配体活化转录因子的核受体（NR）超家族指导控制广泛过程的基因表达，包括发育、代谢和生殖生物学(24). 雄激素受体（AR）等NR最初位于细胞质中，在细胞质中结合同源配体，经历伴侣辅助的构象变化，与核导入机制结合，并转移到细胞核(8). NRs与响应元件DNA进行序列特异性结合，并在组装启动前复合物、吸引RNA聚合酶II和启动转录的过程中，将调节蛋白招募到靶基因的增强子和启动子(14). 最近有证据表明，转录所需调节蛋白的NR募集以有序和周期性的方式发生(25).
NR超家族成员具有由N末端结构域、中心DNA结合结构域（DBD）、柔性铰链区域和C末端配体结合结构域组成的模块化结构(10). AR通过N末端结构域激活功能区1（AF-1）和C末端LBD（AF-2）中具有激活功能的亚结构域与调节蛋白接触。AR DBD介导与雄激素反应元件DNA的结合，该元件包含两个由三核苷酸间隔区分隔的回文六核苷酸半位点。AR LBD形成配体结合囊，为热休克蛋白提供结合位点，并介导与N末端结构域的分子内相互作用(17,31).
配体结合是控制NRs反式激活的主要机制，对于一些类固醇激素受体，包括AR，配体结合也控制亚细胞定位(2). 然而，越来越多的证据表明，NR活性可以通过翻译后修饰来调节。NRs的磷酸化可以调节配体敏感性、DNA结合、辅因子相互作用、核转运和降解(22,35,46). 除了少数例外，人们对体内直接磷酸化NR的激酶知之甚少，对NR去磷酸化的磷酸酶知之甚微。调节AR作用的信号转导途径在晚期前列腺癌转录激活的配体依赖机制方面引起了人们的兴趣(18). 通过添加生长因子或激活Ras突变启动的有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶信号在模型系统中促进AR依赖性基因表达和肿瘤生长(1,5,6). 调节AR依赖基因表达的MAP激酶信号的候选靶点包括AR本身和p160辅活化子，其功能是作为启动前复合物组装的分子支架。AR在至少六个位点被磷酸化以响应雄激素结合，其中某些位点的丙氨酸突变降低了报告基因的雄激素依赖性反式激活(13,50).
细胞中主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶之一是蛋白磷酸酶2A（PP2A）。PP2A核心酶是一种异二聚体，由一个催化C亚基紧密结合到结构a亚基组成，后者可逆地结合到B亚基形成PP2A全酶(19). PP2A亚基，特别是B亚基中有相当多的亚型多样性，B亚基由十几种蛋白质组成，并介导全酶靶向细胞内位置和不同的蛋白质底物(40,42). PP2A调节对生长控制至关重要，因为它能使调节增殖的激酶和细胞周期成分去磷酸化。PP2A也是DNA肿瘤病毒的靶点(38). 猴病毒40（SV40）小t抗原（ST）和多瘤病毒中间t和ST均可直接与PP2A A/C异二聚体结合，并降低其对细胞内底物的活性。SV40 ST和B亚单位在A亚单位上有重叠的结合位点，导致B亚单位替换和细胞内PP2A靶向性的相应丢失(29,33). SV40 ST还可以降低PP2A A/C异二聚体对某些蛋白质底物的磷酸酶活性，可能是通过干扰对C亚单位的访问(47). ST对PP2A的负调控被认为对转化细胞中的锚定非依赖性生长和动物模型中的肿瘤发生很重要(16,26,30,48).
在研究显示ST降低PP2A活性的背景下，我们意外发现ST增加了PP2A向AR的活性。我们发现ST介导PP2A A/C异二聚体向AR的转移，导致N末端AF-1中五个磷酸丝氨酸的去磷酸化，并减少依赖AR的反式激活。PP2A转移反应与ST诱导的PP2A A亚基构象变化相关，需要AR中的激动剂构象，并伴随着ST从AR-PP2A复合物中快速解离。
材料和方法
细胞培养和转染。
细胞系取自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯），组织培养试剂购自Gibco/Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。为了进行转录和成像分析，PC-3和LNCaP细胞在添加了木炭和右旋糖酐处理的胎牛血清（HyClone，Logan，犹他州）的RPMI培养基1640（不含酚红）中培养过夜。使用Fugene 6（印第安纳波利斯罗氏）转染Cos7、CV-1和PC-3细胞，使用Lipofectin（Invitrogen）转染LNCaP细胞。通过转染获得的AR表达水平是LNCaP细胞内源性AR表达水平的几倍（Cos7、HEK293和HEK293T细胞）或稍低（CV-1、PC-3和DU145细胞）。
AR复合物的纯化。
表达内源性AR或转染AR质粒的其他细胞类型的LNCaP细胞生长到接近汇合处，用冰镇磷酸盐缓冲液清洗一次，刮入含有1mM苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液中，通过离心（1500×克持续5分钟）。将细胞颗粒重新悬浮在3体积的Triton裂解缓冲液中（0.5%Triton X-100、20 mM Tris-HCl[pH7.5]、150 mM NaCl、5 mM EDTA、2 mM二硫苏糖醇、1 mM苯甲基磺酰基氟化物和5μg抑肽酶、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶抑制素A/ml），并将样品在冰上培养20分钟。然后通过离心（18000×克15分钟），用Triton裂解缓冲液将上清液稀释五倍。对于免疫沉淀，纯化的抗AR单克隆抗体AR441(28)通过孵育4 h，然后用Triton裂解缓冲液进行五次洗涤，预结合到蛋白G-琼脂糖珠（每10μl填充珠中有2μG抗体）。将抗体结合珠与裂解液（每0.5 ml稀释裂解液中含有10μl抗体结合珠）在4°C下混合4 h，并进行端对端旋转。在用Triton裂解缓冲液进行五次洗涤后，通过在室温下用含有AR441表位的合成肽（STEDTAEYSPFKGGYTK）（20μg/ml）培养珠子1小时来洗脱AR复合物。在一些实验中，通过在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液中培养并加热至95°C，从珠子中释放AR复合物。AR复合物通过SDS-PAGE进行分析，并根据标准方法和质谱进行银染色。
AR络合物的质谱分析。
凝胶条带被切除，并通过质谱（MS）标准方法进行处理。用100 mM碳酸氢铵（pH 8.0）清洗凝胶片，用10 mM二硫苏糖醇还原，并用50 mM碘乙酰胺烷基化。然后，将凝胶块脱水，在最小体积的100 mM碳酸氢铵缓冲液中重新溶解，缓冲液中含有12.5 ng胰蛋白酶/ml，并在室温下反应过夜。用100μl含5.0%甲酸的50%乙腈萃取肽15分钟（两个循环），然后用100%乙腈进一步萃取。然后将提取的肽溶液浓缩至～1.0μl。用0.1%乙酸将样品稀释至20μl，以进行质谱分析。每个样品通过75μm内径的微柱-熔融石英管装入360μm外径的管中，管内填充有C18不规则的5至20微米直径树脂。加载样品后，用0.1%乙酸清洗制备柱15分钟，以去除缓冲盐。然后，通过50μm内径的分析柱将制备柱连接到360μm外径的分析柱上，该分析柱填充有C18普通的5μm直径树脂，带有集成的电喷雾发射器尖端。用梯度洗脱样品（Agilent 1100系列HPLC），以60 nl/min的流速直接洗脱到Finnigan LCQ四极离子阱质谱仪（ThermoQuest，San Jose，Calif.）中。使用的纳米流高效液相色谱梯度为0至60%乙腈和0.1%乙酸混合60 min。离子阱质谱仪在数据依赖模式下运行，其中初始MS扫描记录了要充电的质量(米/z)母体离子在300到2000 Da质量范围内的比率。然后选择五个最丰富的离子进行后续的碰撞活化解离（CAD），并记录串联质谱（MS/MS）光谱。根据包含所有灵长类动物蛋白质的数据库搜索来自Cos7细胞纯化样品的MS/MS数据。根据人类数据库搜索HEK293细胞纯化样品的MS/MS数据。所有搜索均使用Sequest程序进行，并在适当时手动验证。
PP2A转移到AR的体外重组。
通过使用纯化的PP2A异二聚体（弗吉尼亚州夏洛茨维尔Upstate Biotech）和重组PP2A a亚单位重建ST依赖性PP2A转移反应。PP2A A亚单位（人类α亚型）用N末端His表达6标记入大肠杆菌BL21（DE3）/pLysS细菌（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）并通过标准方法纯化。SV40 ST在细菌中表达并如前所述纯化(43). 对于体外转移反应，将雄激素处理细胞的AR复合物固定在AR441抗体蛋白G珠（10μl）上，并与PP2A异二聚体（0.2 U）或重组His孵育6-在没有或存在重组SV40 ST（1μg）的情况下的亚单位（2μg）。反应物含有总体积为150μl的牛血清白蛋白（0.1 mg/ml），在Triton裂解缓冲液中，并在4°C下孵育过夜。用Triton裂解缓冲液洗涤五次后，用SDS-PAGE对结合组分进行解析，并用免疫印迹法进行分析。
转录分析。
通过使用双核糖核酸酶报告分析系统（Promega）测量转录。将细胞接种到6孔板（106每孔细胞数），隔夜培养，并根据适用于每种细胞类型的协议转染指定的质粒。每个孔共接收1μg DNA，其中通常包括500 ng报告质粒、100 ng AR质粒、50 ng小t质粒，其余为空载体pCDNA3.0。报告人是前列腺特异性抗原（PSA）-萤火虫荧光素酶、Vit6萤火虫萤光素酶和巨细胞病毒-雷尼利亚荧光素酶。转染24小时后，改变培养基并用AR配体处理细胞额外24小时。使用的配体为5-α-二氢睾酮、雄烯二酮（ASD）、氟他胺（均来自密苏里州圣路易斯西格玛）、合成雄激素-甲基三烯酮（R1881）（佩金-埃尔默）和卡索得（阿斯利康）。在Berthold LB 953光度计上测量了裂解液中的荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性标准化为雷尼利亚荧光素酶活性（绘制为F/R），分三次进行分析，数据至少代表三次实验。免疫印迹法用于确定转录中的任何差异都不是由表达水平引起的。
抗体。
AR441是一种抗肽单克隆抗体，可识别AR N末端结构域内的一个表位。用蛋白G色谱纯化由杂交瘤AR441/B2/H8（D.Edwards的礼物）分泌的AR441。PG-21（Upstate）是一种识别AR N末端的抗肽多克隆抗体。针对以下磷酸肽生成识别AR中磷酸化位点的抗体：Ser16，CYPRPPS公司KTYRG；对于Ser94，CQGEDGS公司PQAHR；用于Ser256、CALEHLS公司PGEQL；用于CDTAEY的Ser308S公司PFKGG；用于Ser424，CGPGSGS公司PSAAA；对于Ser650，CASSTTS公司PTEET（磷酸化位点以斜体显示）。磷酸化-Ser81抗体已在前面描述过(三). 免疫沉淀采用ST抗体PAb430（帝国支原体的礼物），免疫印迹采用PAb108（美国型培养物收藏）。使用了四种PP2A抗体，包括抗C亚基小鼠单克隆1D6（Upstate），一种抗C亚单位兔多克隆(27)、抗A亚单位大鼠单克隆MRT-204R（加利福尼亚州里士满Covance）和抗A亚基山羊多克隆sc-6112（加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz）。通过增强化学发光（Pierce，Rockford，Ill.）用过氧化物酶标记的二级抗体进行免疫印迹。使用的其他抗体包括针对FLAG表位的单克隆M2、针对α-微管蛋白（Sigma）的单克隆DM1A和针对PSA的兔多克隆MU014-UC（BioGenex，San Ramon，Calif.）。
结果
与AR结合的配体促进了因子的招募，这些因子是转位到细胞核和在转录过程中组装启动前复合物所必需的。为了确定参与这些过程的因素，我们使用蛋白质组学方法来确定从雄激素激动剂和拮抗剂处理的细胞中分离出来的AR复合物的组成。通过瞬时转染在Cos7细胞中表达AR，并使用抗AR单克隆抗体AR441亲和纯化AR复合物(28). 用与单克隆抗体表位对应的合成肽洗脱复合物，并通过SDS-PAGE和银染色进行分析。合成雄激素（R1881）治疗导致出现AR相关的～65-和～36-kDa多肽，这些多肽不存在于从对照细胞或雄激素拮抗剂Casodex治疗的细胞分离的复合物中（图。，车道1至3）。根据质谱分析，AR-雄激素复合物特有的多肽是丝氨酸/苏氨酸PP2A的调节亚基（A亚基，65 kDa）和催化亚基（C亚基，36 kDa). A和C亚单位异源二聚并形成核心PP2A酶，已知其调节细胞内的多种途径(19). PP2A A/C异二聚体与不同的调节性B亚单位相关，但银染或质谱法在AR-雄激素复合物中未发现B亚单位。用A和C亚单位抗体进行免疫印迹证实，PP2A在R1881存在时与AR结合，但在缺乏配体或存在Cas时不与AR结合（图。，车道1至3）。在存在5-α-二氢睾酮和肾上腺雄激素ASD的情况下，也观察到PP2A与AR的结合，但在存在抗雄激素氟他胺的情况下则没有观察到（图。). 因此，PP2A与AR的结合严格依赖于激动剂诱导的LBD构象。
PP2A作为AR复合物亚单位的鉴定。（A） 通过免疫亲和纯化分离AR复合物。表达AR的Cos7细胞用10 nM R1881（合成雄激素）或30μM Casodex（Cas）处理1 h。免疫纯化后，用SDS-PAGE和银染色分析复合物，并切除多肽并用质谱分析。盒子中的多肽对应于PP2A的A亚基和C亚基。（B） 使用PP2A A亚基和C亚基抗体对从Cos7细胞获得的AR复合物进行免疫印迹。（C） AR和PP2A之间的激动剂特异性相互作用。用1 nM 5-α-二氢睾酮（DHT）、100 nM ASD、10 nM R1881或10μM氟他胺（Flut）处理表达AR的Cos7细胞1 h，分离AR复合物并通过免疫印迹检测PP2A A和C亚单位的存在。
表1。
不同配体处理后Cos-7细胞免疫沉淀AR复合物质谱分析鉴定的蛋白质总结
| 治疗 | 凝胶带编号。 | 蛋白质 | genInfo标识符 | 肽的数量 |
|---|
| 控制 | 1 | 雄激素受体 | 460281 | 9 |
| 2 | 热休克蛋白70.1 | 462325 | 8 |
| 2 | HSP 70蛋白8亚型1 | 5729877 | 7 |
| 1881兰特 | 1 | 雄激素受体 | 460281 | 10 |
| 2 | 热休克蛋白70.1 | 462325 | 三 |
| 2 | HSP 70蛋白8亚型1 | 5729877 | 三 |
| 三 | PP2A催化α亚基 | 21619480 | 三 |
| 4 | PP2A调节性α亚单位 | 231443 | 6 |
| 卡索迪克斯 | 1 | 雄激素受体 | 460281 | 8 |
| 2 | 热休克蛋白70.1 | 462325 | 7 |
| 2 | HSP 70蛋白8亚型1 | 5729877 | 4 |
PP2A绑定特定于AR。
AR-PP2A复合物通过免疫沉淀法从SV40转化的Cos7和293T细胞中回收，而不是分别从未转化的亲本系CV-1和293中回收（图。). 然而，AR和PP2A之间的相互作用并不依赖于细胞转化，因为它通过SV40早期区域的瞬时转染在293细胞中重建（图。). SV40早期区域还重建了前列腺癌细胞系LNCaP（来自淋巴结转移）、DU145（来自脑转移）和PC-3（来自骨转移）中AR与PP2A的雄激素依赖性结合（图。). 在SV40转化的Cos7细胞中，PP2A没有转移到糖皮质激素受体（GR）、雌激素受体（ER）或维甲酸受体（RAR）上（图。). 虽然LBD在这些NR中的结构和功能相似，但PP2A A/C异二聚体识别激动剂结合型AR特有的特征。
SV40早期区域需要PP2A转移到AR。（A）PP2A迁移到AR发生在SV40转化的Cos7和293T细胞中。将AR转染到所示的细胞类型中，并在加入10nM R1881（1小时）后，分离AR复合物，并通过银染色和免疫印迹进行检测。（B） 用SV40早期区域瞬时转染293细胞可将PP2A转移到雄激素结合的AR上，以及绿色荧光蛋白-RAR，无论是否存在其同源配体地塞米松、雌二醇和所有-反式维甲酸。指示了AR、GR、ER和绿色荧光蛋白RAR的位置（*）。免疫印迹中负载的AR复合物的数量是银染色的一半，而免疫印迹的其他NR的数量与银染色的相同。
PP2A与AR的结合由ST诱导。
使用缺失分析和免疫沉淀法鉴定SV40早期区域的最小片段，当将其导入细胞时，会导致AR与PP2A结合（图。和数据未显示）。该片段编码ST，一种174-氨基酸蛋白，已知可直接与PP2A结合(29,47). ST的表达，而不是大T抗原的表达，足以在LNCaP细胞中重建内源性AR与内源性PP2A的雄激素依赖性关联（图。，车道1和2）。类似地，在存在ST但不存在大T抗原的情况下，在DU145和PC-3细胞中异位表达的AR与内源性PP2A结合。这种结合严格依赖于激动剂。SV40转化的Cos7和293T细胞表达ST，这解释了为什么PP2A被转移到这些细胞类型中表达的雄激素结合AR上。
ST介导PP2A转移到AR上。（A）前列腺癌细胞株中的小t抗原（t）而非大t抗原（t。注意，从对照细胞或雄激素处理细胞分离的AR复合物中未检测到ST或大T抗原（数据未显示）。（B） PP2A转移反应中J域函数的分析。导致J结构域功能丧失的突变并不影响ST介导的PP2A转移到AR上。AR和野生型ST（WT）或指示的ST突变形式在293细胞中表达。雄激素治疗后，分离AR复合物并检测PP2A亚单位的存在。（C） PP2A转移到AR需要与ST进行物理相互作用。ST（C103S）中的突变破坏了与PP2A的结合，从而抑制了转移反应。AR和野生型ST（WT）或C103S突变体在293细胞中表达。（D） PP2A与ST的结合可以从ST介导的PP2A转移到AR上的过程中分离出来。10-氨基酸Myc标记与C末端的融合导致了一种结合PP2A的ST形式（通道2），但未能介导PP2A向AR的转移（通道4）。显示ST（*）和ST-Myc（**）的位置。（E） 用纯化成分在体外重建PP2A转移反应。将293细胞中表达的AR固定在小球上，并与纯化的PP2A A/C异二聚体和重组ST进行转移反应。（F）用重组A亚单位重建PP2A转移反应。除使用细菌中表达的His-tagged a亚单位代替PP2A a/C异二聚体外，其余反应均按面板E所述进行。
ST包含一个N末端J结构域，它是一个在DNA J型分子伴侣中发现的～70-氨基酸四螺旋结构(11,41). J结构域通过招募和激活Hsp70（热休克蛋白70）蛋白的ATP酶活性发挥协同作用(21). 由于Hsp70蛋白与NRs相互作用，在我们的纯化过程中被分离为AR相关亚单位（表)，我们测试了ST的J结构域是否参与AR与PP2A的结合。抑制ST中J结构域功能的保守His-Pro-Asp（HPD）序列中的突变被设计并与AR共表达。J结构域突变的ST（H42Q或D44N）介导PP2A转移到雄激素激活的AR上（图。). 因此，转移反应不需要ST中的J域活性。然而，PP2A传输到AR需要ST和PP2A之间的联系。半胱氨酸（C103S）突变，破坏ST与PP2A的结合(26)导致PP2A与AR结合完全丧失，即使突变ST过度表达（图。). 我们还发现，PP2A与ST的结合可以从PP2A转移到AR上的过程中解偶联。将Myc表位融合到ST的C末端可以阻止PP2A从ST转移到激活的AR上，而不会影响与PP2A的结合，这是通过共免疫沉淀法测得的（图。). ST的C末端可能直接参与转移反应，或者Myc表位可能改变对转移反应重要的ST区域的结构。
我们用固定化的AR、细菌表达的ST和纯化的PP2A A/C异二聚体重建了PP2A转移反应，这排除了细胞B亚基或其他蛋白质参与反应（图。). 体外转移反应后，AR复合物中未检测到ST（数据未显示），表明其在PP2A转移期间或之后与PP2A分离。转移反应也通过使用细菌表达的PP2A A亚单位进行重组，这表明AR和PP2A之间的相互作用涉及与A亚单位的直接接触（图。). 与体内PP2A转移反应一样，体外转移反应严格依赖雄激素激活的AR形式。该观察进一步强调了AR构象在转移反应中接受PP2A的关键性质。此外，由于AR的雄激素激活（体内）和PP2A的ST依赖性转移（体外）是分开进行的，ST不太可能通过将AR捕获在雄激素结合期间发生的中间构象中来介导PP2A转移。相反，A亚单位的ST占据形式似乎更可能针对AR的激动剂特异性构象。
PP2A关联需要AR的DBD-hinge-LBD区域。
我们使用了一系列AR缺失突变体来绘制与PP2A稳定关联所必需的区域。对PP2A结合具有功能的AR的最小片段包含DBD、铰链区和LBD（图。). 为了研究转移反应的动力学，我们用R1881处理表达AR的Cos7细胞5分钟到20小时。在加入雄激素后的最早时间点（5分钟）观察到PP2A转移到AR上，表明反应迅速，可能发生在AR导入细胞核之前的细胞质中（图。). AR二分体核定位信号（NLS）的突变减少核输入并使AR以细胞质为主(36). 这些形式的AR对PP2A结合具有完全活性（图。). 此外，组成核（NLS-AR）或细胞质（核输出信号[NES]-AR）的工程形式的AR对激动剂依赖性结合PP2A具有功能（图。). 因此，ST介导的PP2A向AR的转移可以发生在细胞质或细胞核中。
PP2A转移需要AR的DBD-hinge-LBD区域，发生在细胞质和细胞核中。（A） 删除分析，以确定AR可以稳定结合到PP2A的最小区域。AR结构在Cos7细胞中表达为与FLAG表位的N端融合，并使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀和免疫印迹。（B） PP2A在体内快速转移到AR上。表达AR的Cos7细胞用R1881（10 nM）处理指定时间。如果将R1881添加到细胞裂解液中，则PP2A不会转移到AR上，这表明在细胞裂解后没有发生转移反应（未显示）。（C） PP2A可以转移到NLS突变的AR上，该AR主要位于胞浆中。（D） PP2A可以转移到组成性定位于细胞核或细胞质的AR上。AR在Cos7细胞中以SV40的NLS（NLS-AR）和蛋白激酶抑制剂（NES-AR）的NES融合表达。R1881处理后，分离AR复合物并通过免疫印迹检测PP2A A和C亚单位的存在。
AR通过PP2A脱磷。
我们使用显色底物测量了与AR相关的PP2A的磷酸酶活性第页-硝基苯磷酸盐。R1881处理表达AR的Cos7细胞（图。)导致AR相关磷酸酶活性恢复（图。). 与雄激素结合AR相关的磷酸酶活性被10 nM冈田酸抑制98%，这与我们在AR复合体中对PP2A的鉴定结果一致。
PP2A使AR的AF-1区脱磷。（A）与AR结合的PP2A具有催化活性。AR在未经处理或用R1881处理以诱导体内PP2A负载的Cos7细胞中表达。洗脱AR复合物并分析其磷酸酶活性。（B） AR AF-1区五种磷酸丝氨酸的ST依赖性负载和PP2A依赖性去磷酸化。AR在293细胞中表达，无论是否存在ST，细胞要么未经处理，要么用R1881处理（10 nM，持续2 h）。用pan-AR抗体（PG-21）和一组磷酸特异性AR抗体对样本进行分析。（C） PP2A去磷酸化需要负载到AR293细胞上。表达AR和野生型或Myc-tagged型ST的细胞未经处理或用R1881处理，AR复合物被分离出来并用磷酸特异性抗体进行免疫印迹分析。显示ST（*）和ST-Myc（**）的位置。
AR在雄激素结合、生长因子的添加和激酶途径的药理激活下发生磷酸化反应(46). 为了确定PP2A是否去磷酸化AR，我们检测了PP2A依赖于ST转移到AR后的磷酸化状态。该分析依赖于针对AF-1区域中的六个磷酸化位点和铰链区域中的一个磷酸化位置生成的一组AR-phosphospecific抗体。在不存在或存在ST的情况下，在293细胞中表达AR，用R1881处理细胞，并通过免疫印迹测定AR的磷酸化状态。在没有ST的情况下，雄激素诱导六个位点（Ser16、Ser81、Ser256、Ser308、Ser424和Ser650）的磷酸化（图。，车道1和2）。这一发现与其他细胞类型的磷酸肽图谱和质谱数据一致(三,13). 在ST存在的情况下，AR在五个位点（Ser81、Ser94、Ser256、Ser308和Ser424）脱磷酸（图。，车道3和4）。在PP2A与AR结合的条件下，AR中的Ser650位点没有去磷酸化，并且在ST存在的情况下，Ser650表现出相对较高的结构性（雄激素依赖性）磷酸化。为了排除ST表达通过涉及另一种磷酸酶激活的间接途径促进体内AR去磷酸化的可能性，我们表达了ST的Myc-tagged形式，并检查了AR中几个位点的磷酸化状态（图。). Myc-tagged ST结合PP2A，但未能将PP2A转移到AR上，因此没有引起AR的去磷酸化（图。). ST-和雄激素依赖性PP2A与AR结合以及AR AF-1区五个位点去磷酸化之间的相关性证明PP2A是AR磷酸酶。我们使用质谱法来表征由对照细胞和ST表达细胞制备的AR中Ser94和Ser650的磷酸化状态，并获得了与我们的磷酸化抗体检测一致的结果（图。).
用R1881处理的对照和ST-转染HEK293细胞AR磷酸肽的质谱分析。（A） 对照样品中显示了含有Ser650或Ser94的两种AR肽的非磷酸化和磷酸化形式的选定离子色谱图。通过计算每个选定离子的所有电荷态曲线下的面积来确定每个肽的丰度。通过将非磷酸化形式和磷酸化形式的离子丰度相加，计算出每种肽的所有形式的总离子丰度。将EVIQNPGPR的选定离子色谱图作为对照，以证明每个样品中没有多种形式的AR肽的水平。（B） 与面板A中的分析相同，只是我们使用了从表达ST的细胞制备的样品。（C）对照组和转染ST的样品之间Ser650和Ser94的磷酸化差异表示为归因于该肽磷酸化形式的每个肽的总离子丰度的百分比。这些数字是通过将每个肽的磷酸化形式的离子丰度除以来自同一样品的该肽的所有形式的总离子丰度来计算的。
ST抑制AR活性。
LNCaP细胞表达内源性AR，并显示AR反应基因（包括PSA）的强大雄激素依赖性反式激活。我们测量了编码ST和大T抗原的SV40早期区域缺失和存在时LNCaP细胞中PSA启动子的反式激活。在SV40转染后，与萤光素酶融合的6-kB PSA启动子几乎完全抑制了AR依赖性转录（图。). 相反，使用与荧光素酶融合的Vit6启动子在LNCaP细胞中测量到的ER-依赖性转录增加（图。). 在本试验中，可以使用仅表达ST的质粒来重建对AR依赖性转录的抑制（图。). 我们的数据表明，通过ST依赖性PP2A转移使AR去磷酸化降低了AR介导的转录。我们测试了从PSA启动子测量的PP2A转移缺陷（Myc标记）形式的ST对AR依赖性转录的影响（图。). 在ST抑制AR依赖性转录～80%的条件下，两倍以上Myc标记ST的表达仅抑制AR依赖型转录～20%（图。). 因此，在这些分析中有效抑制AR依赖性转录需要PP2A从ST转移到AR。
PP2A负载和去磷酸化抑制AR转录活性。（A） SV40早期区域对AR依赖性转录的影响。在SV40早期区域缺失和存在的情况下，使用融合到萤火虫荧光素酶（PSA-LUC）的6-kb PSA启动子在LNCaP细胞中测量雄激素依赖性转录（内源性AR）。细胞在无酚红培养基中培养，培养液中含有木炭色的血清，然后用1 nM R1881进一步处理24 h以诱导转录。检测一式三份，使用巨细胞病毒进行标准化-雷尼利亚荧光素酶和是至少三个实验的代表。（B） SV40早期区域对雌激素受体依赖性转录的影响。使用基于卵黄原蛋白启动子（Vit6-LUC）的萤火虫荧光素酶报告子在LNCaP细胞中测量雌激素（E2）依赖性转录（转染ERα）。（C） ST表达对AR依赖性转录的影响。将编码SV40 ST的质粒的浓度增加（6.25至100 ng/孔）与PSA-LUC共同转染到LNCaP细胞中。分析样本的转录水平（顶部）和AR表达水平（底部）。（D） PP2A对AR介导的转录的负载依赖性和独立性影响。在野生型ST和Myc-tagged ST存在的情况下，测量PSA启动子的AR依赖性转录，后者结合PP2A，但不介导PP2A负载到AR。（E）剂量-反应曲线显示ST对AR依赖性表达的影响。通过增强化学发光、X射线胶片扫描密度测定和ImageQuant软件测定ST（闭合圈）和ST与Myc表位融合（开放圈）的相对表达水平。（F） ST表达降低内源性PSA水平。1 nM R1881可诱导LNCaP细胞第1和第2通道PSA的表达；第3和第4道，LNCaP细胞感染对照腺病毒（Ad）或ST-表达腺病毒（Ad-t）24小时，然后用1 nM R1881处理额外24小时。通过免疫印迹分析全细胞裂解液中的PSA水平。
为了确定ST对内源性基因表达的影响，我们用表达ST的腺病毒或对照腺病毒感染LNCaP细胞，并通过免疫印迹法检测PSA水平。我们在感染编码ST的病毒的细胞中观察到PSA水平降低，但在感染对照病毒的细胞中没有（图。).
PP2A转移机制。
有两种非互斥机制可以解释ST是如何将PP2A转移到AR上的。首先，ST可以暂时桥接PP2A和AR之间的相互作用，并促进手把手反应。我们不赞成将切换反应作为PP2A转移的可能机制，因为它需要ST与AR结合，而这种相互作用在我们的分析中尚未观察到。虽然由于ST-AR相互作用可能过于短暂而无法检测到，因此我们无法正式排除手控反应，但我们已经探索了一种基于ST-诱导PP2A结构变化的机制。我们考虑了ST诱导的构象变化是否会产生与激动剂结合型AR结构互补的a亚单位表面。PP2A a亚单位由15个HEAT重复序列组成（对于亨廷顿，延伸因子，PP2A a-亚单位，TOR），以及全面的缺失和突变研究已将ST结合位点定位到HEAT重复序列3至6(15,32,33)（图。). 我们通过有限的蛋白水解分析了ST诱导的PP2A A亚单位结构的构象变化，认为这种变化会增加或减少A亚单位内糜蛋白酶裂解位点的可及性。为此，我们使用宽浓度范围（1:540至1:20[wt/wt]）的糜蛋白酶消化重组PP2A a亚单位，并通过银染和免疫印迹分析产物。当用与ST预孵育的PP2A a亚基进行消化时，通过银染色检测到~55kDa的糜蛋白酶片段（图。，7至10车道）。PP2A A亚单位的～55-kDa片段未被极端N末端抗体识别，但被极端C末端抗体识别（图。). 这些数据表明，～55-kDa片段是由HEAT重复序列3附近的一个位点的糜烂裂解产生的，当ST与a亚单位结合时，该位点变得更容易接近（图。). ST与A亚单位的结合也降低了HEAT重复序列8附近糜蛋白酶位点的可及性，在没有ST的情况下，这导致了～32-kDa的N末端片段（图。). 我们的数据表明，在没有其他细胞因子或翻译后修饰的情况下，ST结合并改变PP2A A亚单位的构象。
ST结合改变PP2A的构象。（A） 图中显示了PP2A的A亚单位中15个HEAT重复序列的排列，HEAT重复3到6上的ST结合位点，以及显示ST结合导致可及性降低（小箭头）或增强（大箭头）的蛋白水解裂解位点。（B） PP2A A亚单位的体外蛋白水解。在无重组ST和有重组ST的情况下，用糜蛋白酶消化纯化的重组A亚单位，并通过SDS-PAGE和银染分析产物。U、 未消化的样品。ST以～20kDa的速度迁移（6至10车道）。（C和D）将消化产物与PP2A A亚基的N和C末端的表位抗体平行检测。（E） 需要将构象依赖性PP2A加载到AR.B亚单位解离（步骤1）上的模型来揭示ST在A亚单位上的结合位点。ST与A/C异二聚体结合（步骤2）诱导A亚单位的构象变化。雄激素与AR结合可诱导构象改变（步骤3），此外，该改变可促进激酶的识别和磷酸化。ST和PP2A A/C的三元络合物与雄激素结合AR对接（步骤4），释放与AR结合的ST.PP2A，使N末端AF-1区域内的五个磷酸丝氨酸脱磷酸化（仅显示两个）。AF-1区的Ser16和铰链区的Ser650没有去磷酸化。
讨论
ST在细胞转化中的作用主要是在其与PP2A的相互作用中被考虑的，PP2A改变了信号转导和基因表达(26,29,39). ST与PP2A A/C异二聚体的高亲和力结合导致大量B亚单位的有效置换，减少PP2A A/B/C全酶的池，并改变对生长调节重要的细胞底物的活性。最近的研究发现，抑制PP2A亚单位B56γ可以模拟ST的转化作用，这突显了B亚单位发挥的关键作用，并提供了证据表明PP2A全酶靶向底物对生长调节是必要的(4).
PP2A转移反应中AR的构象依赖性。
我们确定PP2A转移反应严格依赖于激素与AR结合和ST与PP2A A/C异二聚体的A亚基结合所引发的特定构象（图。). R1881、5-α-二氢睾酮和雄烯二酮均能诱导AR的激动剂特异性构象，并且所有三种雄激素相关化合物都支持在体内ST存在下PP2A转移到AR上。在存在同源配体的情况下，PP2A未转移到含有抗雄激素药物Casodex或Flutamide或其他NRs（GR、ER和RAR）的无配体AR或AR上（图。和). 这些结果强调，PP2A A亚单位-ST复合物识别AR激动剂结合构象特有的结构特征。AR激动剂结合状态的生物化学和结构特征包括N末端AF-1区域和C末端LBD之间增强的相互作用，以及LBD中螺旋12的定位，以允许辅激活剂结合(17,34). 然而，PP2A结合的结构决定因素与辅活化子结合的结构决定性因素不同，因为AR的LBD不足以进行PP2A负载反应。重组PP2A负载反应所需的AR最小片段跨越DBD-铰链-LBD区域。PP2A可以与LBD和DBD协同结合，或者可能需要AR中的结构域间相互作用来稳定LBD或DBD中PP2A结合位点的构象。
尽管N末端AF-1区域包含PP2A的C亚基脱磷的五个位点，但PP2A负载不需要该区域。需要进行晶体学分析来确定AF-1磷酸化位点是如何相对于PP2A结合AR的DBD-铰链-LBD区域进行空间定位的，我们的发现是，PP2A通过其调节性A亚基与AR结合并脱磷酸化五个位点，这清楚地表明了多蛋白复合物的构象灵活性。AR富含脯氨酸的铰链区域或PP2A的A亚单位可赋予构象灵活性。AR-PP2A复合体内构象灵活性的概念提出了一种有趣的可能性，即AR可能作为一种激素调节的B亚单位，将PP2A靶向雄激素反应启动子和增强子。考虑到包括p160辅活化子在内的大量因子在转录过程中进行可逆磷酸化，以及PP2A可以使组蛋白H1去磷酸化的事实(37)，PP2A可能加入选择性招募到启动子以调节基因表达的蛋白质修饰酶的行列。
PP2A在转移反应中的构象依赖性。
由于PP2A A/C异二聚体的A亚单位似乎也需要构象变化，因此激动剂结合诱导的AR构象变化对于PP2A负载来说是必要的，但并不足够（图。). 重组PP2A A亚单位的酶切表明，ST结合增加了HEAT重复序列3和4附近的裂解位点的可及性，并降低了HEAT重排8和9附近的裂解部位的可及度。这些数据支持一个模型，即ST诱导的a亚单位变化产生的构象与AR的激动剂激活构象具有结构互补性（图。). 在该反应中，ST通过将A/C异二聚体导向AR来介导PP2A的特异性靶向。我们的数据验证了长期以来的假设，即ST通过将PP2A靶向特定底物来发挥病毒B亚单位的功能。然而，靶向AR的ST依赖性PP2A有两个不寻常的特征：ST似乎没有直接接触靶蛋白AR，并且ST在PP2A与AR结合时释放（图。). 我们从这些结果推断，靶向PP2A到AR的信息不是在ST内携带的，而是在ST诱导的PP2A中A亚基的构象内携带的。这与依赖于B亚基桥接PP2A与其底物之间的相互作用的PP2A-全酶的B亚基靶向的传统观点形成对比。鉴于病毒蛋白具有协同细胞机制的倾向，测试细胞B亚单位靶向PP2A全酶是否涉及A亚单位构象的变化将非常重要。
ST抑制AR依赖性转录。
ST激活基因启动子，包括细胞周期蛋白A、D1和腺病毒E2的启动子(26,30,45). 我们发现ST抑制AR活性，涉及两个成分，PP2A转移依赖成分和PP2A转导依赖成分。AR活性的非转移相关抑制可能是由于Akt的ST激活，Akt磷酸化并抑制AR(23,49). 通过使用带有C末端Myc标记的ST获得了转移依赖性成分的证据，该ST结合PP2A，但未能促进PP2A向AR的转移。尽管ST-Myc可以对AR依赖性转录产生抑制作用，但它并没有重演未标记ST观察到的相同水平的抑制，它介导PP2A转移反应。Myc标记的ST与PP2A的结合可以通过间接途径抑制AR依赖性转录，例如减少活性PP2A的库。在未标记ST存在的情况下，AR依赖性转录的总抑制水平可能反映了对AR的转移依赖性和转移依赖性效应的总和。ST也被证明可以抑制c-福斯启动子，尽管该活性定位于ST和大T抗原的共同区域(44).
PP2A使AR的AF-1区去磷酸化。
当ST介导PP2A转移到AR上时，N-末端AF-1区域的六个磷酸丝氨酸中的五个被去磷酸化。其中四种丝氨酸（Ser81、Ser256、Ser308和Ser424）被磷酸化，以响应雄激素结合和激活蛋白激酶A（PKA）和PKC信号的化合物(13). 第五丝氨酸（Ser94）是组成性磷酸化的，用上述试剂处理后变化不大。PP2A负载、AR依赖性转录的抑制和去磷酸化之间的相关性表明，激酶-磷酸酶循环调节AR活性。磷酸化可以增加或减少NR对同源配体的敏感性，磷酸化可以增强或抑制DNA结合(35). 其他可能受到影响的步骤包括促进预引发复合物组装或拆卸的周转和辅因子相互作用。
目前尚不清楚为什么AR铰链区的Ser650在ST存在下被组成性磷酸化。ST存在下AR Ser650的磷酸化可能通过PKA介导，因为提升PKA信号的化合物增强了该位点的磷酸化(13). 序列上下文（Ser-Pro）增加了AR Ser650被脯氨酸导向激酶磷酸化的可能性，如MAP激酶之一，已知MAP激酶在ST的存在下过度活跃(39).
ST和癌症模型。
尽管人类二倍体成纤维细胞可以通过端粒酶催化亚基、致癌Ras和大T抗原的共表达而永生化，但肿瘤发生需要ST的共表达(16,48). ST也被证明在转基因小鼠前列腺细胞的肿瘤发生中发挥重要作用。Greenberg及其同事使用前列腺特异性启动子在名为TRAMP（转基因腺癌小鼠前列腺）的小鼠模型中驱动大T和ST的表达。TRAMP小鼠的前列腺发生前列腺上皮内瘤变和局灶性腺癌的频率为100%，在骨骼、淋巴结和肺部观察到转移(12). Matusik及其同事构建了一个相关的小鼠模型，其中只表达大T抗原(20). 来自大T抗原模型的前列腺会发展为前列腺上皮内瘤变和局灶性腺癌，但与TRAMP小鼠的情况不同，不会发生器官转移。这些数据表明，在TRAMP模型中，ST使前列腺细胞具有转移所必需的获得功能特性，或者ST抑制了通常抑制转移的功能。我们的培养细胞数据表明AR是TRAMP小鼠ST的潜在靶点。然而，由于其调节基因表达和信号转导途径的能力，ST依赖性转移的潜在机制可能很复杂。因此，重要的是确定ST是否影响TRAMP模型中AR依赖性基因的表达，以及这是否包括与转移相关的基因。越来越多的证据表明SV40和其他乳头状病毒与人类恶性肿瘤之间存在关联(9)最近的证据表明，在前列腺癌组织中检测到人类乳头状病毒BK病毒(7)提出BK病毒ST可能以类似于此处所述的方式影响AR功能的可能性。
总之，我们发现了一种严格依赖变构互补的新型蛋白质转移机制。我们发现ST诱导PP2A异二聚体的A亚单位发生变化，我们认为这与激动剂诱导的AR构象形成结构互补。ST促进PP2A转移到转录因子的能力揭示了一种新的ST依赖机制，通过去磷酸化影响基因表达，可能与肿瘤发生有关。
