肾胱氨酸与Pyk2，p130相互作用^卡斯和紧张素并触发Pyk2的磷酸化

摘要

青少年肾病（肾病1型，NPH1）属于一组遗传性常染色体隐性遗传后的异质性肾囊性疾病传输方式（参见参考文献。1). 三个不同的基因位点已映射，NPHP1型（少年形态），NPHP2核电站（婴儿型），以及NPHP3核电站（青春期），不同在终末期肾病的发病中。此外，NPH1可以是与肾外表现相关（眼球运动失用症，视网膜色素变性、视神经缺损、小脑蚓部再生障碍、肝纤维化、锥形骨骺）（参考文献综述。2).最近，NPHP1型，在幼年时发生突变的基因肾结核，已被确认(三,4). NPH1账户大多数终末期肾衰竭发生在儿童和年轻人中。这个该病的最初症状相对较轻，包括肾功能减退导致的多尿和多饮浓缩尿液。后来出现严重贫血、生长迟缓和中位年龄为13岁的终末期肾功能衰竭描述疾病的特征。组织学改变包括肾小管基底膜破裂，间质细胞浸润，管状皮质-延髓交界处萎缩和囊肿形成(2,5).肾小球不受直接影响；然而，肾小球周围纤维化在疾病的早期阶段是明显的。

NPHP1型肾胱氨酸的编码，一种含有732个氨基酸的蛋白质残基和83kDa的预测分子量(三,4). 它包含N端线圈结构和Src同源3（SH3）结构域它的两侧是两个高电荷域。最近crk相关底物p130^卡斯被发现为酵母双杂交中与肾胱氨酸SH3结构域的相互作用使用p130的屏幕^卡斯或肾胱氨酸作为诱饵(1,6). 因为p130^卡斯是必不可少的局灶性粘连的组成部分，推测肾胱氨酸调节细胞基质粘附的组装。这个假设是肾胱氨酸似乎与E-cadherin在细胞-细胞接触的粘附连接处共定位Madin–Darby犬肾细胞(6). 焦点粘连是由β的聚类₁-和α_v（v）-包含整合素通过与细胞外基质的相互作用与局部粘连相关的细胞内蛋白，包括张力蛋白、塔利班、维酮、α-肌动蛋白、帕西林、酵素、维酮酶、FAP52、，nexilin、Src激酶、黏着斑激酶、蛋白激酶C和钙蛋白酶II(7,8). 特定组件的定向中断焦点粘附复合物导致的缺陷与人类肾结石的特征。例如，老鼠缺乏张力蛋白会形成多个囊肿，小鼠随后死亡来自肾衰竭(9). 此外，肾脏组织学显示典型的NPH三联体伴肾小管膜破裂、肾小管扩张，和间质炎症。小鼠缺乏α_三β₁，一种整合素主要表达于足细胞，形成严重的肾小球但也显示近端小管的囊性改变(10). 最后，缺乏GDIα的小鼠，GDIα是小GTPase Rho，出现明显蛋白尿和变性肾小管上皮细胞(11). 这些发现表明细胞基质粘附复合体的异常可能导致肾小管基底部异常的发展囊肿。

我们现在证明肾胱氨酸形成蛋白质复合物，包含p130^卡斯富含紧张素和脯氨酸酪氨酸激酶2（Pyk2）。肾胱氨酸触发Pyk2的酪氨酸（402）和随后激活的有丝分裂原蛋白激酶。我们的研究结果表明，肾胱氨酸是某些肾小管上皮细胞中的Pyk2依赖性信号。

材料和方法

结果

肾胱氨酸与小鼠胚胎肾脏中的Pyk2相互作用。

据报道，肾胱氨酸与局部粘连相互作用蛋白p130^卡斯(6). 因为目标几种黏附蛋白的破坏导致肾小管基底异常和肾囊肿形成（参考文献综述。1)，我们测试了其他焦点粘附分子是否与肾胱氨酸。用标记的肾胱氨酸免疫沉淀Pyk2和肾胱氨酸缺失结构（图。​（图11A类)包含SH3的结构域（氨基酸155-211），而Pyk2没有相互作用缺乏前205个氨基酸的肾胱氨酸缺失（图。​（图11B). Pyk2和沉淀物中肾胱氨酸的检测（图。​（图11C)为Pyk2和肾胱氨酸。测试此交互是否发生在里面活泼地，我们检查了内源性胚胎组织中的蛋白质。使用MBP-肾胱氨酸融合蛋白含有前209个氨基酸的人类肾胱氨酸，我们产生了特异性识别重组人的兔抗血清GST-肾胱氨酸，但不是另外两种控制性GST-融合蛋白（图。​（图22A类). 一种GST-肾胱氨酸琼脂糖柱用于亲和纯化肾胱氨酸特异性抗血清。蛋白质印迹表明，这种抗血清检测到表达任一全长的HEK 293T细胞中的单一蛋白肾胱氨酸或截短型肾胱胺酸F.NPHP1（1–481），含有第一个481 aa的肾胱氨酸（图。​（图22B). 相反，肾胱氨酸缺失结构F.NPHP1（206–732）缺少前205 aa，未被抗血清。人和小鼠肾胱氨酸的同源性为83%(13). 收件人测试胚胎组织中是否能检测到小鼠肾胱氨酸，小鼠胚胎肾脏和睾丸被溶解蛋白质在10%SDS/PAGE上分离。蛋白质印迹分析发现抗血清在预测的小鼠组织中的大小（图。​（图22 C和D类). 使用这种抗血清，我们检测了内源性肾胱氨酸与内源性Pyk2相互作用。胚胎小鼠肾脏和睾丸在裂解缓冲液中进行裂解，并以100000×克去除不溶性物质。肾胱氨酸是用亲和纯化法从上清液中沉淀抗血清与蛋白A Sepharose结合。如所示图。​图22E类，Pyk2与肾胱氨酸在胚胎肾和胚胎睾丸。与Pyk2相比，在肾胱氨酸和HEK 293T细胞中黏着斑激酶FAK的过度表达蛋白质；在天然组织（数据未显示）。

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图1

肾胱氨酸与Pyk2相互作用。(A类)几个生成标记的肾胱氨酸截短片段，以分析与Pyk2的交互。肾胱氨酸含有几个假定的蛋白质-蛋白质相互作用基序，包括氨基末端线圈域（coil）和SH3域。(B)肾胱氨酸沉淀Pyk2。HA-taged Pyk2和Flag-taged肾胱氨酸结构物在HEK 293T细胞中表达用特异性抗体沉淀。Western blot分析为用HA特异性抗血清进行(顶部和中部). Pyk2与肾胱氨酸共沉淀，但不含有对照蛋白RGS3(顶部). 互动需要肾胱氨酸的N末端区域，包含SH3域。(中部)HA的表达水平。图中显示了Pyk2。(底部)标记的RGS3和显示了细胞裂解物中的肾胱氨酸结构。(C)Pyk2沉淀肾胱氨酸，但不沉淀对照蛋白GFP(左侧 上部); Pyk2沉淀是显示(左侧 下部).(赖特)标记的肾胱氨酸和显示了细胞裂解物中的HA标记的Pyk2。

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图2

内源性肾胱氨酸与Pyk2的相互作用。(A类和B)生成肾胱氨酸特异性抗血清，用a重组MBP融合蛋白，包含氨基酸末端209 aa肾胱氨酸。特异识别的亲和纯化抗血清融合GST的重组肾胱氨酸和HEK中表达的肾胱胺酸293T细胞，但未能结合重组控制蛋白或肾胱氨酸版本缺少用于免疫的区域。(C和D类)抗血清识别小鼠内源性组织中的肾胱氨酸。测试鼠标是否肾胱氨酸可在胚胎组织、小鼠胚胎中检测到肾脏和睾丸在不同发育阶段被溶解可溶性蛋白在10%SDS/PAGE上分离。西部免疫印迹分析表明，该抗血清能抗人肾胱氨酸检测小鼠肾胱氨酸。(E类)肾胱氨酸与胚胎组织中的Pyk2相互作用。肾胱氨酸用抗血清检测内源性相互作用在胚胎小鼠肾脏和睾丸中的Pyk2和肾胱氨酸之间。胚胎肾脏(赖特)和胚胎睾丸(左侧)收集并均质。裂解物是用对照抗血清或肾胱氨酸特异性抗血清。进行Western blot分析使用Pyk2特异性抗血清。

与肾胱氨酸的相互作用影响亚细胞定位Pyk2的。IMCD细胞，一种从IMCD衍生的小鼠细胞系，表达内源性Pyk2，但缺乏肾胱氨酸。我们生成了一个逆转录病毒在这些细胞中表达肾胱氨酸。因为比90%的IMCD细胞在随后的三个阶段表达肾胱氨酸感染，实验在没有进一步克隆的情况下进行选择。如图所示。​图3三A类，的表达式IMCD细胞中的肾胱氨酸导致膜相关Pyk2（P100分数）与细胞溶质Pyk2减少（S100分数）。

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图3

Pyk2的亚细胞定位及其相互作用肾胱氨酸和Pyk2富含脯氨酸（PR）的区域。(A类)肾胱氨酸调节亚细胞定位Pyk2的。肾小管上皮细胞系IMCD感染了逆转录病毒，指导肾胱氨酸的表达或对照逆转录病毒。肾胱氨酸增加膜相关部分（P100）和降低Pyk2的细胞质分数（S100）。(B)GST和GST。Pyk2 PR固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠，与MBP孵育。NPHP1（1）。NPHP1与GST结合。Pyk2-PR，但不适用于GST。(C)PRNK的共免疫沉淀，一种天然存在的剪接变异体Pyk2，带有全长肾胱氨酸（NPHP1 WT）或C末端截断版本[NPHP1（1）]。(上部)突变Pyk2中的脯氨酸残基859消除了与肾胱氨酸。(下部)野生型和图中显示了突变的PRNK。

因为肾胱氨酸通过其SH3结构域与第130页^卡斯(6)，而SH3域第130页^卡斯可以与Pyk2交互(14)，是的可以想象，肾胱氨酸和Pyk2之间的相互作用是由p130介导^卡斯.证明SH3肾胱氨酸结构域直接与重组Pyk2相互作用MBP肾胱氨酸1–209固定在直链淀粉珠上并孵育GST融合蛋白含有Pyk2（氨基酸669–949）。如图所示。​图3三B,GST-肾胱氨酸保留了Pyk2，证实了肾胱氨酸和Pyk2是直接的，不需要中间物例如p130^卡斯.Pyk2相关非激酶（PRNK）是Pyk2的天然剪接变体，代表只有Pyk2的C末端区域(15). 鉴于HA-标记的PRNK与野生型肾胱氨酸或含有SH3的物质相互作用肾胱氨酸截断（氨基酸1–209），脯氨酸PRNK的859-丙氨酸突变完全消除了这种相互作用，表明脯氨酸对肾胱氨酸和Pyk2（图。​（图3三C).

肾胱氨酸触发Pyk2酪氨酸402的磷酸化。

为了测试肾胱氨酸的存在是否改变Pyk2是一种特异识别酪氨酸的抗血清（402）-磷酸化形式的Pyk2。如图所示。​图44A类，任一表达式肾胱氨酸或v-src触发酪氨酸磷酸化（402）Pyk2的。相反，CD2AP是另一种含有SH3的适配器分子，或载体控制对Pyk2的酪氨酸（402）。在几个独立的实验中(n个>3），肾胱氨酸的表达触发可明确检测到的Pyk2酪氨酸402磷酸化使用pY（402）特异性抗血清（图。​（图44B). 无酪氨酸在感染的IMCD细胞中检测到Pyk2的（402）磷酸化带有一种逆转录病毒，该逆转录病毒可引导控制蛋白的表达，GFP（图。​（图44B). 有趣的是，全长肾囊肿是需要触发Pyk2的酪氨酸（402）磷酸化。作为如图所示。​图44C，N端的截断或肾胱氨酸的C末端结构域取消了肾胱氨酸触发Pyk2磷酸化。磷酸化Pyk2的酪氨酸（402）触发Src家族激酶的募集以及与其他适配器和效应分子的相互作用（在参考文献。16和17). 我们发现IMCD细胞中丝裂原活化蛋白激酶ERK1和ERK2表达肾胱氨酸，但在表达对照蛋白GFP（图。​（图44D类).

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图4

肾胱氨酸触发Pyk2酪氨酸402的磷酸化。(A类)用HA标记的Pyk2转染HEK 293T细胞结合载体控制、肾胱氨酸、SH3含有结构域的适配器蛋白CD2AP，或阳性对照v-Src。哈。Pyk2是用抗HA抗体从血清饥饿的细胞中免疫沉淀出来的抗体；用抗血清检测沉淀物Pyk2的磷酸酪氨酸402(顶部)或者用抗血清揭示了Pyk2的总量(中部).(底部)HA的表达。裂解液中的Pyk2。(B)Pyk2在酪氨酸402上磷酸化表达肾胱氨酸的IMCD细胞。IMCD细胞被感染对照组或表达肾胱氨酸的逆转录病毒。肾胱氨酸诱导内源性Pyk2的酪氨酸402磷酸化IMCD单元(上部)但不影响表达Pyk2的级别(下部). (C)全长肾胱氨酸需要触发酪氨酸402的磷酸化表达肾胱氨酸截短的逆转录病毒载体用于感染IMCD细胞。氨基末端缺失[NPHP1（206）]和羧基末端缺失[NPHP1（1） ]肾胱氨酸未能介导酪氨酸402Pyk2的磷酸化(上部). (下部)显示了Pyk2表达式的级别。(D类)肾胱氨酸激活ERK1/2。双磷酸化ERK1和ERK2在IMCD细胞中可见，用控制载体或用磷酸特异性编码肾胱氨酸的逆转录病毒载体抗血清(上部). 斑点被用检测ERK1和ERK2总量的抗血清肾胱氨酸特异性抗血清。

第130页^卡斯和Tensin出现在含肾胱氨酸的免疫沉淀物。

最近，发现肾胱氨酸和第130页^卡斯利用酵母双杂交系统(6).这一发现促使我们研究肾胱氨酸是否与第130页^卡斯在内源性组织中。作为如图所示。​图5，5,第130页^卡斯存在于免疫复合物中用抗肾胱氨酸抗血清固定胚胎肾和胚胎睾丸。在HEK 293T细胞中，野生型肾胱氨酸以及N末端肾胱氨酸结构（氨基酸1-481）沉淀约220 kDa的酪氨酸磷酸化蛋白，未检测到C末端肾胱氨酸结构沉淀后（图。​（图5）。5).因为有针对性地破坏了张力蛋白，一种220-kDa磷酸蛋白，导致与人类非常相似的表型肾结石(9)，我们测试了张力蛋白是否与小鼠胚胎肾脏内源性肾胱氨酸。使用张力蛋白特异性抗血清，在含有肾胱氨酸的免疫沉淀物。需要进一步研究阐明张力蛋白的共免疫沉淀是否由与肾囊肿直接相互作用。

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图5

肾胱氨酸与p130结合^卡斯和张力。(A类)为了鉴定肾胱氨酸相互作用蛋白，HEK将对照蛋白GFP、肾胱氨酸、，或肾胱氨酸截短NPHP1（1）。之后肾胱氨酸的免疫沉淀，分离出免疫沉淀在10%SDS/PAGE上，用单克隆抗体染色抗磷酸酪氨酸抗体4G10(左上)，或抗旗帜抗体(左下). A类酪氨酸磷酸化蛋白，分子量约为肾胱氨酸沉淀物中检测到220kDa（pp220）。标记的GFP和肾胱氨酸截短物的表达水平证明了裂解产物(赖特). HEK 293T细胞缺乏内源性Pyk2，因此Pyk1不是在4G10-标记的沉淀物中可检测到。(B)张力蛋白和p130的共沉淀^卡斯使用本机胚胎组织中的肾胱氨酸。胚胎肾脏(上部)和胚胎睾丸(下部)是收集并均质。用免疫沉淀法对裂解产物进行沉淀对照或肾胱氨酸特异性抗血清，分离10%SDS/PAGE。Tensin和p130^卡斯在中检测到使用张力蛋白或第130页^卡斯-特异性抗体。

讨论

肾胱氨酸纯合子突变导致I型肾病（参考文献中审查。1). 这种疾病的特点是青春期肾髓质囊肿和肾衰竭出现多饮和多尿。组织学变化具有特征性管状基底增厚、碎裂和破裂肾小管膜伴进行性萎缩上皮细胞(2,5,18). 因为基底膜异常似乎发生在囊肿形成之前假设管状基底膜的改变是引起观察到的表型变化的主要缺陷肾病综合征。肾胱氨酸如何影响肾小管的完整性基底膜目前尚不清楚。线圈的存在结合SH3结构域的结构表明该分子作为一种衔接蛋白发挥作用。最近描述的肾胱氨酸与局灶粘附蛋白第130页^卡斯及其与焦点的共定位极化上皮细胞的粘附表明肾胱氨酸在肾小管上皮局灶性粘附信号中起作用单元格(6). 现在我们证明肾胱氨酸与Pyk2与p130形成蛋白质复合物^卡斯,Pyk2和胚胎肾脏和睾丸中的张力蛋白。

非受体酪氨酸激酶Pyk2被刺激物激活提高细胞内钙²⁺水平或啮合β₁整合素。Src家族激酶与Pyk2在酪氨酸402和介导丝裂原活化蛋白激酶的活化（综述参考文献。16和17). Pyk2与黏着斑激酶FAK共享肌动蛋白丝完整性对其功能的依赖性以及与p130相互作用的能力^卡斯.在许多组织，Pyk2主要不是局限于局部粘连，而是出现主要位于细胞质中(19). 因为肾胱氨酸是存在于细胞膜和细胞溶质室中（图。​（图3三A类)，可以想象肾胱氨酸起到穿梭器的作用介导Pyk2从细胞质向细胞移位的蛋白质基质粘连，在这里它被激活以响应细胞外信号。酪氨酸402上磷酸化的Pyk2可以招募Src激酶激活有丝分裂原激活蛋白激酶的家族成员。的确，我们发现IMCD细胞中激活的ERK1和ERK2水平升高表达肾胱氨酸（图。​（图44D类).

第130页^卡斯是Pyk2底物，酪氨酸p130的磷酸化^卡斯由Pyk2推广Crk的绑定(14,20)，这反过来又可以刺激细胞迁移种族相关方式(21). 有趣的是，Pyk2并不有效重组细胞迁移对纤维连接蛋白的反应缺乏黏着斑激酶的成纤维细胞(22). Pyk2的无能有效刺激某些细胞类型的迁移与此无关粘着斑激酶和Pyk2之间的信号差异，但似乎是因为没有足够的Pyk2招募到联络人（参考文献中审查。16). 我们认为肾胱氨酸促进Pyk2在特异性细胞基质粘附中的招募细胞外信号。有趣的是α₅β₁整合素受体患者肾小管上皮细胞增加Ⅰ型肾结核(23). 通常，α₅β₁整合素从病灶转移接触，重组细胞外纤维连接蛋白分子基质，并沿肌动蛋白丝束形成纤维粘连(24,25). 这些纤维粘连含有高水平的张力蛋白和促进细胞流动，但含有低水平的帕西林、维库林、，和酪氨酸磷酸化蛋白。Tensin是纤维粘连和一种主要的张力素阴性抑制剂阻止这种细胞外基质接触的形成(25).纤维粘连的形成可能在紧张素缺乏小鼠，可能有助于这些动物的囊性肾病(9). 因为紧张素和肾胱氨酸似乎参与了一个共同的信号通路很容易推测肾小管上皮细胞可能会丢失重组纤维连接蛋白和形成纤维粘连的能力在不存在紧张素或肾胱氨酸的情况下。总之，我们的结果表明肾胱氨酸p130^卡斯,Pyk2和张力蛋白参与一个共同的信号通路，可能是特定类型的电池矩阵触点需要管状上皮细胞。

致谢

缩写

脚注

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