷¹然而，进入酸性溶酶体可能是设计具有酸触发释放特性的纳米治疗药物的基础。⁷²例如，Sahay等.⁷³通过pH-敏感的腙键研究载药阿霉素的NPs通过小窝介导的细胞摄取，试图在上皮癌细胞溶酶体的酸性环境中实现细胞内药物释放。⁷³

3.4氯菊酯/小窝非依赖性内吞

不依赖于网格蛋白和小窝蛋白的内吞作用发生在缺乏网格蛋白和小窝蛋白的细胞中。这些细胞通过其他途径吸收不同的物质，如细胞液、白细胞介素-2和生长激素，需要一种不含网格蛋白和小窝蛋白的特定脂质成分（主要是胆固醇）。^29,74,75

此外，叶酸也通过这一途径被内化。⁷⁶考虑到癌细胞生长的本质，包括对叶酸的需求增加，叶酸的生物功能化经常被用于靶向性目的。叶状修饰的NP是通过这种途径内化的粒子的一个很好的例子。叶酸与其受体结合，导致叶酸功能化NP无损地传递到细胞质中。⁷⁷叶酸受体介导的内吞作用内化的颗粒也可能逃逸进入溶酶体，并经常滞留在内吞室中或直接释放到细胞质中。⁷⁸

3.5大胞饮症

大胞饮作用是一种独特的胞饮作用过程，因为它不涉及脂筏或坑道形成蛋白的利用。在这里，细胞骨架重排导致大的膜延伸或皱褶形成，然后融合回质膜，形成一个大的囊泡（0.2–5μm），捕获大量的细胞外液(图5).⁷⁹在大胞饮作用中，细胞外液中的所有颗粒和溶解分子都被带入内吞囊泡，而不管其是否存在特定的受体，这使得该过程成为一种非特异性体液摄取形式。

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图5

大胞饮症过程示意图。一旦识别，细胞内信号通路被激活，以促进大的膜延伸的形成。然后，这些皱褶重新融合，形成一个大的囊泡，通过膜延伸/过程吞噬细胞外液的内容物。

大胞饮症在许多生理功能中都很重要，例如抗原提呈⁸⁰并作为微生物病原体（包括许多细菌和病毒）的入口。⁷⁹因为这一过程涉及到大小泡的形成，所以被认为对更大的NP的摄取很重要，而这些NP是不可能通过网格蛋白或小泡依赖性内吞来实现的。⁸¹

4.1尺寸和形状的影响

NP的大小在细胞摄取中起着重要作用。⁹¹细胞摄取的一个关键步骤是NP和CM之间的物理相互作用，这可能导致NP在细胞表面的分离和聚集以及随后的CM反应。⁹²已经提出了几种理论模型来预测NP被内吞的低阈值半径。乔杜里等人。⁹³提出了一个两步模型，该模型包括细胞和配体包覆的球形NP在热力学平衡中的作用。作者推导了NP最小半径的方程(R（右）_最小值)需要完全包裹。(R（右）_最小值)取决于配体-受体结合释放的能量（粘附强度）和弯曲膜所需的能量（膜刚度）。此外，他们在摄取前纳入了NP和CM之间可能的静电相互作用，以模拟真实的内吞条件。他们的结果表明，NP簇的内化率高于单个NP。

此外(R（右）_最小值)不随排斥相互作用值的增加而改变，而最大吸收减少，这可以用能量平衡项来解释。史密斯等人。⁹⁴理论上表明，完全被膜包裹的NP不一定会从膜上脱落。为了完成吞没过程和随后的逃逸，形成相分离的膜域(即。，脂筏）。勒比汉等人。⁹⁵证明了二氧化硅基NP完全迁移到模仿大CM的单层脂质体中。低温透射电子显微镜（cryo-TEM）和低温电子断层扫描显示，NP通过三步主动过程内化到脂质体中，而不是通过膜进行被动扩散：i）囊泡扩散；ii）几乎完全吞没；iii）完全内化的NP(图7).

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图7

NPs通过活性过程内化到脂质体的示意图。

NP-膜相互作用会以大小依赖的方式干扰细胞膜的功能和/或完整性。例如，De Planque等人。⁹⁶据报道，膜的渗透性和完整性在很大程度上取决于相互作用NP的大小和表面化学。在另一项研究中，张等人。⁹⁷发现与不同大小的二氧化硅纳米颗粒相互作用后，巨大单板层小泡（GUV，一种合成膜模拟系统）的形态变化存在显著差异。在18-nm二氧化硅NP的情况下，光滑和球形的GUV转化为带有微孔的皱缩“纸袋”，而与182-nm二氧化氮NP相互作用的GUVs转化为带有单个微孔的皱褶“盆”。此外，扩散系数测量表明，小硅纳米颗粒显著降低了脂质流动性(即。，它们具有冻结作用）。脂质流动性的降低是时间依赖性的，这表明它不是通过一级急剧相变进行的。另一方面，较大的二氧化硅纳米颗粒强烈增加了GUV的横向扩散，这归因于包裹机制在GUV膜中引入的缺陷。⁹⁷

需要对NP大小对内吞作用的影响进行定量和定性研究，以提高我们对NP毒性的理解，并设计用于诊断和治疗的有效NP。一些实验研究表明，~50 nm是NP在某些细胞中实现最高细胞摄取的最佳尺寸。⁹⁸然而，理论模型表明阈值较低，因为这些模型大多基于膜变形。例如，Chithrani等人。⁹⁸定性证明，在血清蛋白存在的情况下，HeLa细胞内球形金纳米粒的数量（引入通过受体介导机制）强烈依赖于NP大小；50nm的NP比14-100nm范围内的其他NP更有效地进入细胞。作者观察到Herceptin涂层Au NPs（Her-Au NP）与SK-BR-3细胞的ErbB2受体之间的相互作用(即。，受体介导的内吞作用）在很大程度上依赖于NP的大小；40–50 nm金纳米粒的细胞内摄取量大得多；⁹⁹较小的NP不能增强吸收过程，因为它们在被膜吞噬之前不能占据多个受体结合位点并与受体牢固结合(即。，低结合亲和力）。相反，尽管多价受体结合，但较大的NP对于有效内吞所必需的膜包裹来说太大了。

掸邦等人。¹⁰⁰比较了直径为4、12和17 nm的单个Au NP和HeLa细胞的吸收力和解离力。他们的结果表明，吸收力和解离力都随着NP尺寸的增加而增加，这可以追溯到更大的相互作用区域。由于NP与生物介质接触时暴露于高浓度离子，因此通常会形成异质聚集体。^98,101,102根据NP的理化性质和细胞类型，NP的聚集可以定量地影响细胞摄取。为了正确模拟生物环境中自然形成的聚集体，Albanese等.¹⁰³开发了一种制备不同大小柠檬酸包金纳米粒的非沉淀转铁蛋白包被聚集体的方法。细胞暴露于恒定数量的单分散NP（15 nm）和各种聚集状态(即。，26、49和98 nm），并量化金NP摄取。对于HeLa和A549细胞系，聚集的NP的摄取平均比未聚集的Au NP低25%。更重要的是，作者表明，不能基于类似大小的单个NP的内吞作用来预测聚集体摄取，因为i）聚集体由小的NP亚基组成，比较大的球形NP具有更高的表面曲率，这降低了聚集体表面靶向部分的密度；ii）骨料的不规则形状可能导致长宽比大于1（非球形）；以及iii）聚集体的不对称结构也可以通过多价受体-配体相互作用极大地影响结合亲和力。如果NP的聚集增加了其沉降速率，则其吸收速率将高于单个NP。¹⁰⁴其他有意义的实验研究也揭示了NP大小与其细胞间分布之间的关系。例如，威廉姆斯等人。¹⁰⁵利用高含量分析（HCA）平台在四种不同的细胞中定位尺寸调谐的CdTe和CdSe/ZnS量子点，证明量子点在足够小（2.1 nm）的情况下可以进入细胞核，最终进入所有检测细胞类型的核仁。随着量子点的尺寸增加到4.4nm，对细胞的渗透减少。纳比耶夫等.¹⁰⁶证明活的人类巨噬细胞可以快速吸收并使用其主动运输机制将QD集中在特定于QD大小的不同细胞隔室中。

另一个对NP大小对内吞作用的影响产生重大不确定性的问题是如何生成实验数据。为了消除这种担忧，需要使用各种补充技术进行全职专门研究。沙佩罗等人。¹⁰⁷使用流式细胞术（以及共焦显微镜和电子显微镜）研究A549细胞内不同大小（50、100和300 nm）的二氧化硅NP的细胞摄取、运输和最终定位随时间的变化。他们表明，二氧化硅纳米颗粒的吸收速率随着尺寸的增加而降低；然而，由于NP的尺寸依赖性荧光强度，非标准化流式细胞术可能导致动力学曲线的错误解释。

除了大小外，NP的形状也是细胞摄取的另一个关键因素。与前面提到的关于杆状和球形金纳米颗粒细胞摄取的报告一致通过小鼠巨噬细胞³⁸一些实验研究表明，杆状NP的细胞摄取量低于球形NP。^98,108例如，HeLa细胞吸收74纳米和14纳米球形金纳米颗粒的速率分别是74×14纳米棒状金纳米颗粒速率的5倍和3.75倍。⁹⁸奇特拉尼等人。¹⁰⁸提出了两种可能的解释：第一，棒状NP的膜包裹时间比球形NP长；其次，吸附在纳米棒纵轴上的表面活性剂分子会撞击NP表面的配体结合，从而促进细胞摄取。长宽比（定义为纳米棒的长度与宽度之比）也对细胞摄取有显著影响。在这种情况下，长宽比较低的杆状Au NP的细胞摄取（HeLa细胞系）大于长宽比较高的NP(即1.5 > 3.5 > 6). 邱等人。¹⁰⁹据报道，长径比较短的金杆状NP（从1到4，大小分别为~30×33 nm、21×40 nm、17×50 nm和14×51 nm）比长NP进入人类乳腺癌细胞（MCF-7）的速度更快。原因是，如上所述，对于较大的杆状NP，膜包裹时间较长，这可能是因为形成了较大的不规则形状的聚集体。然而，另一项研究¹¹⁰证明150×450-nm杆状（纵横比3）阳离子交联PEG水凝胶NP被HeLa细胞内吞的速度是200×200nm（纵横比1）NP的4倍。此外，在4小时的孵育期内，所吸收的100×300 nm NP的数量少于具有相同长径比的较大NP。因此，作者得出结论，由于可用于结合的受体位点数量不同，绝对大小和/或体积也会影响杆状NP的细胞摄取。达斯古普塔等.¹¹¹采用模拟方法，分别展示了不同长径比和边缘曲率的纳米棒和纳米管的形状和取向在细胞摄取中的作用。对于杆状颗粒，他们发现更高的纵横比不适合完全包裹。小长径比和扁平尖端的NP在“火箭”模式下以尖端第一的方式进入，而高长径比、圆形尖端则通过“潜艇模式”进入，长边平行于薄膜。¹¹¹班纳吉。等.¹¹²最近研究了球形、棒状和圆盘状聚苯乙烯NP的细胞摄取；通过在一维（杆，流体动力学直径=394nm）或二维（盘，流体动力学直径=293nm）中拉伸200nm的球体来制造杆和盘。当这些NP的体积保持不变时，棒的表面积是球体的两倍，表面积是圆盘的1.5倍。结果表明，Caco-2细胞吸收杆和盘状核蛋白的速度是球体的两倍。此外，生物素结合增加了这些NP的摄取，无论其形状如何，但方式不同；事实上，生物素结合使棒状NP的吸收增加了三倍，球状/圆盘状NP增加了两倍。作者将活性靶向杆与靶向盘和球相比的更高吸收与其更大的表面体积比联系起来，从而提供更多生物素结合位点，从而增加了定位和与细胞受体相互作用以进行吸收的可能性。¹¹²

研究表明，几何形状也可以决定NP的摄取机制，从而决定细胞内的命运。例如，孟等人。¹¹³合成了长径比为1.5–1.7（MSNP1）至2.1–2.5（MSNP2）至4–4.5（MSNP3）的介孔球形（110 nm）和棒状二氧化硅NP。HeLa和A549细胞的细胞测定结果显示，与球形NP相比，杆状NP的细胞摄取量显著增加；此外，在杆中，中间长宽比(即2.1–2.5）与最高内部化相关。更重要的是，定性和定量结果表明，MSNP2的更大内化可归因于微接种的激活，小GTP结合蛋白的激活增强以及肌动蛋白细胞骨架和丝状体的形成证明了这一点。

羊群等人。¹¹⁴研究了三种二氧化硅纳米颗粒结构的细胞摄取：蠕虫状（232×1348 nm）、圆柱形（214×428 nm）和球形（178 nm）。他们发现，吸收率，特别是在早期阶段，取决于几何形状。作者将他们发现的变化与具有不同几何形状的NP经历的不同内化机制联系起来。此外，化学抑制剂实验表明，氯氰菊酯介导的内吞作用是球形NP最有利的机制，而其蠕虫状NP则经历微内吞或吞噬作用。作者对这一现象的推测是，蠕虫和圆柱体对于网格蛋白介导的内吞作用来说太大了，只能与CM相互作用通过其200纳米尺寸或其他尺寸（400和1300纳米）；即在微接种和吞噬的大小限制范围内。使用耗散粒子动力学（DPD）模拟方法，Yang等.¹¹⁵据报道，不同形状的NP穿透脂质双层的方式不同。他们的结果还表明，NP穿透由两步旋转过程组成，除了几何形状外，还强烈依赖于NP的初始方向和位置。

4.2表面电荷的影响

带电NP和CM之间的静电相互作用具有重要的生物学意义。⁹¹许多关于NP与膜相互作用的理论研究强调了NP表面电荷的重要性等人。¹¹⁶采用分子动力学模拟，探讨阳离子纳米粒与磷脂膜之间的静电吸引效应；与不带电的NP相比，带电NP表现出更有利的热力学相互作用。此外，带正电的NP与CM的粘附可以促进膜包裹现象。计算脂尾的平均序参量，这是对所研究的特定键的运动各向异性的测量，并得出其时间平均取向，也表明阴离子NP的粘附力对膜的结构有较强的影响(即。，形成高密度脂尾结构域），与阳离子NP相比，阳离子NP在粘附位置引起局部紊乱。在另一份分子动力学模拟报告中，探讨了三种Au-NP（阳离子、疏水和阴离子）与电负性和电中性双层的相互作用。¹¹⁷结果证实了静电相互作用对NP和双层之间疏水相互作用的主导作用。更具体地说，带正电的NP对双层膜具有更强的破坏性影响。此外，随着电荷密度的增加，膜的渗透性和破坏性都增加，但方式不同；当电荷密度较低时，渗透度显著增加，达到最佳值（阳离子覆盖率为50），而当电荷密度较高时，膜破裂开始迅速增加。¹¹⁷南佳等人。¹¹⁸表明表面电荷密度可以显著影响非球形NP的初始取向。例如，米形NP与脂质双层相互作用的计算结果表明，具有高正表面电荷的NP变得平行于带负电荷的脂质膜，这最大限度地提高了粘附性，并导致双层的实质性破坏。此外，研究结果强调了NP形状和表面电荷密度之间的相互作用，可以通过工程设计将移位率提高60个数量级。¹¹⁸

大量实验研究集中于具有各种表面电荷的NP与脂质双层组装体之间的相互作用，以加深对NP与膜相互作用的理解。勒鲁埃伊等人。⁸⁵使用AFM/SLB研究了各种阳离子NP对膜的破坏程度。检测到三种常见的中断类型：i）累积在预先存在缺陷边缘周围的NP(例如膜孔、膜变薄和/或膜侵蚀），但不会产生新的缺陷(例如帕姆G3-NH₂树枝状大分子）；ii）主要破坏双层的NP通过扩散到预先存在的缺陷并将其扩大(例如胺涂层Au NP（Au-NH₂)、细胞穿透肽MSI-78和PAMAM G5-NH₂树枝状大分子）；iii）直接诱导脂质双层中孔洞和缺陷形成的NP，例如HIV病毒PAMAM G7-NH使用的TAT序列31₂、聚乙烯亚胺（PEI）、二乙氨基乙基萃取剂（DEAE-DEX）和胺涂层二氧化硅NP（硅-NH₂). 李和马尔姆施塔特¹¹⁹结果表明，相对较小的阳离子聚苯乙烯（20 nm）NP引发了GUV的变形和孔隙（18–27 nm大小）的形成。与理论结果一致，研究表明，阳离子NP与脂类的磷酸基团之间的强静电相互作用使NP与膜的结合最大化，增加膜表面张力，导致孔隙的形成。王等人。¹²⁰表明NP(即。，20纳米聚苯乙烯胶乳）具有负或正表面电荷，与脂质膜结合并引起膜相状态的变化。更具体地说，带负电荷的纳米颗粒在流体双层中诱导局部凝胶化，而带正电荷的纳米微粒则诱导凝胶膜局部流化。磷脂膜的这种表面重建归因于具有负或正表面电荷的NP，这些NP优先与N相互作用⁺/P（P）⁻脂质膜的末端。

还有一些研究试图更全面地阐明表面电荷在NP和细胞膜之间相互作用中的作用。例如，Cho等人。¹²¹据报道，阳离子金纳米粒在SK-BR-3细胞中的吸收速率是阴离子纳米粒的五倍以上。作者还表明，一半的阳离子金纳米粒通过在CM中产生孔洞或其他破坏扩散到细胞中(即。，通过非内吞途径），而阴离子和中性NP仅通过内吞途径内化到细胞中。阿里佐等人。¹²²据报道，带正电荷的Au-NP可诱导不同类型细胞的膜去极化，即。，卵巢癌CP70和A2780细胞、人支气管上皮细胞（BEC）和人气道平滑肌（ASM）细胞。膜去极化导致Ca增加²⁺细胞内可诱导细胞内通路调节的浓度(例如抑制正常细胞的增殖和活性降低）。

他等人。¹²²与中性粒子相比，巨噬细胞对具有较高表面电荷（无论是正电荷还是负电荷）的壳聚糖纳米粒的摄取增加，表明静电相互作用在吞噬作用中的重要性。然而，在非吞噬细胞（人肝细胞系L02和人肝癌细胞系SMMC-7721）的情况下，带正电的壳聚糖NP比带负电的NP被细胞吸收的程度更大，这可能是由阳离子/阴离子NP和带负电的CM之间的吸引力/排斥力引起的等人。¹²³研究了表面电荷范围从非常正（+37 mV）到非常负（−69 mV）的金纳米棒（18×40 nm）对HeLa细胞的吸收。他们的结果表明，在介质中所有检测的金浓度下，表面电荷分别为+37 mV和−69 mV的纳米棒吸收率最高和最低(即10、20、50和150μM）。

胡恩等人。¹²⁴探讨了表面电荷如何通过改变NP周围的蛋白质电晕间接影响细胞与NP的相互作用。带正电的NP进入不同的细胞系(即。，3T3成纤维细胞和小鼠C17.2神经前体细胞/NPC和人脐静脉内皮细胞/HUVEC）多于带负电荷的NP，无论是否有蛋白质电晕。此外，与人血清白蛋白（HSA）接触的负电荷和正电荷Au NP（水动力半径分别约为7.9和5.1 nm）具有相同的蛋白质电晕；即。，每个NP吸附的HSA分子数量不受电荷差异的显著影响。介质中蛋白质的存在降低了阳离子和阴离子NP的吸收。然而，取决于表面电荷的吸收差异仍然很明显。作者对这一现象的推测是，特定的功能基团介导了不同种类的蛋白质在NP表面上的吸附，这些蛋白质具有潜在的不同取向。由于蛋白质电晕在NP表面形成并改变其表面性质，因此应在NP与细胞介质相互作用后对其表面电荷进行深入评估。^{17–20,125,126}许多研究人员使用无血清培养基来避免蛋白质与NP的相互作用。¹²⁷然而，最近的报告显示，蛋白质电晕甚至可以在无血清培养基中形成，主要是由于细胞分泌的蛋白质。¹²⁸

4.3疏水性的影响

疏水力和界面力在NP和CM之间的相互作用中起着重要作用。^91,129一些理论研究表明，NP的疏水性如何影响其与脂质双层的相互作用。使用基于计算机的分子动力学模拟方法，Li等人。¹³⁰表明疏水性NP在膜的疏水核中部附近具有热力学稳定性。此外，NP插入过程导致双层中脂质分子分布的变形和不均匀性(即。，疏水性不匹配），但不会导致膜泄漏。相反，半亲水性NP在能量上更倾向于吸附在双层表面，而不是进入核心，这可能导致膜包裹(即。，内吞作用）。

富勒烯是众所周知的有前途的疏水纳米材料。旺伊卡布特等人。¹³¹使用计算方法研究了富勒烯聚集体通过CM渗透的热力学和机理。他们的结果表明富勒烯簇可以很容易地穿透并嵌入脂质膜通过被动转运，类似于单个富勒烯的情况，但速度要慢得多。有趣的是，即使在高浓度下，他们也没有发现双层内形成稳定的簇或膜破裂。然而，富勒烯渗透可以通过改变CM的弹性特性来影响细胞功能。阿列克谢夫等人。¹³²理论上表明，Janus NPs表面亲水和疏水部分的相对分布影响脂质双层中预先存在的孔的稳定性。具体来说，Janus NP具有疏水部分，在两亲性膜中形成稳定的孔。柯蒂斯等.¹³³应用模拟方法可视化NP和双层膜之间的分子级相互作用。直径大于20º的亲水性NP被包裹，而直径为10º的NP嵌入双层表面并与脂质分子的亲水头部基团相互作用。对于直径为10–40º的疏水性NP，这些NP不进行包裹；相反，它们通过直接穿透膜将自己嵌入双层的内部疏水核心。¹³³

了解NP和模型CM之间的相互作用可以深入了解疏水性/亲水性NP对活细胞的潜在影响。哥帕拉基里什南语等人。¹³⁵据报道，疏水性量子点（5nm）与囊泡的脂质双层稳定结合并均匀分散在囊泡的脂质双层内/周围，形成脂质/QD杂化物。膜内QD的扩散特性也因膜状态（即排列或破坏的脂质双层）而改变。这些观察结果表明，这种混合囊泡可能是有希望的纳米容器，用于控制膜的渗透性，并用于将小分子输送到活细胞中。

Jing和Zhu¹³⁶据报道，使用吸附的疏水性聚苯乙烯NP在L-α-磷脂酰胆碱（α-PC）SLB上启动孔隙形成（脂质贫乏区域）发生在临界NP浓度以上，该浓度与NP大小无关。此外，他们的结果得出结论，从SLB拖曳脂质分子吸附并包裹在NP表面主要是疏水相互作用，这可以通过增加离子强度的静电相互作用屏蔽来增强。奥卢布莫等人。¹³⁷据报道，QD NP（2nm）在混合脂质/聚合物膜中的位置取决于疏水性、亲水性或两亲性表面性质。他们的发现表明，疏水性QDs NPs可以选择性地定位在混合脂质/聚合物膜的聚合物域中。相反，两亲性对应物在相分离的脂质/聚合物膜中没有显示出特定的定位。

李等人。¹³⁸报道了亲水性和疏水性配体（6nm）混合单层官能化的Au-NP自发掺入脂质体壁（~2.5nm厚），形成NP-脂质体复合物。事实上，疏水性和亲水性配体在Au-NP表面动态地重新分布，以响应与表面活性剂囊泡的相互作用，从而启动掺入(即。，NP簇上的疏水配体与双层的疏水核心相互作用，而亲水部分仍与水溶液相互作用）。

此外，疏水性可以改变NP周围的蛋白质电晕，这可能间接改变细胞与NP的相互作用。例如，Ge等人。¹³⁹表明血液蛋白质的吸附量和构象变化(例如。，牛纤维蛋白原、丙种球蛋白、牛血清白蛋白和转铁蛋白）与单壁碳纳米管（SWCNT）相互作用后，主要受蛋白质表面和内部疏水残基与SWCNT表面之间的疏水相互作用控制。然而，这些研究只使用了一种蛋白质；在真正的血液中，有各种各样的竞争蛋白质。因此，需要进一步研究NP疏水性对NP表面电晕成分的影响及其生物后果。此外，热响应NP的疏水性可由温度控制（在37°C时，颗粒是亲水的，但在40°C时是疏水的）。与生理温度相比，该方法用于在高温（40°C）下将热反应性NP的细胞摄取增加20倍(图8).^134,140

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图8

当温度低于外壳的热转变温度时，NP表现出亲水性链延伸聚合物（左侧），并且与高于其聚合物热转变温度的相同NP相比，进入细胞的可能性较小（右侧）。经参考文献允许复制。¹³⁴

7.1超分辨荧光显微镜

共焦激光扫描显微镜（CLSM）与更常见的外荧光方法有很大区别，这主要是因为它能够通过点扫描排除离焦物体。²⁰¹由于其景深较窄，人们不仅可以以高z（轴向）分辨率成像细胞关联和贩运，还可以获得用于确定亚细胞定位的串行光学截面，从而提高准确性。事实证明，当内体隔离限制治疗潜力时，该技术特别有用，例如在输送治疗性核酸时，如质粒DNA、小干扰RNA（siRNA）、信使RNA和单引导RNA（sgRNA）。²⁰²CLSM还可以阐明颗粒-蛋白质相互作用，其中共同定位可以提供有关细胞内贩运路线和结合伙伴的机械信息。斯特拉诺和同事们，²⁰³例如，利用单壁碳纳米管（SWNTs）的固有荧光和单粒子跟踪软件，通过CLSM监测细胞对SWNTs的摄取和排出，并将其作为长度的函数。他们发现，当考虑扩散相互作用时，SWNT的内吞作用在50 nm直径附近达到最大，并且SWNT的胞吐率随着尺寸的增加而减慢(表2). 读者可能会注意到，基于荧光、光学吸收/发射和折射指数的光谱方法也可用于量化纳米材料或药物的整体细胞摄取/流出（例如通过HPLC、，²⁰⁴原子吸收光谱：²⁰⁵ 表2).

虽然与外荧光方法相比，CLSM大大提高了横向（xy）和轴向（z）分辨率，但最近开发的超分辨率技术进一步提高了我们以更高的空间和时间分辨率区分NP贩运的能力²⁰⁶-特别是随机超分辨率方法，如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM）。这两种方法都是通过基于分子特定强度波动来区分发射器来重建荧光点源的位置；前者基于光漂白，后者基于开关状态切换。图10a图示了通过STORM成像获得的HeLa宫颈癌细胞内内化聚苯乙烯NP的横向分辨率改善。²⁰⁷与共焦和传统的宽场方法不同，STORM可以区分不同大小（300 v 80 nm直径）和功能（颜色）的NP，提供以前无法获得的关于聚集状态和位置的信息，以及以高通量分析格式执行多重分析的能力。

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图10

探索纳米颗粒的细胞相互作用

a）超分辨荧光显微镜（STORM）对HeLa宫颈癌细胞（质膜，绿色）中80nm聚苯乙烯纳米粒子（红色）的贩运与传统广域显微镜技术进行了比较。b）C57BL/6小鼠气管内给药后碳纳米管（CNT，左）与肺泡细胞（右）相互作用的透射电子显微镜（TEM）图像。c）冷冻切片人体皮肤中纹身墨水纳米颗粒的原子力显微镜（AFM）成像。在AFM高度（左）和振幅（右）图像中可以看到大（黑箭头）和小（白箭头）团块以及潜在的胶原纤维网络。d）聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）观察感染表达鞘糖脂受体CD169的细胞的HIV-mimetic 80-nm Au-NPs。细胞表面结合的颗粒弥散分布，而细胞内的纳米颗粒通过as-yet机制被隔离。e）小鼠巨噬细胞与内部50nm金纳米粒子探针的实时活细胞拉曼散射图像。检测到单个纳米颗粒的表面增强拉曼散射（SERS）（左），并报告了纳米颗粒感兴趣区域（右）的光谱特征。f）荧光、肽靶向和可蚀刻银纳米粒子处理的PPC-1前列腺癌细胞的流式细胞术。细胞荧光和侧散射都随着银纳米颗粒的肽靶向（R-）而增加，而随着细胞表面结合颗粒的蚀刻而减少。g）使用金纳米粒子表面标记成像的喉表皮细胞中呼吸道合胞病毒（RSV）运输和感染的实时暗场散射显微镜。h）人类白细胞的光声（PA）显微镜。显示染色质、细胞核和细胞质形态的复合图像（532 nm，绿色；600 nm，红色）。尽管未在此处使用，但纳米粒子通常用作强PA造影剂。i）与Au（左）和Ag（右）纳米粒子孵育的小鼠成纤维细胞（灰度）的激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）成像（热图）。经（a）允许复制²⁰⁷，（b）²⁰⁹，（c）²⁴³，（d）²¹⁴，（e）²¹⁷，（f）²²¹，（g）²²⁵，（h）²²⁸和（i）²³⁴版权所有（a）2016美国化学学会，（b）2014 Köbler等.，（c）2015年拨款等.，（d）2014自然出版集团，（e）2013自然出版集团等和（i）2012年美国化学学会。

7.2透射电子显微镜

透射电子显微镜（TEM）根据物体与准直电子束的相互作用来鉴别物体。²⁰⁸由于电子的德布罗意波长较小，TEM提供的分辨率优于基于光子的方法，通常为单原子量级。然而，尽管它功能强大，但也存在许多缺点：样本准备时间长、多路复用能力低、生物结构对比度低。由于TEM基本上依赖于透射，生物样品也必须用超微切片机切片（50–100 nm厚）。尽管存在挑战，该方法可以提供关于尺寸/位置、电子密度、原子周期性和元素组成的丰富信息。²⁰⁶科布勒等例如，使用TEM研究通过吸入摄入的碳纳米管（CNT）的可能生物相互作用(图10b).²⁰⁹在对C57BL/6小鼠进行气管内注射CNT溶液后，作者观察到肺泡细胞和组织-巨噬细胞内有显著的细胞表面标记和细胞内积聚。这些见解对于理解吸入CNT可能产生的长期后果非常重要，因为在吸入其他材料（如石棉）后，持续炎症会导致癌症发病。金纳米粒通常通过TEM成像，既可以作为与各种蛋白质偶联的内吞探针，也可以作为细胞和组织的免疫金标记。该方法已被应用于白细胞生物学研究，并有助于证明活化白细胞如何输送特定货物。^210,211

7.3原子力显微镜

原子力显微镜（AFM）提供了与基于电子的方法相当的横向分辨率，并使用压电驱动的扫描悬臂来测量扫描探针尖端（约10nm半径）和样品之间的相互作用，以高分辨率产生地形和机械信息。²¹²与通常需要真空条件的EM方法不同，AFM可以在水状态下进行，从而能够保持天然水合作用和生物结构。虽然这项技术用途广泛，但其识别能力往往较差，标记/多路复用方法目前尚未广泛使用。图10c展示了AFM可以提供的独特结构信息。在这里，纹身墨水NP直接从冷冻切片的人类皮肤上成像。墨水NP和团聚体分布在真皮和周围胶原基质中，不仅显示了这些NP的空间分布，还显示了其周围环境的生物力学特性。

7.4扫描电子显微镜

扫描电子显微镜（SEM）基于对从样品表面发射的二次电子或从其表面/次表面反向散射电子的检测，绘制电子束与样品的相互作用图。²¹³SEM提供了1.0nm量级的横向分辨率，并且还可以提供在标记实验中有用的元素信息。因为透射比不像TEM那样需要，所以SEM可以成像毫米级厚度的组织。通过集成聚焦离子束（FIB）表面铣削，生物组织也可以在连续切片中成像，从而提供精确的层析信息。于等例如，使用FIB-SEM研究CD169受体介导的HIV病毒样颗粒（VLPs，图10d).²¹⁴由于CD169的细胞质尾部缺乏任何已知的内吞基序，因此受体介导的HIV-1摄取和随后的贩运尚不完全清楚。FIB-SEM成像显示，细胞表面结合颗粒弥散扩散，而细胞内NP似乎隔离在囊泡中，表明存在促进摄取/运输的膜相关辅因子。

7.5光散射显微镜

弹性和非弹性光散射显微镜可以提供有关生物样品内局部化学环境的大量信息。^215,216前者可以区分光谱吸收/散射以及取向（例如，偏振光显微镜中的胶原纤维取向），而后者在提供有关固态和分子振动的信息方面特别独特。帕隆蓬等表明可以使用活性细胞拉曼显微镜实时绘制分子振动图(图10e).²¹⁷使用50-nm Au-NP作为表面增强拉曼散射²¹⁸（SERS）探针，可在小鼠巨噬细胞中追踪单个NP。作者证明了外源（炔烃）DNA标签的检测，并能够以共焦横向和轴向分辨率跟踪NP的轨迹和周围的化学环境。

7.6流式细胞术

流式细胞术测量悬浮细胞的多色光散射和荧光（或阻抗），方法是通过流体通道聚焦细胞，在流体通道中细胞只能以“单列”流动。²¹⁹还可以实时执行含细胞液柱的分割和静电偏转（即流动自动细胞分选，FACS），以根据细胞的光学或电学特性对其进行物理分选。流式细胞术（分析和分类）可以对活细胞和固定细胞进行，并常规适应10色多路复用（带光谱补偿）和每秒数千个细胞的测量速率。统计上稳健的染色强度值和分布可以从高通量的异质细胞群中确定，²²⁰而空间分布模式和相互作用伙伴也可以使用Förster共振能量转移（FRET）技术进行评估。Ruoslahti及其同事最近利用流式细胞术，利用细胞膜不渗透的化学蚀刻剂对表面结合颗粒进行“脱固”，以区分细胞表面结合和配体靶向银纳米粒的内化(图10f).²²¹作者发现，约60%的肽靶向颗粒在1小时内被内化在体外而非目标NP的可比浓度仅内化约1%。该技术还能够识别肿瘤特异性细胞内NP递送体内.

7.7暗场显微镜

暗场照明可以使用散射光而不是透射光进行成像。²²²这种方法在成像折射率与周围物体（例如细胞）折射率相似的半透明物体时特别有用，并使用光束挡块（通常是“蜘蛛挡块”）来阻挡以低角度撞击样品的锥形光束的中心。因此，在黑色背景上只能看到高度散射的对象。在许多情况下，这种技术比荧光显微镜更灵敏，通常用于追踪活细胞中的等离子体核及其探针。^223,224 图10g证明了该技术在使用病毒表面标记的Au-NP监测喉表皮细胞中呼吸道合胞病毒（RSV）感染的实用性。²²⁵作者追踪了RSV细胞动力学，并证明13-nm Au-NPs探针可以用作非干涉、非光漂白的暗场成像探针。

7.8光声显微镜

光声成像（PA）利用激光诱导的热弹性膨胀，根据随后超声发射的变化绘制细胞和组织图。²²⁶该方法通常使用非电离激光脉冲，该非电离激光脉冲在物体或造影剂的光吸收、热产生和局部体积膨胀之后将光能转换为声音。该技术最常用于对组织和血管进行宏观成像，但最近被用于检测循环肿瘤细胞。²²⁷Strohm最近证明PA成像也可以用于高分辨率成像单个未染色细胞(图10h).²²⁸作者使用双色激发对淋巴细胞进行PA成像，分辨率为微米级。因为无机纳米颗粒通常是高效的光热对比剂^229,230PA成像是一种新兴的分析方法，可有效区分探针标记细胞，并在微观和宏观尺度上检查纳米材料的贩运。

7.9表面增强拉曼散射（SERS）

金、银和铂等贵金属的纳米颗粒可以作为拉曼传感的优秀探针(图10e). 使用这些NP的拉曼标记可将信号增强约12个数量级，标记的稳定性更高（与荧光染料相比），生物环境中的信噪比也更高。²³¹一个研究小组调查了Au-NP在光谱特征和信号强度方面用于探测细胞超结构和各种亚细胞环境的用途。²¹⁶

另一项研究使用SERS标签通过创建强度图来成像表皮生长因子受体（EGFR）的分布。孔雀石绿信号被30–40nm大小的球形Au NP增强，并用EGFR抗体进行功能化；绘制的地图与Au-NP和EGFR的预期分布一致。²³²

7.10激光烧蚀ICP-MS

电感耦合等离子体质谱法用于检测低至万亿分之一的痕量金属浓度。样品通过雾化引入，并在极高温度下转化为等离子体。当结合激光烧蚀时，这种方法可以通过银纳米粒子的定量和空间分布达到更低的检测限。LA-ICP-MS能够研究银NP在细胞内的摄取和定位，如图10f.^233,234

7.11相关显微镜

相关显微镜是两种或多种显微镜技术的结合，用于分析同一样品(图11).²³⁵相关显微镜的目的是利用光学显微镜、电子显微镜、原子力显微镜和超分辨显微镜等个别技术的优势，获得关于样品的更深入信息。例如，相关显微术中的超分辨率显微术可以克服光学显微术的传统局限性，即在300 nm以下分辨率较差。因此，相关显微镜技术可能会在纳米医学领域创造令人兴奋的新机会，尤其是在细胞内贩运纳米颗粒方面。有关相关显微镜及其挑战和机遇的更深入信息，请参阅我们最近的综述文件。²³⁵

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图11

展示相关显微镜中最重要技术的使用方案。该图片经美国化学学会许可复制。²³⁵

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）CA151884（O.C.F.）和EB015419（O.C.F.）拨款的支持。