比较基因组学金黄色葡萄球菌肌肉骨骼隔离^†

微阵列描述。

两个基因组规模的微阵列，共同代表所有七个人类分离物的序列金黄色葡萄球菌在这些实验中使用。第一个是由基因组研究所（TIGR）作为病原体功能基因组研究中心（PFGRC）倡议的一部分制作的。该基于扩增子的阵列被PFGRC指定为1.0版，最初报告包含PCR产物，代表来自COL的2576个基因和来自Mu50的117个独特基因(n个=60），分子量2(n个=51）和N315(n个= 6). 然而，通过对TIGR的初步数据和质量控制数据的检查，发现一些“独特”基因在COL通道中产生高信号，表明它们与COL基因组中存在的基因具有高度核苷酸同源性。随后通过直接序列比较（Chris Mader和Robin Cline，TIGR，个人通信）证实了这一点。因此，阵列上存在但COL中缺失的基因总数为111个。因此，PFGRC阵列上2693个点中代表的ORF总数为2687个。每个目标在阵列上的相邻位置打印三份。打印图案和注释数据可以在http://pfgrc.tigr.org这些实验中使用的第二个阵列是基于COL、N315、Mu50、EMRSA-16（SANGER-252）、SANGER-476和8325基因组的定制Affymetrix基因芯片。N315基因间序列也有代表性，长度超过50个碱基，并且是唯一的金黄色葡萄球菌GenBank条目(16). 总的来说，基因芯片包含7723个金黄色葡萄球菌识别4066个ORFS、3343个基因间区域和69个外源控制探针集的限定词。

DNA分离、标记和杂交。

对于PFGRC阵列，如前所述分离基因组DNA(40). 使用菌株特异性引物，通过PCR检查所有DNA制剂的完整性(加拿大国家航空航天局，或地中海沿岸)（表​（表2）。2). 基因组DNA用EcoRI（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）消化完成，并使用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGENE）进行再验证。根据制造商的说明，使用Genisphere Array 350RP试剂盒（宾夕法尼亚州哈特菲尔德市Genisphere350RP），用Cy3或Cy5标记消化的DNA（1至2μg）。使用文塔纳发现系统杂交站（文塔纳医疗系统，亚利桑那州图森市）在55°C的温度下进行12小时的持续混合。随后，按照制造商的方案，在55°C下使用Cy3-和Cy5-标记的Genisphere树状大分子进行额外的2小时杂交，并在37°C下用2×SSC（1×SSC是0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）进行最终清洗。通过使用10个感兴趣菌株之一的Cy3标记DNA和COL的Cy-5标记DNA进行竞争性杂交，进行每个实验。此外，使用相反的荧光团重复针对UAMS-1、UAMS-601、RN6390和N315的实验，以排除杂交模式中的任何染料特异性差异。最后，我们将UAMS-1与COL的杂交共重复了四次，以评估我们结果的再现性。

为了与Affymetrix基因芯片杂交，金黄色葡萄球菌菌株在37°C的脑心灌注肉汤中隔夜培养，并充分通风。通过离心收获细胞，并将其重悬于0.5ml Tris-EDTA缓冲液（pH8.0）中。在FP120往复式振动筛（加利福尼亚州卡尔斯巴德Q-BIOgene）中，使用FastPrep DNA程序对细胞悬浮液进行裂解。然后，按照制造商关于细菌DNA的说明，使用DNeasy组织试剂盒分离基因组DNA（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）。对于DNA标记，将5μg纯化DNA在90°C下孵育3分钟，然后放入冰浴中，然后按照制造商的说明（加利福尼亚州圣克拉拉Affymetrix公司）进行标准DNA片段化和标记程序，以标记反义原核阵列的mRNA。

阵列扫描和分析。

混合PFGRC阵列使用Perkin-Elmer ScanArray 5000进行扫描，并使用ScanArray Express软件（马萨诸塞州波士顿市Perkin-E1mer）进行读取。使用ScanArray Express软件对原始荧光强度值进行背景校正，然后使用Lowess算法进行归一化。归一化值表示为试验应变强度与COL应变强度的比值。这些比率被导入Spotfire DecisionSite软件（Spotfire，萨默维尔，马萨诸塞州），用于图形可视化和进一步分析。使用平均值阈值加上阵列上所有空白点和控制点观察到的强度的一个标准偏差，对数据进行低光点信号强度过滤。COL通道归一化信号强度小于该值的斑点被排除在进一步分析之外。然而，来自MW2、N315和Mu50菌株的111个独特斑点没有受到这个阈值的影响，因为这些斑点在COL通道中的信号强度很低。

为了确定我们实验中“存在”与“不存在”或“发散”ORF的截止值，我们对每个序列进行了比较金黄色葡萄球菌这使我们能够将微阵列数据与BLAST比较的结果进行比较。具体而言，BLASTN用于比较PFGRC阵列上每个ORF的序列与Mu50、N315和MW2的基因组。这允许根据COL、Mu50、N315和MW2序列的同一性百分比对每个ORF进行分类。然后，将阵列上的每个ORF分类为存在（≥90%核苷酸序列一致性）、分散（70-90%核苷酸序列一致）、高度分散（≤70%核苷酸序列相同性）或不存在（根据40 bp的最小比对无命中）。在我们的分析中，随后将“缺席”和“高度分歧”类别合并到“缺席”标题下。使用此信息，根据归一化测试应变强度与归一化COL应变强度的比值确定以下截止值：“缺席”，比值<0.3；“发散”比≥0.3但<0.5；“现有”比率≥0.5。然而，由于对于非COL菌株的ORF，COL通道中的信号较低，因此对这些ORF的上述标准进行了修改，如下所示：“存在”比率≥2.0；“缺席”比率<2.0。根据基于BLAST和基于阵列的分类结果的一致性计算错误率（见结果）。

如前所述，对杂交Affymetrix基因芯片进行扫描(15). 通过将每个限定符（假定的ORF或基因间区域）的对数转换信号强度除以每个芯片的平均信号强度，将贴片到每个芯片上的元件的信号强度归一化，以说明加载错误和标记效率的差异。结果通过GeneSpring 6.0版（Silicon Genetics，Redwood，Calif.）和Spotfire Decision Site进行分析。根据每个元素的标准化信号强度，进行调整调用预测，以确定UAMS-1、UAMS-601和每个已排序的金黄色葡萄球菌如前所述的菌株(16). 使用该方法，每个测序菌株的约97%ORF被正确确定为缺失或存在。

分层聚类。

使用Spotfire Decision Site软件，利用PFGRC微阵列数据进行聚类。将所有CGH实验的一致“存在”、“不存在”和“发散”调用转换为整数，并使用相关相似性度量和平均值排序函数进行完全链接聚类。COL的调用基于上述微阵列的更新注释。通过使用GeneSpring 6.0版的Pearson相关性对所有样本进行Affymetrix基因芯片数据进行分层聚类，以生成一个树状图，同时比较给定菌株的每个限定符的标准化信号强度与所有分析菌株的同一限定符的信号强度。

用于验证微阵列数据的Southern杂交。

使用表中所示的引物，通过PCR生成Southern印迹的DNA探针​表2。2通过使用Roche DIG High Prime试剂盒（Roche，Basel，Switzerland）标记扩增的片段。基因组DNA制备用EcoRI或EcoRI和AluI消化完成(萨尔特和萨鲁斑点）。然后按照前面描述的方法转移、杂交和培养印迹(64).

UAMS-1和RN6390的比较基因组学。

RN6390是原型实验室菌株，我们实验室以前的实验已经证实RN6390和UAMS分离物之间存在重要差异(6，7). 为了研究这些差异的遗传基础，我们利用Affymetrix基因芯片的数据分析了UAMS-1和RN6390之间的基因组差异。我们选择将重点放在Affymetrix基因芯片上进行比较，因为这些阵列包括来自EMRSA-16的ORF，如上所述，这是与UAMS分离物最密切相关的测序菌株。排除了基因间区域的基因芯片限定符，也排除了那些对两个菌株结果不明确或注释信息不可用的限定符。在剩下的3543个限定词中，UAMS-1和RN6390中均存在2343个限定符（65.7%），而这两个菌株中均不存在677个限定词（19%）。其余523（14.8%）存在于一个菌株中，但不存在于另一个菌株。这523个ORF详见补充表S1和S2。这些基因中包括ORF，其编码的蛋白质属于COG（同源群簇）数据库定义的每个功能类别。然而，523个ORF中有296个仅被注释为编码假想蛋白质，在这些情况下不可能进行功能预测。在其余227个ORF中，有54个具有代谢或转运功能。另外38个与流动元素和致病岛相关，11个与药物或重金属耐药性相关。其余124个ORF被预测编码表面或分泌蛋白，包括毒素和外泌物(n个=102）或监管要素(n个= 22). 由于其中许多都是毒力因子，并且基于我们对肌肉骨骼感染发病机制的兴趣，我们选择关注涉及这些基因的差异，如下所述。

粘合剂。

这些实验中使用的PFGRC阵列包括与15个识别的粘附素基因相对应的斑点。不幸的是，胶原蛋白粘附素基因中国核协会不包括在内。自从中国核协会与毒力密切相关(8，49)，我们通过Southern印迹法评估其在我们的菌株中的存在。这个中国核协会该基因仅存在于UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16、MW2和SANGER-476中（数据未显示）。Affymetrix数据证实了这些结果，并与我们的层次聚类相对应（图。​（图1），1)，表明中国核协会事实上，may代表了整体遗传相关性的标记。PFGRC阵列上未显示的其他粘附素基因包括编码纤溶酶原、卵黄凝集素和血小板反应蛋白结合蛋白的基因。在PFGRC阵列中包含的粘附素基因中，编码聚集因子B的基因(clfB公司)通过微阵列分析，在10个菌株中有8个明确存在。然而，Southern杂交证实了clfB公司在所有10个应变中（图。​（图2）。2). 类似地，编码聚集因子A的基因(clfA公司)被微阵列分类为在N315和Mu50中不存在，但直接序列分析证实clfA公司在这两种菌株中都存在。这些结果与Affymetrix基因芯片的实验一致，该芯片包含三个clfA公司等位基因和四个clfB公司等位基因。更直接地说，用Affymetrix阵列进行的杂交证实了clfA公司和clfB公司在所有10个菌株中都存在。此外，发现RN6390、8325、COL、MW2和SANGER-476含有相同的clfA公司等位基因({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAB94629”，“term_id”：“21203930”，“term_text”：“BA B94628”}}BAB94629型)和Mu50/N315集群一样({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAB56973.1”，“term_id”：“14246580”，“term_text”：“BA B569731”}}文凭56973.1)和UAMS-1/UAMS-601/EMRSA-16簇（86.7%的氨基酸同一性｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“BAB41975”，“term_id”：“13700678”，“term_text”：“BAB41975”｝BAB41975年). 所有10株菌株也编码纤维蛋白原结合蛋白COL-SA1168；然而，在UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16中，纤维蛋白原结合前体相关蛋白（COL-SA1169）缺失或存在差异。

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图2。

用于阵列数据验证的Southern杂交。将从上述每条线所示菌株中分离出的基因组DNA与对应于每个面板右侧所示基因的探针杂交。这个萨鲁这些实验中使用的探针还包括一个对应于萨尔特，而萨尔特探针仅限于萨尔特自身。

这个特别提款权基因座编码的蛋白质与clfA公司和clfB公司具体而言，SdrC、SdrD和SdrE包含可变数量的丝氨酸天冬氨酸重复序列，其也存在于ClfA和ClfB中(31). 根据PFGRC阵列的结果，软件无线电控制在所有菌株中都存在，而sdrD公司除UAMS-1和EMRSA-16外，所有菌株中均存在。然而，Affymetrix数据表明软件无线电控制和sdrD公司在所有10个菌株中都存在。这表明UAMS-1和EMRSA-16编码不同形式的sdrD公司通过与其他菌株的比较。与此相反，新加坡存托凭证根据PFGRC和Affymetrix微阵列的结果，RN6390、8325和UAMS-1中不存在。Affymetrix阵列还包括英国广播公司我们的杂交数据表明，包括UAMS-1在内的所有菌株中都存在这种变异。这表明两者都是新加坡存托凭证和英国广播公司即使不是大多数菌株，也存在于一些菌株中，这与Peacock等人的结果不一致(49)，他得出结论新加坡存托凭证和英国广播公司是同一基因座的不同等位基因。为了解决这个问题，我们对已排序的金黄色葡萄球菌菌株。这证实了ORF周围新加坡存托凭证在所有7个菌株中都得到了保存。其中五种（COL、MW2、SANGER-476、Mu50和N315）含有ORF，具有较高的同一性（95%至99%）新加坡存托凭证相反，EMRSA-16中相应的ORF与英国广播公司只有87%的人认同新加坡存托凭证使用英国广播公司-Peacock等人描述的特异性引物(49)建议UAMS-601也对英国广播公司等位基因，这随后通过DNA测序证实（数据未显示）。鉴于报告显示英国广播公司因此结合骨唾液蛋白的能力有助于肌肉骨骼感染的发病机制(55). 然而，PCR分析也表明英国广播公司UAMS-1中没有，或者与EMRSA-16和UAMS-601相比差异很大。BLAST分析还表明，虽然8325编码软件无线电控制和sdrD公司，它不对新加坡存托凭证或英国广播公司等位基因。PCR分析表明，RN6390也是如此，这是意料之中的，因为RN6390是从8235中衍生出的8325-4菌株。

皮科克等人(49)还发现fnbA公司编码纤维连接蛋白结合蛋白，在侵袭性菌株中更常见。这是两个非常相似的基因之一（另一个被指定为fnbB）在这两种菌株中，在金黄色葡萄球菌染色体。事实上fnbA公司，但不是fnbB公司，在侵袭性菌株中更常见，因此表明这些菌株不编码fnbB公司虽然两株菌株（UAMS-601和SANGER-476）最初对fnbA公司，随后PCR证实fnbA公司在所有10个菌株中都存在（图。​（图3）。三). 与此相反，fnbB公司在UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16、SANGER-476和Mu50中被微阵列分类为缺失。TIGR综合微生物资源分析表明，Mu50确实含有fnbB公司（NT02SA2496）；然而，Mu50中存在的特定等位基因在阵列上没有表示。直接序列分析还表明，MW2和N315的基因与fnbB公司分别是。因此，我们采用了基于PCR的方法来确认fnbB公司在每个菌株中，使用设计用于扩增特定于fnbB公司等位基因（表​（表2）。2). 通过PCR，fnbB公司存在于8325、RN6390、COL、MW2和SANGER-476（图。​（图3）。三). Mu50和N315也有阳性PCR，尽管扩增区域较大。然而，fnbB公司根据PCR结果（图。​（图3），三)以及EMRSA-16的序列分析。Affymetrix数据证实了这些结果，因为除UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16之外的所有菌株都含有三种菌株中的一种fnbB公司Affymetrix基因芯片上的等位基因。

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图3。

PCR验证fnbA公司和fnbB公司从所示菌株中分离出的基因组DNA被用作PCR模板，其引物可扩增fnbA公司或fnbB公司UAMS-1、COL和N315的观察结果与文中描述的其他七种菌株的观察结果具有代表性。

其他粘附素基因在所有菌株中都是保守的，包括编码蛋白A的菌株(水疗中心)，弹性蛋白结合蛋白(ebpS公司)分泌性细胞外基质和血浆结合蛋白（SA0858），以及细胞内粘附(独立分量分析)轨迹。阵列上还包括几个额外的LPXTG基序细胞壁锚定域蛋白，其中大多数在所有菌株中都是保守的（表​（表3）。三). 然而，根据我们的阵列数据，UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16、MW2和SANGER-476中缺少LPXTG基序蛋白之一SA2505。有趣的是，在我们的微量滴定板试验中，这些相同的菌株形成了更坚固的生物膜（图。​（图4）。4). SA2505编码请同源物，以及Savolainen等人(60)报告了请与体外细菌粘附减少有关。罗氏等人(54)还描述了含有LPXTG的基因(安全气囊)它还编码请同源，BLAST搜索证实SA2505和安全气囊相同（数据未显示）。罗氏等人(53)随后报告，MW2和SANGER-476确实编码安全气囊但与其他菌株相比，它是一个高度分化的等位基因。这两种菌株形成了一层坚固的生物膜，与缺乏安全气囊，这表明存在或不存在安全气囊与观察到的生物膜表型或安全气囊在功能上与sasG公司其他菌株编码的基因。我们还发现，那些形成牢固生物膜的菌株都是中国核协会阳性血清型和荚膜型8（图。​（图44).

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图4。

生物膜形成的微滴度平板检测。生物膜的形成按照Beenken等人的描述进行了评估(5). 结果显示为560 nm处的吸光度（A₅₆₀)并表示九个独立实验的平均值和标准误差。菌株U929（UAMS-1萨拉突变体）作为阴性对照。的分布中国核协会和sasG公司通过微阵列结果、Southern杂交和BLAST搜索确认了10个菌株中的每一个。根据所有菌株的微阵列结果确定衣壳血清型，并通过血清分型分析在UAMS-1中确认（Chia Y.Lee，个人通讯）。名称“d”表示MW2和SANGER-476包含不同形式的安全气囊(53).

外酶。

在所检测的所有菌株中，编码外酶的大量基因是保守的。然而，我们确实观察到一些差异，这些差异与我们的微阵列实验定义的层次聚类密切相关。该组中单个基因的特征高度依赖于所使用的特定阵列。例如，根据PFGRC阵列获得的结果，丝氨酸蛋白酶基因splA公司和splB（点位B）在致病性UAMS菌株和EMRSA-16中不存在，但在所有其他菌株中存在（表​（表4）。4). 这些基因是先前特征差异区域（RD1）的一部分，该区域还编码其他六个丝氨酸蛋白酶基因、两个杀白细胞素基因和细菌素合成基因（见下文）。Affymetrix数据证实了splA公司Affymetrix阵列数据分析表明，存在一个基因，其氨基酸序列与splB（点位B）MW2基因（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“BAB95619”，“term_id”：“21204924”，“term_text”：“BA B95618”}}BAB95619型)在UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16中，表明这些菌株含有splB（点位B）基因。丝氨酸蛋白酶基因花键在SANGER-476、Mu50、MW2和N315中不存在，但在所有其他菌株中存在。有趣的是花键该基因也是RD1的一部分，强调菌株依赖性差异发生在这些差异较大的区域内，甚至在基因簇内。

锌金属蛋白酶溶金蛋白基因(金)PFGRC微阵列将UAMS-1和EMRSA-16分为发散型。这有点令人惊讶，因为Karlsson等人(32)分析了92个菌株，发现金黄色葡萄球菌蛋白酶基因，包括极光，存在于所有菌株中，包括蛋白酶阴性表型的菌株。基于此，我们扩增了金基因（表​（表2）2)并将其用作所有10个菌株基因组DNA的Southern杂交探针。结果表明，UAMS-1和EMRSA-16都对金基因（图。​（图2）。2). 这表明，与用于生成PFGRC阵列的菌株相比，这些菌株编码一个等位基因变体。事实上，Sabat等人(57)之前报告存在金等位基因变体，Affymetrix基因芯片包括第二个金UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16中确实存在的等位基因。同样，基于PFGRC阵列，凝固酶基因（COL-SA0209）在UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16和SANGER-476中被分类为缺失，其中仅包括一个coa公司等位基因。相比之下，Affymetrix基因芯片包括17种不同的coa公司等位基因，其中四个共同解释了coa公司我们检测的所有10个菌株的等位基因。The distribution ofcoa公司等位基因与我们的流行病学聚类数据相关，四个主要聚类（RN6390/8325/COL、N315/Mu50、MW2/SANGER-476和UAMS-1/UAMS-601/EMRSA-16）中的每一个都具有不同的coa公司等位基因（数据未显示）。PFGRC和/或Affymetrix阵列上显示的其他外酶是保守的，包括半胱氨酸蛋白酶sspA到-C，磷脂酶C(可编程控制器)，脂肪酶(嘴唇和嘿)，透明质酸酶(为什么)，葡萄球菌分泌抗原(南非国家安全局)，弹性蛋白酶(环境保护局)和热核酶(核子).

毒素。

毒素基因的遗传分析因大量变异的出现而变得复杂，这些变异彼此具有相当大的同源性(42). 四种肠毒素ORF(seb、sei、ent和肠毒素家族蛋白的ORF）表示在这些实验中使用的版本1 PFGRC阵列上。Affymetrix基因芯片包括代表19个肠毒素基因的探针集，其中许多基因由多个等位基因代表。我们发现只有COL编码塞布，如PFGRC阵列和Affymetrix基因芯片上所示（表​（表5）。5). 两者都有软件工程研究所（COL-SA0887）和耳鼻喉科根据PFGRC阵列，（COL-SA0886）仅存在于MW2、SANGER-476和COL中。然而，Affymetrix阵列还包括第二个等位基因软件工程研究所UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16、Mu50和N315中存在的（N315-SA1646）。搜索TIGR综合微生物资源数据库显示，MW2中与SEI同源性最高的蛋白质被命名为SEG2。同样，MW2中与ENT同源性最高的蛋白质被指定为SEK。因此，尚不清楚我们的微阵列分析是否未能识别编码两种抗原型肠毒素的基因，或者注释是否完全不一致。

Affymetrix阵列包括肠毒素H基因(塞赫)根据与COL、N315、Mu50、8325和EMRSA-16基因组的比较，先前报告仅在MW2中存在(2). Southern blotting和Affymetrix数据均表明seh公司SANGER-476（图。​（图2）。2). 这与我们链接MW2和SANGER-476（图。​（图1）1)并建议塞赫可能与社区获得的分离物特别相关。这个经济特区该基因也包含在Affymetrix阵列中，但令人惊讶的是，根据Affymotrix算法，没有预测到任何菌株包含该基因。重要的是，经济特区是皮科克等人（Peacock et al(49)发现更多与侵袭性菌株相关。因此，我们分析了经济特区通过Southern杂交发现该基因存在于UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16、Mu50和N315中（图。​（图2）。2). 与…对比西，西因此可能对医院获得的分离株更具特异性。Affymetrix阵列中包括的其他肠毒素基因的分布如表所示​表5；5; 然而，由于这些基因之间有相当大的同源性，基于微阵列的方法不太可能解释定义抗原特异性的微小序列差异。在这方面，多重PCR方法可能更适合(41，42).

PFGRC阵列上有11个类外毒素ORF。与肠毒素基因类似，外毒素样(设置)的基因金黄色葡萄球菌也有相当大的同源性和令人困惑的命名法。PFGRC微阵列上这些基因的注释也令人困惑。例如，1.0版PFGRC阵列上的三个ORF被描述为编码外毒素3（COL-SA0468、COL-SA0778和COL-SA1180）。然而，SA0468和SA0478的产物分别与N315的外毒素6和外毒素15关系最密切。同样，两个ORF（COL-SA0469和COL-SA1178）被描述为编码外毒素2，其中一个ORF的产物（SA0469）与N315的外毒素7同源。外毒素样蛋白基因设置13和设置14与…同源设置5和设置4分别为COL。来自此类同源基因的微阵列数据可能会使解释复杂化；然而，外毒素样基因1、2、4、6、8、9、14和15在UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16中均被PFGRC微阵列分类为缺失或有差异。然而，Affymetrix基因芯片比PFGRC阵列更全面，总共包括25个外毒素样基因。其中一些包含多个等位基因，并且在UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16中存在外毒素样基因1、2和4的等位基因。考虑到这些基因产物之间的功能相似性以及每个菌株中都存在多个外毒素样基因，这些基因型差异很可能是表型透明的，仅代表等位基因变异。更直接地说，根据我们对肠毒素和外毒素样基因的数据，这些实验中检测的所有菌株似乎都有能力产生至少一种超抗原。与肠毒素基因一样，基于PCR的方法可能更有效地准确确定是否存在特异性外毒素样等位基因。

编码去角质毒素A的基因(埃塔)和B(欧洲贸易银行)不存在于COL中，也不存在于1.0版PFGRC阵列中。两者都出现在Affymetrix基因芯片上，我们的杂交实验表明两者都没有埃塔或欧洲贸易银行在所研究的10个菌株中都存在。然而，一种基因（COL-SA1184）将一种氨基酸同源性为80%的蛋白质编码为鬣狗链球菌所有菌株中都存在被描述为剥落毒素的基因。该基因之前在COL基因组（和PFGRC阵列）中被错误地指定为剥落毒素A基因，但该指定后来被更正。

金黄色葡萄球菌还可能编码几种双组分白细胞毒素的基因，包括编码潘顿-瓦伦丁白细胞调素（PVL）、γ-溶血素和卢克D/E这一点很重要，因为白细胞毒素的产生与一些特定的疾病表现有关，包括危及生命的肺炎(25，36). PFGRC阵列包含对应于德国卢克和γ溶血素，但不是PVL基因。PVL编码基因(lukF-光伏和lukS-PV阀)包含在Affymetrix阵列中，仅出现在MW2中。这与之前将PVL基因与社区获得的分离物联系起来的报告一致(14，25). 编码γ溶血素、组分A和阵列上包含的其他几种假定溶血素的基因在所有10个菌株中都存在。然而，德国卢克在UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16中被分类为不存在，随后通过Southern印迹法证实了这一点（图。​（图2）。2). 考虑到这一点，这并不奇怪卢克D和卢克E包含在RD1上(20)，其中包含UAMS菌株和EMRSA-16中也缺失的其他基因（见上文）。然而，如上所述金黄色葡萄球菌毒力因子使得很难预测这些基因的缺失是否会对这些菌株的表型产生重大影响。

值得注意的是，编码中毒性休克综合征毒素1的基因(总悬浮时间)未包含在PFGRC微阵列中。然而，Affymetrix数据显示，该基因存在于UAMS-1、UAMS-601、N315和Mu50中，但不存在于EMRSA-16中。这是UAMS分离株和EMRSA-16之间观察到的少数差异之一。

监管要素。

中的调节电路金黄色葡萄球菌复杂且涉及许多交互元素。其中最显著的是葡萄球菌辅助调节因子(萨拉)和辅助基因调节器(农业土地储备)都与毒力有关(7，10). 然而，最近的报告描述了许多其他基因座（表​（表6），6)，其中大多数似乎通过调节萨拉和/或agr公司(9，45). 这个农业土地储备已知该基因座在核苷酸序列上具有菌株依赖性差异，特别是在农业部和的特定区域agrB公司和农业资源中心，这些差异定义了农业土地储备子类型(29). 重要的是，这些亚型也具有功能意义，因为农业土地储备一组基因座可能抑制agr公司在另一组中的响应(29). 与这些观察结果一致，我们发现agrB公司和农业资源中心通过PFGRC微阵列分析，将多个菌株的基因分为发散型或缺失型。所有农业土地储备基因被分类为存在于UAMS-1、RN6390和8325中，这可能表明这些菌株共享相同的基因农业土地储备亚型为COL，而其他菌株代表不同的组。然而，对于UAMS-1，四个重复实验中有两个给出了不明确的结果农业资源中心基因（SA2025）和Affymetrix基因芯片实验结果表明，UAMS-1中不存在SA2025（数据未显示）。因为COL是农业资源中心I型，这与我们之前的一致农业土地储备子组类型数据表明UAMS-1和UAMS-601农业资源中心III型(6). Affymetrix基因芯片比PFGRC阵列更全面农业土地储备基因座，因为它们包括四个主要基因中每一个的代表性等位基因农业土地储备子组。我们发现Affymetrix数据在预测方面是正确的农业土地储备亚型，因为它与通过直接序列比较进行的亚组划分相同（图。​（图11).

全球调节因子SarA及其几个同源物（SarH1[SarS]、SarR和SarV）在所有菌株中都是保守的（表​（表6）。6). 然而，UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16都缺乏萨尔特和萨鲁基于微阵列分析和Southern杂交的基因（图。​（图2）。2). 通过微阵列分析，UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16编码TRAP的基因也为阴性（4）。Southern杂交证实了这些结果，但当膜过度暴露时，在所有三个菌株中都观察到TRAP的微弱杂交信号（数据未显示）。这表明UAMS-1、UAMS-601和EMRSA-16也不编码陷阱或编码一种发散形式。Gilot等人(26)已描述陷阱与针对农业土地储备和Gov等人(27)最近报道，EMRSA-16（SANGER-252）实际上编码了一种高度分化的陷阱与RN6390相比。基于此，我们设计了对应于陷阱EMRSA-16中存在的变体，经PCR和DNA测序证实，UAMS-1和UAMS-601均编码陷阱变量与EMRSA-16相同（未显示数据）。

大多数其他公认的调节成分在所有菌株中都是保守的。这包括rot、yyc、arl、sae、lrg、vra、svr、和开关磁阻继电器阵列上还显示了几个假定转录调控因子家族，其中大多数也在所有菌株中保守（表​（表6）。6). 然而，发现了一些菌株特异性差异。例如，COL-SA0072和COL-SA004是LysR转录调控因子家族的成员，这两个ORF在UAMS-1、UAMS-601、EMRSA-16、Mu50和N315中均不存在。转录调节因子的MarR和GntR家族也出现了类似的模式。例如，COL-SA2524编码MarR家族的转录调节器，并且仅存在于COL、8325和RN6390中。类似地，SA0091编码GntR家族的转录调节因子，并且仅存在于COL、8325、RN6390、Mu50和N315中（图。​（图2）。2). 转录调控因子GntR和MarR家族的其他成员在阵列上有代表性，但在所有菌株中都是保守的。

这项工作得到了国家变态反应和传染病研究所（NIAID）的R01-AI043356和M.S.S.以及NIAID赞助的基因组研究所病原体功能基因组资源中心的支持。

我们感谢Robin Cline、Chris Mader、Joseph Gilbert和Scott Peterson对PFGRC阵列的技术支持。NIAID赞助的抗微生物网络中菌株的可用性金黄色葡萄球菌我们也非常感谢。我们还感谢UAMS微阵列核心设施的技术支持，UAMS核心测序设施DNA测序的Alan Gies，Mark Enright提供所有测序菌株的MLST图谱，以及Barry Kreiswirth提供的水疗中心所有测序菌株的类型和用于生成水疗中心UAMS-1、UAMS-601和RN6390序列数据的配置文件。