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公共科学图书馆一号。2017; 12（7）：e0181103。
2017年7月10日在线发布。 数字对象标识：10.1371/新闻稿.0181103
预防性维修识别码：PMC5507319
PMID：28700660

选择性癌症、单剂化学放射增敏金纳米粒子

索菲·格雷莱,概念化,形式化分析,调查,方法,写作——原稿,写作–审查和编辑,1 康斯坦蒂娜·泽莱皮,调查,写作–审查和编辑,1 梅克·罗斯坎普,监督,写作–审查和编辑,2 菲尔·威廉斯博士,形式化分析,调查,监督,写作–审查和编辑,2 阿奎拉·谢里夫,资源,写作–审查和编辑,三 理查德·斯莱德-卡特,资源,写作–审查和编辑,三 彼得·戈迪,资源,写作–审查和编辑,4 尼基·沃尔德,资源,写作–审查和编辑,4 马·戈扎塔·米亚·埃克,监督,写作–审查和编辑,5,6 奈杰尔·梅森,资金获取,监督,写作–审查和编辑,6和乔恩·P·戈尔丁,概念化,形式化分析,调查,方法,监督,验证,写作——原稿,写作–审查和编辑1,*
王英扬，编辑器
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摘要

合成了两个纳米金纳米粒子（AuNP），它们含有糖基和/或巯基-聚乙二醇胺（PEG-胺），并对其进行了评估在体外使用四种代表正常和癌变皮肤和乳腺组织的细胞系，用220 kV和6 MV X射线对细胞进行放射增敏的毒性和能力。细胞急性暴露于AuNPs 3小时，仅含PEG-胺或α-半乳糖衍生物和PEG-胺类的比例为50:50，导致在前所未有的低纳米浓度下对癌细胞的选择性摄取和毒性。联合服用N-乙酰半胱氨酸抗氧化剂可以防止化学毒性，或者半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK可以部分防止化学毒性。除了其固有的癌症选择性化学毒性外，这些AuNP还与220 kV或6 MV X射线一起作为放射增敏剂。携带简单配体的AuNP在低浓度下作为癌症选择性化学放射增敏剂的能力是一项新发现，在开发低成本癌症纳米治疗药物方面具有巨大的前景。

介绍

目前约有一半的癌症治疗采用放射疗法。虽然通常有效，但它对周围的健康组织有害，需要通过更好地靶向癌细胞来加以改善。一种很有前途的方法是使用由高原子序数元素组成的纳米颗粒，例如金、铪、钆、铂或铁，这些元素具有较大的X射线光子捕获截面，因此可以通过纳米颗粒的二次电子发射在纳米颗粒附近局部增加能量沉积[1–三]. 由于金纳米粒子（AuNP）的生物相容性和对肿瘤靶向表面修饰的适应性，金纳米粒子主要用于肿瘤放射增敏研究[4–6]. 使用千伏X射线光子时，使用外部束源的AuNP放射增敏更有效[7]与兆电压X射线光子相比[4,8–10]，尽管由于其更深的组织穿透性，因此兆伏是优选的。

AuNP的毒性取决于其配体外壳，但一般来说，它们是无毒的，除非在高浓度下，它们会产生可观水平的活性氧（ROS）[11,12]. 水动力直径小于6纳米的AuNP更适合用于治疗，因为它们可以通过肾脏清除从体内排出，减少长期接触其他器官[13,14].

化学放射增敏剂是一种双作用药物，对细胞有直接毒性，也使DNA更容易受到辐射损伤。它们包括拓扑异构酶I、聚ADP核糖聚合酶（PARP）、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和热休克蛋白90（Hsp90）的抑制剂[15]. 然而，目前的化学放射增敏剂缺乏局部增加细胞内辐射沉积剂量的能力。考虑到这一目标，我们设计了新型的2纳米金核纳米粒子，用糖配体包覆以提高水溶性[16]和PEG-胺改善生物相容性[17]和细胞摄取[18]. 尽管最初设想将这些新型AuNP作为放射增敏平台，用于联合输送抗癌药物，但研究人员发现，这些新型Aunp在纳米摩尔浓度下对癌细胞具有选择性毒性，还可作为放射增感剂。

材料和方法

纳米粒子合成

Midatech Ltd（英国阿宾顿）以不同的HS-C输入比制备了平均金芯直径为2 nm的金纳米粒子（AuNP）2-糖（α-半乳糖衍生物、β-葡萄糖衍生物或N-乙酰氨基葡萄糖衍生物）和1-氨基-6-巯基-六乙二醇（PEG-胺），如前所述[19]. 从BBI Solutions（英国加的夫）购买了平均直径为2 nm的胶体柠檬酸包AuNP，使用时无需进一步修改。所有AuNP浓度均以Au含量为基础进行报价。

纳米粒子物理特性

透射电子显微镜（TEM）

使用JEM-1400显微镜（美国JEOL），在80 kV加速电压和x200000倍放大率下，通过静电放电碳网格上的TEM成像对纳米颗粒进行表征。使用ImageJ软件从阈值TEM图像测量纳米粒子尺寸。

Zeta电位

使用Zetazer（Nano ZSP，Malvern仪器，使用DTS1070电池）在pH 7.4的3.2%PBS中测量纳米粒子（500μg/ml）的电荷。

动态光散射

使用Zetazer（Nano ZSP，Malvern Instruments，使用DTS1070细胞）在水中测量纳米粒子的流体动力学尺寸（100–400μg/ml）。

1核磁共振氢谱

使用10 mg Au和3倍摩尔过量配体合成了三批具有不同α-Gal和PEG-胺输入比例（25:75、50:50、75:25）的纳米粒子。

在10 kDa截止超滤柱（Amicon）上浓缩4 mg AuNP，然后用2 ml D冲洗3次2O.然后将AuNP样品转移到小瓶中，并重新悬浮在400μl D中2O含有0.3 M KCN和0.1 M KOH，在37.5°C下培养过夜。然后在13000 x克1分钟，由1500 MHz下的H-NMR（Avance III HD，Bruker），使用MestRNova软件。α-Gal和PEG-胺配体的定义质子分别在4.95 ppm和2.75 ppm共振，这些对应于α-半乳糖的单异聚质子（NMR双峰）和两个CH2靠近NH末端的质子2PEG-胺连接剂中的键（NMR三联体）。

细胞培养

使用了四种细胞系，分别代表正常皮肤细胞和癌皮肤细胞（HaCaT和HSC-3）以及正常和癌乳腺细胞（MCF-10和MCF-7）。HaCaT细胞是鹿特丹伊拉斯谟医学中心埃里克·沃尔比姆赠送的礼物。MCF-7细胞是伦敦大学学院Marilena Loizidou赠送的礼物。MCF-10细胞是贝尔法斯特皇后大学Kevin Prise赠送的礼物。HSC-3细胞购自美国型培养物收藏中心。

HSC-3、HaCaT和MCF-7细胞在低血糖DMEM中生长，并添加10%FCS和1%青霉素/链霉素。MCF-10细胞在不含酚红的DMEM/F12中生长，补充有：5%马血清、2.5 mM L-谷氨酰胺、15 mM HEPES、1 ng/ml霍乱毒素、10μg/ml胰岛素、50μM氢化可的松、100μM EGF和1%pen/strep。所有细胞均保存在T-75培养瓶中，并在80%的汇合处传代。

克隆形成试验

通过克隆形成试验测定细胞增殖和存活率。将细胞以每孔300-2000的速度接种在24孔培养板中，并使其粘附24小时。将纳米颗粒加入培养基中1、3、6或24小时，然后用培养基冲洗一次。细胞培养6天，每2-3天更换一次培养基。然后用50%乙醇中的10 mg/ml亚甲基蓝清洗细胞并染色。对含有50个或更多细胞的菌落进行计数，并以未经处理的对照组的百分比表示菌落形成。在一些实验中，将HSC-3和HaCaT细胞（3600个细胞/ml）在15ml Falcon管中的悬浮培养中加载AuNPs 3小时，每30分钟重悬一次细胞。然后通过离心洗涤细胞两次，并以每孔300个细胞的速度接种，以进行克隆测定，如所述。IC50是指与未经处理的对照组相比，AuNP浓度导致细胞集落数量减少50%。使用GraphPad Prism 6.0，根据AuNP浓度对数与细胞集落百分比的曲线图计算IC50值。

细胞摄取

通过TEM亚细胞定位和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量评估AuNPs的细胞摄取。

透射电子显微镜（TEM）

将HSC-3和HaCaT细胞接种在12孔跨孔插入物上过夜，然后用10μg/ml AuNP孵育3 h。该AuNP浓度是在初始实验中选择的，因为它是使用银染色增强试剂盒（R-Gent，Aurion）在固定细胞中对AuNP进行良好光学显微镜染色的最低浓度。然后固定细胞并增强银染AuNP，并根据Gromnicova进行TEM处理等[20]. 使用JEM-1400显微镜分析超薄切片，加速电压为80 kV，放大倍数为x2500和x20000。

电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）

将HSC-3和HaCaT细胞（500000/ml）与AuNP在悬浮培养中以HSC-3 IC50浓度孵育3 h，轻轻摇晃每30分钟重新培养细胞。然后用5 ml培养基通过离心法清洗细胞两次，并用血细胞仪测量细胞密度。将细胞颗粒溶解在2.5 ml 3%四甲基氢氧化铵和0.2%Triton X-100中。然后，在ICP-MS分析之前，添加2.5 ml 1%HCl（以铱为内标）。根据0.1至100 ng/ml金的校准曲线计算金量，包括空白（零）点。使用Perkin-Elmer NexION 300X ICP-MS和NexION-ICP-MS软件1.4版进行金测定。

抗氧化细胞保护试验

以每孔300个细胞的粘附HSC-3细胞与IC50浓度的AuNP孵育3小时，添加或不添加1 mM N-乙酰半胱氨酸或0.1 mM丙酮酸钠抗氧化剂。清洗细胞，添加新鲜培养基，添加或不添加抗氧化剂。24小时后，更换不含抗氧化剂的培养基，并让细胞继续生长5天。对细胞集落进行计数，并以未处理对照的百分比表示。

半胱氨酸蛋白酶抑制

以300个细胞/孔接种HSC-3和HaCaT细胞进行克隆形成分析。一些细胞用50μM Z-VAD-FMK半胱天冬酶抑制剂预培养1h。然后用1μg/ml AuNPs或10μM抗霉素A培养细胞3小时以诱导细胞凋亡。然后清洗细胞并让其生长6天。对细胞集落进行计数，并以未处理对照的百分比表示。

无细胞羟基自由基测定

通过香豆素-3-羧酸（3-CCA）羟基化为荧光7-羟基香豆素3-羧酸（7-OHCCA）来测定X射线诱导的羟自由基生成[21,22]. 在pH为9的25 mM硼酸盐缓冲液中制备5 mM 3-CCA储备溶液。在96-well 3K分子量截止超滤板（Acroprep Advance，Pall Corporation）中将50μl等分水或水中12μg/ml AuNP添加到50μl 3-CCA中。在GenesisCare，Milton Keynes，使用临床直线加速器（Versa HD，Elekta），以5 Gy/min的剂量率用6 MV X射线中的10 Gy射线照射钢板；或使用北安普敦医院的Xstrahl 200临床正压系统，以0.54 Gy/min的剂量率进行10 Gy的220 kV X射线。未对控制板进行辐照。然后，每个孔添加100μl乙醇以帮助7-OHCCA溶解度；将每个板放置在一个空的接收板上，并通过以1500倍离心收集不含纳米颗粒的滤液克用FluoStar Optima平板阅读器（BMG Labtech）对7-OHCCA荧光进行定量。将激发波长设置为390 nm，在450 nm处检测到最大发射[21].

细胞辐照

将细胞以300-1800个细胞/孔的速度接种在24孔培养板中，并使其粘附过夜。在癌细胞IC50（皮肤细胞为HSC-3 IC50；乳腺细胞为MCF-7 IC50）处用AuNP培养细胞3小时。然后用2–8 Gy的220 kV或6 MV X射线照射培养物，如前一节所述。6 MV剂量通过光束整形和固体水屏蔽（Gammex）沉积在细胞层水平。控制板被运送到各个设施，但未受到辐照。6天后计数细胞集落，并表示为存活分数（SF）。

通过将每种AuNP的SF数据乘以0 Gy时的1/SF，对SF数据进行化学毒性标准化。将线性二次函数拟合到标准化SF与剂量（D）数据，形式为SF=-exp（αD+βD2).

辐射增强效应报告为标准化SF数据的两个测量值。灵敏度增强比（SER4年)是4 Gy时AuNP对细胞衰老或死亡增强的测量值，计算为SF中无AuNP和有AuNP的比率[23]. 剂量增强因子（DEF0.3)是AuNP产生的有效辐射剂量增益的测量值，计算为SF为0.3时仅辐射剂量与辐射剂量和AuNP的比值。

统计分析

实验一式三份。采用非配对t检验对两组进行比较。为了比较两个以上的组，使用了Bonferroni或Dunnett后测试（GraphPad Prism 6.0软件）进行单向方差分析。

结果

纳米颗粒的物理特性

通过TEM分析确定合成和柠檬酸AuNP的核心尺寸，并证明平均值在1.7–2.4 nm之间，与AuNP合成过程中添加的配体无关(表1，TEM图像和直方图如所示S1图). 水中的流体动力学直径范围为4.5–6.6 nm，配体比率与流体动力学尺寸之间没有明显联系(表1). 除了αGalonly AuNP和柠檬酸AuNP外，所有AuNP都带正电荷(表1). 然而，zeta电位与糖：PEG-胺比之间没有明显的线性趋势。

表1

AuNP物理特性。
糖：PEG-胺比TEM直径（nm）DLS直径（nm）Zeta电位（mV）
αGal:PEG-胺0:1001.82 ± 0.995.08 ± 3.31+43.0 ± 5.7
αGal:PEG-胺40:602.03 ± 0.584.45 ± 2.35+24.5 ± 7.2
αGal:PEG-胺50:501.78 ± 0.576.29 ± 2.17+45.4 ± 7.6
αGal:PEG-胺60:401.65 ± 0.505.27 ± 2.31+21.8 ± 5.7
αGal:PEG胺100:01.96 ± 1.005.13 ± 1.28-16 ± 6.3
βGlc:PEG胺50:502.41 ± 0.816.15 ± 1.76+24.1 ± 5.1
GlcNAc:PEG-胺50:502.13 ± 1.096.11 ± 1.59+30.9 ± 7.7
柠檬酸AuNP2.04 ± 0.986.64 ± 2.17-45.1 ± 13.9

TEM测量得到的AuNP直径（±SD）、DLS测量得到的水动力直径（±SP）和3.2%PBS pH 7.4中测得的zeta电位（±SD。

1三种不同的αGal:PEG-amine AuNP的H-NMR分析显示，在合成过程中，PEG-amin比αGal更容易附着到AuNP上。因此，75:25αGal:PEG-胺的输入比率产生实际比率为68:32的AuNP。50:50αGal:PEG-胺的输入比率产生实际比率为39:61的AuNP。输入比例为25:75αGal:PEG-胺，生成实际比例为17:83的AuNP(S2图).

糖衣AuNP：聚乙二醇胺对皮肤癌细胞具有选择性毒性

最初，三个AuNP（每个都含有PEG-胺，但具有不同的糖配体）对HSC-3和HaCaT皮肤细胞具有毒性。它们是αGal:PEG-amine（50:50）、βGlc:PEG-amin（50:50.）和GlcNAc:PEG-amaine（50:50）。将细胞暴露于0.3–30μg/ml的每个纳米颗粒中1、3、6或24小时，然后通过克隆形成试验评估细胞增殖和存活(图1).

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粘附HSC-3和HaCaT细胞上三种不同50:50糖：PEG-胺AuNP的克隆形成试验剂量-反应曲线。

将一系列AuNP浓度加载到细胞中：a）1 h，B）3 h，C）6 h和D）24 h。图中显示了与每种糖的非纳米粒子对照相比的细胞集落百分比：PEG-胺AuNP±SEM。

从这些数据可以得出三个观察结果：1）与HaCaT正常角质形成细胞相比，所有AuNP选择性地损害HSC-3癌细胞的增殖和存活；HSC-3细胞的增殖和存活表现出2）浓度依赖性和3）孵育时间依赖性的下降。

含有αGal或βGlc糖的AuNP对HSC-3细胞表现出类似的毒性，而含有GlcNAc的AuNPs毒性大约低3-5倍。由于Midatech Pharma已在一期和二期临床试验中测试了αGal功能化纳米粒子，因此有大量关于其稳定性和生物相容性的数据，因此选择αGal配体进行后续工作，使用3小时的培养时间。

糖与聚乙二醇胺的比例选择性影响癌细胞增殖和存活

在优化了糖配体和负载时间后，研究了不同的αGal:PEG胺比例对AuNP在暴露3小时后对粘附的HSC-3细胞和HaCaT细胞的毒性的影响(图2). 四种不同的AuNP比率证明了对HSC-3细胞的选择性毒性(图2A)而金含量高达30μg/ml的AuNP均未对HaCaT细胞增殖和存活产生不利影响(图2B). HSC-3的最大毒性分别为：50:50、60:40、40:60和0:100αGal:PEG-胺比值，而纯αGal-AuNP（100:0）没有毒性。单独使用αGal或PEG-胺配体（不含AuNP）同样无毒。柠檬酸包被的AuNP也无毒。AuNP的HSC-3 IC50值由在粘附或悬浮条件下加载的细胞测定，见表2。悬浮培养负载细胞的剂量-毒性图见S3图.

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在粘附细胞上负载3小时的不同比例的αGal:PEG胺AuNPs、柠檬酸盐封端的AuNPs、仅αGal或仅PEG胺的克隆原性测定剂量反应。

a） HSC-3细胞，b）HaCaT细胞。这些图表表示与非纳米粒子对照±SEM相比的细胞集落百分比。

表2

不同AuNP的化学毒性。
αGal:PEG-胺
比率		HSC-3 IC50
粘附的
（μg/ml金）		HSC-3 IC50
暂停
（μg/ml金）
100:0> 100>100
60:404.21.8
50:500.83.4
40:606.86.2
0:1001317.4

在贴壁或悬浮培养条件下，暴露于不同αGal:PEG-amine AuNPs 3 h的HSC-3细胞的克隆形成测定IC50值。

AuNP在培养基中的稳定性

四种αGal:PEG-amine AuNP在DMEM培养基加10%血清中以10μg/ml（细胞培养中使用的典型浓度）的AuNP浓度进行聚集倾向测试。在四个受试者中，0:100、40:60和50:50 AuNP没有表现出任何聚集，但100:0 AuNP确实表现出聚集(S4A–S4D图）。在没有血清的情况下，AuNP表现出明显的聚集（仅在50:50 AuNP中显示S4E图).

AuNP细胞的积累与毒性没有直接关系

为了确定AuNP细胞积累与毒性之间是否存在相关性，在悬浮培养条件下，以与HSC-3 IC50浓度对应的等毒性剂量，用不同比例的αGal:PEG-amine AuNPs负载细胞3小时。然后通过ICP-MS定量细胞积累。尽管在等毒性浓度下加载，但在HSC-3细胞中不同αGal:PEG-amine AuNPs的积累在3小时后观察到了很大差异(图3). 例如，仅αGal的AuNP在HSC-3细胞中以最高浓度（100μg/ml）加载，但显示出最低的积累（0.03 pg/细胞）。相反，仅含PEG-胺的AuNP（0:100）和50:50 AuNP在HSC-3细胞中的累积量最高（每细胞0.23 pg和每细胞0.16 pg），但这是在负载浓度分别为17.4μg/ml和3.4μg/ml时实现的。

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HSC-3细胞和HaCaT细胞中每细胞（左轴）的金含量，HSC-3 IC50（悬浮培养）负载不同浓度的αGal:PEG-胺AuNPs 3 h。

IC50负载浓度（右轴）绘制为虚线。插图显示了用每个细胞的金除以AuNP负载浓度重新绘制的相同数据。所有数据均以平均值±SEM表示。

重新绘制数据以使AuNP负载量正常化，显示出一种趋势，即每个细胞的AuNP累积量在50:50αGal:PEG-胺时最高，并且随着αGal:PEG-氨比率的增加或减少，此最大值的任一侧逐渐减少(图3插图）。因此，尽管高AuNP积累可能与50:50αGal:PEG-胺AuNP的毒性直接相关，但其他αGal:PEG-氨比率的摄取和毒性之间的关系似乎并不那么简单。例如，60:40和50:50αGal:PEG-amine AuNP的加载浓度（相当于IC50值）相似。然而，50:50αGal:PEG-amine AuNPs使每个细胞累积的AuNP量显著增加，这使得该AuNP成为放射增敏研究的兴趣点。

AuNP积聚在癌细胞的囊泡中

TEM用于揭示AuNP细胞内定位的细节（图​（图44和​和5）。5). 用10μg/ml 50:50培养HSC-3和HaCaT细胞(图4)或0:100αGal:PEG胺AuNP(图5)3小时后，AuNP在类似溶酶体的近核小泡中积累，与HaCaT细胞相比，在HSC-3细胞中有较强的优先积累，与ICP-MS数据一致(图3). 偶尔在细胞质中发现分离的AuNP，但从未在线粒体或细胞核中发现(图4B和4D).

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A，B）HSC-3和C，D）HaCaT细胞与10μg/ml 50:50αGal:PEG-amine AuNPs孵育3h的TEM图像。

A和C中的方框区域分别在B和D中放大。箭头表示细胞质内的AuNP；n、 细胞核；m、 线粒体；标尺A、C为500 nm；B、 D为100 nm。

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A，B）HSC-3和C，D）HaCaT细胞与10μg/ml 0:100αGal:PEG-amine AuNPs孵育3h的TEM图像。

A中的方框区域以B放大显示。比例尺A、C为500 nm；B、 D为100 nm。

AuNP毒性涉及活性氧和半胱氨酸蛋白酶依赖性细胞死亡

为了确定ROS是否在AuNP介导的毒性中发挥作用，HSC-3细胞在存在或不存在0.1 mM丙酮酸钠或1 mM N-乙酰半胱氨酸抗氧化剂的情况下暴露于1μg/ml 50:50αGal:PEG-胺AuNP（选择以接近IC50浓度）。N-乙酰半胱氨酸使细胞完全摆脱了AuNP诱导的细胞死亡，而丙酮酸钠部分但不显著地挽救了约15%的细胞(图6). 已知丙酮酸钠清除细胞外活性氧，但清除细胞内活性氧能力较差[24]表明AuNP是ROS生成的细胞内来源。

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在存在或不存在0.1mM丙酮酸钠（NaPy）或1mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）抗氧化剂的情况下，暴露于1μg/ml 50:50αGal:PEG胺AuNPs的HSC-3细胞的克隆原性测定。

对于每种情况，n=3，数据显示为±SEM。****表示显著差异（P<0.0001 ANOVA，Tukey多重比较后测试）。

为了确定凋亡是否与AuNP毒性有关，将细胞与1μg/ml 50:50αGal:PEG-amine AuNPs和caspase 1/3抑制剂Z-VAD-FMK（50μM）共同孵育。Caspase抑制导致AuNP介导的细胞死亡的显著但不完全的挽救(图7). 相反，使用凋亡诱导剂抗霉素a（10μM）抑制半胱氨酸天冬氨酸酶可完全挽救细胞死亡(图7).

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HSC-3细胞的克隆形成试验，证明50μM Z-VAD-FMK半胱天冬酶抑制剂对50:50αGal:PEG-amine AuNP诱导的细胞死亡有部分挽救作用。

采用10μM抗霉素A作为凋亡阳性对照。对于每种情况，n=3，数据显示为±SEM。*表示显著差异（P<0.05 ANOVA，Tukey多重比较后测试）。

固有AuNPs放射增敏潜力的评估

AuNP上配体外壳的存在会干扰金核辐射诱导的电子释放，从而降低固有的放射增敏电位[25,26].

为了研究任何这种配体屏蔽效应，使用香豆素分析来检测具有不同αGal:PEG胺配体壳的AuNPs和缺乏厚配体壳从而接近“裸露”金表面的柠檬酸盐AuNPs的无细胞水溶液中辐射诱导的羟基自由基形成。这些实验选择6μg/ml AuNP的浓度，以最大限度地检测羟基自由基，因为这是柠檬酸修饰AuNP可达到的最高AuNP浓度（无需借助过滤器浓度）。与纯水相比，6μg/ml柠檬酸修饰的2 nm AuNP（BBI）在10 Gy的6 MV X射线照射下产生约20%的7-OHCCA荧光。相比之下，6μg/ml 50:50αGal:PEG-amine AuNPs辐射诱导7-OHCCA的生成与水的生成没有区别，而6μg/ml0:100αGal:PEG-amine-AuNPs产生的7-OHCCA略低于水(图8a). 220keV X射线也有类似的趋势(图8b). 这些数据表明，50:50和0:100 AuNP将成为较差的放射增敏剂。然而，已知AuNP上存在含硫蛋白质（如谷胱甘肽）的配体交换[27]，可能允许在细胞内处理过程中充分重组αGal:PEG-胺配体外壳，以允许一些放射增敏。

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三种不同的6μg/ml AuNP制剂在水中的羟自由基形成分析，有或没有暴露于10 Gy的A）6 MV X射线或B）220 keV X射线。

辐照后7-OHCCA探针的荧光与仅辐照过的水相比存在显著差异，如下所示P（P）<0.05 *,P（P）<0.01 **,P（P）<0.001***（ANOVA与Dunnett的多重比较后测试）。

AuNP生物放射增敏的评估

50:50和0:100αGal:PEG-amine AuNPs在HSC-3细胞中的细胞积累最高(图3)因此被选为在体外放射增敏实验。将HSC-3和HaCaT细胞在HSC-3 IC50处以50:50或0:100αGal:PEG-胺AuNP负载于贴壁细胞（50:50为0.8μg/ml，0:100为13μg/ml）或1μg/ml柠檬酸钙AuNP（选择接近HSC-3 IC 50浓度）3 h，然后用220kV X射线或6MV X射线照射2至8Gy。将线性二次函数应用于归一化的SF数据，得到了约4Gy的良好拟合，之后斜率偏离线性二次曲线，再次变为线性(图9). 因此，在4 Gy时对SEF进行分析，而DEF的存活分数为0.3（DEF0.3)在大多数情况下，这也相当于AuNP约4 Gy(表3). 在kV和MV能量下，50:50αGal:PEG-胺AuNP存在时，放射增敏作用增加(图9,表3). 然而，与没有AuNP的对照组相比，0:100αGal:PEG胺AuNP在kV能量下是较差的放射增敏剂，在MV能量下具有轻微的放射防护作用(图9,表3)与固有辐射增敏数据一致(图8).

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（A，C）HSC-3和（B，D）HaCaT细胞在暴露于其HSC-3 IC50浓度的αGal:PEG-amine AuNPs，然后接受不同剂量的（A，B）220 kV X射线或（C.D）6 MV X射线后的正常存活分数。

数据以平均生存分数±SEM表示。对每个数据序列拟合一条线性二次曲线。

表3

计算皮肤细胞的敏感性增强比率和剂量增强因子。
细胞系（AuNP）SER公司4岁
6中压		SER公司4岁
220千伏		DEF（排放催化剂）0.3
6百万伏
剂量0/剂量NP		DEF（排放催化剂）0.3
220千伏
剂量0/剂量NP
HSC-3（50:50）1.401.736.59/5.98 = 1.105.46/3.60 = 1.52
HSC-3（0:100）1.021.636.59/6.73 = 0.984.52/3.89 = 1.16
HSC-3（柠檬酸盐）不适用0.97不适用4.52/4.39 = 1.03
哈卡（50:50）1.101.084.97/4.22 = 1.185.61/4.02 = 1.40
哈卡（0:100）0.910.994.97/5.01 = 0.995.02/5.08 = 0.99
HaCaT（柠檬酸盐）不适用0.93不适用5.02/4.95 = 1.01

AuNP对乳腺癌细胞选择性化疗

由于50:50αGal:PEG-amine AuNPs对皮肤癌细胞表现出放射增敏作用，我们研究了乳腺细胞是否也对AuNPs表现出化学毒性和放射增敏。在粘附条件下，用不同浓度的50:50或0:100αGal:PEG胺AuNPs负载MCF-7乳腺癌细胞和MCF-10正常乳腺细胞3小时(图10). 对于这两种AuNP，MCF7细胞的毒性大于MCF-10细胞，尽管0:100αGal:PEG-amine AuNPs对癌细胞的选择性更好。50:50αGal:PEG-amine AuNP的MCF-7细胞IC50值为2.5μg/ml，0:100αGal:PEG-amin AuNP为15μg/ml(图10).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0181103.g010.jpg
贴壁MCF-7和MCF-10细胞暴露于不同浓度50:50或0:100αGal:PEG胺AuNPs 3小时的克隆原性测定剂量反应。

这些图表表示与非纳米粒子对照±SEM相比的细胞集落百分比。

为了确定αGal:PEG-amine AuNPs是否对乳腺细胞产生放射增敏作用，在用2–8 Gy的220 keV X射线或6 MV X射线照射之前，用MCF-7 IC50浓度的αGal:PEG-amin AuNPs培养MCF-7和MCF-10细胞3小时。克隆形成试验表明，50:50αGal:PEG-amine AuNP具有放射增敏作用，但0:100αGal:PEG-amin AuNP的放射增敏可忽略不计(图11,表4). AuNP对乳腺细胞的辐射敏感性均未达到皮肤细胞的程度。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0181103.g011.jpg
（A，B）MCF-7和（C，D）MCF-10细胞在暴露于αGal:PEG-amine AuNPs（在其MCF-7 IC50浓度下），然后不同剂量的A，C）220 kV X射线或B，D）6 MV X射线后的克隆形成试验。

表4

计算乳腺细胞的敏感性增强比率和剂量增强因子。
细胞系（AuNP）SER公司4年
6中压		SER公司4岁
220千伏		DEF（排放催化剂）0.3
6中压
剂量0/剂量NP		DEF（排放催化剂）0.3
220千伏
剂量0/剂量NP
MCF7（50:50）1.110.973.85/3.34 = 1.155.22/4.35 = 1.20
MCF7（0:100）1.210.903.85/3.50 = 1.105.22/5.30 = 0.99
MCF10（50:50）1.121.201.67/1.40 = 1.203.53/3.40 = 1.04
MCF10（0:100）1.271.391.67/1.53 = 1.103.53/3.32 = 1.06

讨论

目前改进放射治疗的努力旨在局部增加肿瘤内的辐射剂量，或通过阻止肿瘤细胞的修复来放大辐射损伤的影响。从实用的观点来看，理想的治疗方法是将这两种能力结合在一个单一的化学放射增敏剂中。为了实现这一目标，我们发现以糖衍生物和PEG-胺配体的特定比例合成的AuNP对皮肤癌细胞具有选择性毒性，50:50αGal:PEG-胺类AuNP的IC50为0.8μg/ml，并且还用作放射增敏剂。模型计算出1.96nm的AuNP包含225个原子[28]，位于1.68 nm AuNP的144个Au原子的测量值之间[29]和333个Au原子用于2.2 nm AuNP[30]. 因此，我们估计每个50:50αGal:PEG-胺AuNP（平均直径1.78 nm）包含约180个Au原子，使得0.8μg/ml金的HSC-3 IC50浓度相当于约23 nm AuNP。这些IC50浓度是我们在已发表的不携带毒素配体的简单AuNP的数据中发现的最低浓度（范围在100 nM至100μM之间[12]). 重要的是，我们仅在急性暴露于αGal:PEG-amine AuNPs 3小时后即可实现这些毒性，而大多数其他研究报告称，将细胞与AuNPs孵育24至48小时[10,11,18,31–34].

很少有研究探讨AuNPs对癌细胞的选择性毒性。例如，Patra等人[34]发现在连续暴露48小时（IC50 100 nm）后，30 nm柠檬酸修饰的AuNP对A549肺癌细胞具有选择性化学毒性，但对HepG2肝癌细胞没有影响。Butterworth等人[35]将DU145细胞（但不是MDA231-MB细胞）暴露于10μg/ml 1.9 nm AuroVist AuNPs后，增殖率降低。将这些AuNP负载的细胞暴露于160 kV X射线下，不会导致DU145细胞产生明显的放射增敏作用（SER2年0.98），但放射增敏MDA231-MB细胞（SER2年1.67），表明其AuNP不是双重放化疗药物[35]. AuNP上配体组织的变化影响细胞膜相互作用，从而改变细胞摄取速率[32,36]. 我们发现，αGal:PEG-胺配体比率的变化显著影响AuNPs的摄取和毒性，其中50:50αGal:PEG-胺类AuNPs摄取和毒性最高。

除0:100αGal:PEG-amine AuNPs外，每个细胞的AuNP摄取量（插入图3)往往与正zeta电位直接相关(表1)虽然每个细胞的摄取量和DLS直径之间没有明显的关系(表1). 在含血清培养基中，0:100和50:50αGal:PEG-胺AuNP不聚集(S4图)并在进入细胞时保持为单个AuNP（图​（图44和​和5），5)，除非它们在某些溶酶体中高度浓缩(图4B). 相反，100:0αGal:PEG-amine AuNPs在含血清培养基中聚集(S4E图)也许可以解释它们对细胞摄取不足(图3)低毒(表2). 目前正在研究选择性细胞摄取和毒性的机制。

50:50αGal:PEG-amine AuNPs导致细胞死亡的机制涉及ROS升高和caspase-3活化。这可能意味着AuNP与线粒体的相互作用。然而，在加载AuNP后3小时，在线粒体上或线粒体内未观察到AuNP，这表明与这些细胞器的相互作用是间接的或延迟的。一些研究表明ROS介导的AuNP化学毒性，但这通常见于AuNP持续存在24小时的微摩尔浓度[33,37].

先前的研究表明，添加聚乙二醇涂层[38–40]或AuNP的葡萄糖涂层[41,42]改善细胞摄取和放射增敏。据报道，15 nM葡萄糖涂层AuNP与200 kV X射线产生24小时SER2吉时第页，共1.56页[41]在6 MV时，5 nM葡萄糖涂层AuNP产生克隆形成SER2.5戈瑞共1.02页[42]. 在这两种情况下，AuNP与细胞孵育24小时[43]比较了与半乳糖和聚乙二醇共官能化的20–30 nm AuNP与柠檬酸修饰的AuNP的细胞毒性和放射增敏性。他们发现这些AuNP与HepG2细胞接触24小时后的化学毒性没有差异（IC50 5μg/ml）。然而，他们的半乳糖-聚乙二醇AuNP表现出比柠檬酸AuNP（DEF）更好的放射增敏作用0.371.95对1.46）。相反，我们发现对于HSC-3细胞，50:50αGal:PEG-amine AuNPs的化学毒性比柠檬酸AuNPs更强（IC50 0.8μg/ml vs>50μg/ml），并且表现出更好的放射增敏作用（DEF0.31.52对1.03）。AuNPs上的致密配体涂层减少了无细胞测定中辐射诱导的自由基形成[25,26]从而得出结论，辐射增敏作用的改善可能是由于AuNP的细胞摄取量的充分增加，这超过了其较低的固有辐射诱导自由基形成能力。我们曾希望，通过使用短的六聚体乙二醇链，我们可以在很大程度上避免配体依赖性降低固有放射增敏能力。然而，我们发现在无细胞辐射诱导自由基形成分析中，即使这些短配体链也不能使AuNP比水更好。然而，对细胞放射增敏的观察表明，配体外壳可能被充分修饰在体外允许一定比例的二次电子逃逸纳米粒子表面并参与自由基的产生。这一点，再加上这些AuNP的高化学毒性和易于合成，使得它们成为合理设计进一步改进这一新型化学放射增敏剂平台的良好起点。

支持信息

S1图

AuNP的尺寸分布。

根据TEM图像测量的AuNP的尺寸分布直方图，以及每个AuNP具有代表性的TEM图像。比例尺为20 nm。

（畅通节能法）

S2图

输入和最终AuNPαGal:PEG-胺比值的比较1H-NMR分析。

比较了三种不同AuNP的αGal:PEG-胺的输入合成比和输出实际比。A） 75:25αGal:PEG-胺混合物产生的实际AuNP比率为68:32。B） 50:50αGal:PEG-胺混合物产生的实际AuNP比率为39:61。C） 25:75αGal:PEG-胺混合物产生的实际AuNP比率为17:83。

（畅通节能法）

S3图

悬浮培养金纳米粒的化学毒性。

在悬浮培养条件a）HSC-3细胞，b）HaCaT细胞下，不同比例的αGal:PEG-胺AuNPs负载3 h的克隆形成试验剂量反应。这些图表表示与非纳米粒子对照±SEM相比的细胞集落百分比。

（畅通节能法）

S4图

AuNPs在10μg/ml培养基中培养后的TEM图像。

A-D）不同比例的αGal:PEG-amine AuNPs在含有10%血清的DMEM培养基中培养3h，然后通过TEM成像（标尺为20nm）。E） 50:50αGal:PEG-amine AuNPs与无血清DMEM孵育3 h，然后通过TEM成像（标尺为2000 nm）。

（畅通节能法）

S1表

原始数据。

包含所有原始数据的Excel电子表格。

（XLSX）

致谢

ICP-MS分析由Ibon Perera、Julen Barrenetxea和Eduardo Nieva在Midatech Pharma España SLU，Building 800，Ibaizabal Bidea S/N，Parque Tecnológico Bizkaia，Derio，48160，Spain进行。1英国阿宾顿Midatech制药公司的Cristina Espinosa Garcia进行了H-NMR分析。我们感谢开放大学的Igor Kraev和Radka Gromnicova对TEM的帮助。

资金筹措表

资金由欧盟FP7-PEOPLE初始培训网络“ARGENT–开发纳米工艺和技术产生的先进放射治疗”项目ID 608163提供http://itn-argent.eu资助者以工资的形式为SG提供支持，但在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何其他作用。MR和PW是Midatech Pharma的员工。AS和RS-C是GenesisCare的员工。这两家公司都没有为这个项目提供资金支持。然而，这两家公司都被要求获得出版许可。“作者贡献”部分阐述了每位作者的具体角色。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃