FoxP家族成员间的蛋白质相互作用及其对两个靶基因的调控，VLDLR公司和CNTNAP2公司斑马雀歌唱系统

共免疫沉淀（Co-IP）

根据制造商的协议，使用Dynabeads®蛋白G（Invitrogen，目录号100.04D）进行了共免疫沉淀（Co-IP），并进行了如下更改。我们首先在室温下培养抗体-Dynabeads混合物15分钟（有关抗体浓度，请参阅表​表1）。1). 随后，我们在4°C下旋转培养蛋白质提取物和抗体包被的Dynabeads混合物30分钟。我们用20μl洗脱缓冲液（50 mM Glycin pH 2.8）洗脱，在第二轮免疫沉淀之前，我们通过添加4.8μl 1 M TrisHCl pH 7.5中和洗脱缓冲，然后添加洗涤缓冲液，使总体积达到200μl。洗脱后，我们添加15μl 2×Laemmli，并制备变性条件下的裂解物。

Western Blots与检测

用M-PER（Thermo Scientific，Prod#78505）裂解培养基在冰上处理转基因HeK293细胞15分钟。将提取物在1500 g下离心10分钟，上清液在−80°C下保存，直至使用。通过SDS-PAGE（8%–10%）分离细胞提取物和co-IP’ed蛋白，转移到聚偏氟乙烯膜（美国印第安纳波利斯州罗氏市），并用Roti-Impunoblock在4°C下封闭2小时或过夜。然后将膜与所需抗体孵育（表​（表1）1)在4°C下过夜。随后将膜洗涤3×PBS/0.1%Tween 20，然后与在适当的动物中培养的HRP缀合的抗体（1:2000稀释；Amersham Biosciences）再孵育30分钟。使用HRP的ECL检测系统（Perkin Elmer，Boston，MA，USA）在X射线胶片上检测结合。胶片是在Curix 60显影机（德国科隆Agfa）上冲洗的。在第一个检测膜在PBS/0.1%吐温中清洗5分钟后，然后在0.5 NaOH中清洗10分钟，再在PBS/0.1%吐温中洗涤5分钟，然后再次封闭，并用第二/三个一级抗体检测，如前所述。

脑解剖与微生物学

在牺牲了这只鸟之后，前脑很快被解剖，大脑半球分离，嵌入TissueTec并冷冻在干冰上。半球在−80°C下储存，直到进一步加工。如前所述，对X区微活检进行穿孔（Olias等人。，2014; Adam等人。，2016). 在我们确认了所需大脑区域的正确靶向后，从同一动物的混合微生物活组织中提取蛋白质（Olias等人。，2014; Adam等人。，2016).

荧光素酶启动子报告分析

对于SV40，我们在含有青霉素链霉素（Lonza-DE17-602E，10 UI/ml）的200μl DMEM培养基（GIBCO）中接种约30000个HeLa细胞，每孔96 well白色平板（Nunclon，Cat.No.136101，丹麦）。按照制造商的方案，使用Lipofectamine™2000（Invitrogen）进行转染。简单地说，在播种板在37°C和5%CO下培养24小时后₂为了进行转染，在每个孔中添加50μl转染混合物之前，将培养基与100μl无抗生素培养基交换。转染组合由两部分组成：（a）25μl OptiMEM（GIBCO），含有30 ng pGL4.13（已知受FoxP亚家族成员调节的SV40启动子驱动的荧光素酶基因）和30ng pGL4.75（由不受FoxP亚家族成员影响的CMV启动子驱动的Renilla基因，用于表达变化的标准化）和250ng总载体，对于每个孔过度表达不同的FoxP；和（b）1μl Lipofectamine™2000（Invitrogen）溶于25μl OptiMEM中，在室温下预混合5分钟。结合（a）和（b。培养4-6小时后，我们将培养基更换为75μl含抗生素的培养基，并在37°C的CO中再培养48小时₂孵化器。

对于VLDLR公司和碳纳米管2我们使用HeK293细胞，并按照前面所述进行荧光素酶分析（Adam等人。，2016). 根据启动子的不同，我们在独立转染后进行了4到7次荧光素酶分析。在每次分析中，我们使用了三份，例如，三个孔含有相同的转染试剂和细胞数量。使用三份的平均值进行统计分析。每个平板在ELISA阅读器中测量一次。

我们在Elisa平板阅读器（Tecan，GENios；瑞士）中使用双球荧光素酶试剂盒（Promega）按照制造商的协议测量发光。从所有其他井中减去未转染井的平均背景。我们将荧光素酶结果表示为根据4–7个独立分析的标准化值计算的平均相对光单位（荧光素素酶RLU/Renilla RLU）。

VLDLR和CNTNAP2启动子的克隆

如前所述克隆pGL4-VLDLR启动子（Adam等人。，2016). 以成年鸟类血液样本DNA为模板，克隆了CNTNAP2启动子，并用正向引物5′-TTGCTCATTGATTGCAGAA-3′和反向引物5’-CCTGCTTTCCACTTGG-3′用高保真Taq（Fermentas K0191）进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上进行检测，用Nucleo Spin gel和PCR Cleanup（德国Macherey-Nagel，参考号740609.250）从核苷酸中清除，并根据制造商的协议克隆到零钝PCR克隆试剂盒（Invitrogen）的pCR4Blunt-TOPO载体中。对三个独立的CNTNAP2克隆的插入物进行完全测序，以确认CNTNAP1启动子区域的序列。斑纹雀CNTNAP2序列存放于GenBank，注册号NCBI{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“KX943238”，“term_id”：“1199277782”，“term_text”：“kX943228”}}肯尼亚先令943238然后，我们使用正向引物5′-GAGGCTAGCTGCCCTCATGTGATGCAGAA-3′和反向引物5′-GAGGCTCTCTCTTCTCCATTTGG-3′，并将PCR产物亚克隆到pGL4.13载体的NheI和StuI位点，以产生用于萤光素酶测定的pGL4-CNTNAP2载体。

我们用CpG绘图工具鉴定了CNTNAP2启动子中的假定CpG岛²我们使用CpG岛计算器计算了CNTNAP2启动子区GC富集区的GC百分比^三.

HeK293细胞的过度表达与转染

先前生成了标记有FLAG或V5的FoxP1/2/4的过表达载体（Haesler等人。，2004; Mendoza等人。，2015). 为了获得Myc标记的FoxP2，我们以FoxP2-V5标记序列为模板，使用正向引物5′-CGCGGATCCCCACCATGAGAATCTGCGACAG-3′和反向引物5’-GCGGAATTCCCTACATCCTTCTGAGATTTTGTTTCCAGATCTCAGATAAAGGCTC-3′，将其克隆到pcDNA3，1+载体（Invitrogen）中。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

根据制造商的协议，使用Protino Ni-NTA琼脂糖（德国马切里·纳格尔，745400.25）纯化电泳迁移率变化分析（EMSA）用的蛋白质。使用BCA1（Sigma）定量蛋白质。如前所述，使用VLDLR所述的寡核苷酸进行EMSA分析（Adam等人。，2016). 我们用于CNTNAP2的寡核苷酸是5′-TATTATTATTTATTTTT公司GTACTCTACTCCTTGT公司TATTGAT公司ACT-3′（粗体显示包含ATTT核心序列的FoxP结合位点）。

FoxP1/2/4抗体具有特异性

为了检测FoxP1/2/4蛋白是否也在斑马鱼前脑神经元中相互作用，我们首先通过在HeK293细胞中过表达FoxP1/2/4斑马鱼蛋白并进行Western Blots来鉴定其商业抗体。在每种情况下，特定抗体显示约80kDa分子量的条带。每个抗体只能识别一个FoxP（图2A–C型，顶部面板），而不是其他两个。图c中FoxP1和FoxP2泳道中的微弱条带与FoxP4抗体对FoxP1和FoxP2蛋白的交叉反应性不对应，FoxP1和FoxP2蛋白具有略微不同的分子量，如在FLAG标记的版本中所见（中间图）。随后用FLAG（和肌动蛋白抗体，下表）进行的检测也表明，在蛋白裂解物中存在类似数量的过表达蛋白（图2A–C型). 从这些结果中，我们得出结论，抗体对不同的斑马雀FoxP具有特异性。

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图2

Western blots通过检测转染过表达载体（携带空载体（E.V.）或三种FLAG-标记的FoxP蛋白）的HeK293细胞提取物中的一种FoxP蛋白质来证明不同FoxP抗体的特异性蛋白质通过SDS-PAGE进行分解，转移到硝化纤维素中，并首先用抗FoxP1检测（顶部面板）（A），或防FoxP2（B），或反FoxP4（C）并依次检测FLAG/b-actin抗体作为负荷控制（中间面板）（A–C）底部面板显示样品中肌动蛋白的检测，作为加载控制。在所有情况下，抗体的特异性从预期车道（*）的单个带中明显可见。

FoxP1/2/4斑纹雀脑蛋白质异源二聚体

我们使用上述特定抗体对成年雄性斑马雀前脑的蛋白裂解物进行了co-IP分析。FoxP1单克隆抗体无法降低非变性的天然脑蛋白（数据未显示），因此我们使用FoxP2和FoxP4多克隆抗体来降低蛋白复合物，并使用所有三种抗体进行Western blot检测。作为阴性对照，我们使用了同一物种的IgG抗体，在该物种中，特异性FoxP抗体升高。在使用FoxP2或FoxP4抗体进行IP后，我们检测到共IP'ed FoxP1（图3A、B). 使用FoxP2进行IP后，我们检测到共同IP的FoxP4（图​（图3C）。3厘米). 相反，IgG对照组没有沉淀出预期大小的蛋白质（图3A–C级). 从这些结果中我们得出结论，FoxP1/2/4在前脑神经元中形成异二聚体体内据我们所知，这是首次报告显示FoxP1/2/4蛋白可以在大脑中形成异二聚体。

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图3

FoxP1/2/4可以在大脑中异构化三个面板描述了成年斑马雀大脑核蛋白提取物与抗FoxP2的典型联合免疫沉淀实验（A、C），抗FoxP4（B），或非特异性IgG（A–C）在非变性条件下。蛋白质通过SDS-PAGE溶解，转移到硝化纤维素中，并通过抗FoxP1的顺序免疫印迹分析(一个-左侧和B类-右，西部）或反福克斯P2(A、 C类左翼西部片），或反FoxP4(B、 C右侧面板）。在所有病例中，异源二聚体与来自整个前脑裂解物的特异性抗体共同免疫沉淀，在IgG对照中未检测到相同大小的信号，表明FoxP蛋白相互作用。

FoxP1/2/4斑纹雀蛋白质在细胞系中形成寡聚体

由于X区和周围纹状体中大多数FoxP表达细胞表达FoxP1/2/4（Mendoza等人。，2015)并且由于已知FOXP3能够在细胞系中同源低聚和异源缔合（Li等人。，2007; Song等人。，2012)，我们想评估所有三种神经表达的FoxP蛋白是否可以结合在一个蛋白复合物中。为了测试这一点，我们从与全长FoxP1-FLAG、FoxP2-Myc和FoxP4-V5标记的斑马雀蛋白共转染的HeK293细胞裂解物中进行了双重co-IP（图​（图4A4A级原理图）。如果FoxP1/2/4在双重co-IP后不能在复合物中异相关，我们应该只检测免疫沉淀的两个蛋白，但如果它们在复合物内异相关，则我们应该能够检测所有三个FoxP。我们首先用Myc进行免疫沉淀，以降低FoxP2和所有与之结合的蛋白质。在第一次免疫沉淀后，我们发现所有三种蛋白质都有协同IP'ed（图​（图4B）。第4页). 事实上，我们在免疫沉淀Myc-taggd FoxP2后检测到FoxP1-FLAG和FoxP4-V5，这可能是因为用FoxP1或FoxP4拉下了FoxP2的异倍体。或者，FoxP1/2/4可以通过免疫沉淀Myc-tagged FoxP2同时被拉下。为了评估这一点，在第一次IP之后，进行第二次带FLAG的顺序IP，以检测FoxP1-FLAG。在第二次免疫沉淀后，我们不仅检测到FoxP1-FLAG，还检测到共IP'ed FoxP4-V5（图​（图4，4，上部螺栓）。

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图4

FoxP1/2/4斑纹雀蛋白质可以寡聚 在体外.（A）IP中FoxP1/2/4的二聚体（左面板）或多聚体（右面板）的可能组合示意图。（B）用编码FoxP1 FLAG标记的、FoxP2 Myc标记的和FoxP4 V5标记的蛋白质的表达载体的组合转染的HeK293细胞的双重免疫沉淀的蛋白质印迹，揭示了FoxP1/2/4多聚体。Western blot的左面板从左到右显示，转染所有三种蛋白后，第一条通道中的输入蛋白提取物，第二条通道显示免疫沉淀的FoxP2-Myc（下面板，星号）与免疫沉淀的共同FoxP1-FLAG和FoxP4-V5（上面板，星牌）。第3栏显示使用IgG（兔子）时没有免疫沉淀蛋白，第4栏显示FoxP1-FLAG（上面板，星号）以及共同免疫的FoxP4和FoxP2（上面板和下面板，星牌）的后续免疫沉淀。在右侧的Western blot中，第一条通道再次是输入，然后是通道2和3中第一次用Myc和IgG兔免疫沉淀的上清液，然后是随后用FLAG免疫沉淀的上层清液。

并非所有蛋白质都从第一个上清液中耗尽，一个可能的解释是检测FoxP2-Myc的Myc抗体没有沉淀FoxP1同源二聚体和FoxP4同源二聚体。上清液中残留的FoxP2还表明，并非所有的FoxP2都是由Myc抗体沉淀的，可能是因为抗体浓度不足，无法耗尽所有Fox P2蛋白及其相关的相互作用伙伴。在第二个上清液中进行第二次免疫沉淀后，未检测到蛋白（图​（图4，4，S2）。

总之，这些数据表明FoxP1/2/4可以形成一个包含所有三种蛋白质的复合物，这一结果以前从未报道过。除了这种异构化，我们还发现所有FoxP的均聚和异构化（图​（图1、，1,​,3三).

FoxP1/2/4斑纹雀蛋白质寡聚在体内

为了评估FoxP1/2/4是否能在斑马雀鸣叫系统中异源低聚化，我们使用X区核蛋白提取物。双IP使用特异性抗体检测到共同免疫沉淀组分中的三种蛋白，表明FoxP1/2/4也能异源结合体内在X区（图​（图55).

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图5

FoxP1/2/4的异构化发生在大脑中的鸣叫核X区.对X区微生物活组织中的核蛋白提取物进行共免疫沉淀。将蛋白提取物分成等量。一种用FoxP2抗体免疫沉淀，随后用FoxP4抗体免疫，另一半用兔IgG免疫沉淀两次。免疫沉淀蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解，转移到硝酸纤维素上，并用FoxP2和FoxP4或FoxP1抗体进行顺序免疫印迹分析。

FoxP1/2/4斑马芬奇蛋白在荧光素酶启动子报告子分析中抑制SV40启动子

我们评估了斑纹雀FoxP蛋白的同型和异型相互作用是否导致不同的调节活性。为此，我们使用SV40启动子驱动荧光素酶(萤火虫合成蛋白质）。SV40启动子有一个假定的核心一致序列用于结合（T收件人RT）人类和小鼠Foxp1/2/4（Wang等人。，2003; Vernes等人。，2006). 对于人类和小鼠蛋白质，荧光素酶启动子报告分析显示，每个FoxP都可以单独抑制SV40启动子（Wang等人。，2003; Li等人。，2004年a; Vernes等人。，2006). 同样，我们发现斑马雀FoxP蛋白在HeLa细胞中单独表达时，在SV40启动子的控制下显著抑制转录活性（图​（图6；6; 单向方差分析；F类= 28.79; DF=7；n个= 8;第页< 0.0001; Tukey的多重比较测试；与空矢量比较：FoxP1第页<0.0001，FoxP2第页=0.013和FoxP4第页<0.0001），与小鼠和人类FOXP1/2/4的报告范围相同。此外，与哺乳动物同源物一样，斑马雀FoxP4抑制转录的能力强于FoxP1或FoxP2，而Fox P2是SV40启动子的弱阻遏物（Wang等人。，2003; Li等人。，2004年a; Vernes等人。，2006). 表达不同FoxP亚家族成员组合的细胞也表现出SV40启动子的显著抑制（与空载体相比：FoxP1/2第页< 0.0001; 福克斯P1/4第页< 0.0001; 福克斯P2/4第页<0.0001和FoxP1/2/4第页=0.0001）。单独表达FoxP1或FoxP4的细胞之间或在任何测试组合中均无显著差异。我们确实观察到，与单独表达FoxP2的细胞相比，与另一FoxP亚家族成员联合表达FoxP的细胞中存在更强的转录抑制（与单独表达FoxP2相比：FoxP1/2第页= 0.016; 福克斯P2/4第页=0.0005和FoxP1/2/4第页< 0.0001). 然而，我们不能排除FoxP同源二聚体在这些细胞中的形成和作用。综上所述，与与FoxP1和/或FoxP4共表达的细胞相比，仅表达FoxP2的细胞中的FoxP靶基因可能受到较少的强烈调控。

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图6

荧光素酶分析显示SV40启动子上FoxP1/2/4蛋白不同组合的反式激活特性FoxP1/2/4及其组合通过SV40启动子中的特定DNA结合位点显著抑制pGL4.13启动子转录活性。从所有组合到空向量控制的显著性水平由星星表示**第页< 0.001–0.01; ***第页< 0.001. 单向方差分析；F类= 28.79; DF=7；n个= 8; 其次是Tukey的多重比较测试；条形图显示了八种条件中每种条件下五种独立转染的平均值±SEM的平均值，以荧光素酶/肾素比率（RLU）表示，并通过pGL4.75肾素荧光素酶活性校正转染。1x=每孔125 ng过表达向量，2x=每孔250 ng过表达矢量。用空表达载体（pcDNA3.1）获得对照转染值。

VLDLR公司是福克斯P2和福克斯P1/4的直接目标吗

为了探索FoxP蛋白是否不仅调节SV40，还调节神经相关启动子，我们选择了VLDLR公司原因有很多：（a）它是人类、小鼠和斑纹雀体内FoxP2的直接靶点（Spiteri等人。，2007; Vernes等人。，2007; Adam等人。，2016); （b） FoxP2和VLDLR均促进不同物种的树突和树突棘发育（Niu等人。，2004,2008; Schulz等人。，2010; Vernes等人。，2011); 和（c）在鸣禽中，FoxP2和VLDLR在X区和基底神经节表达（Balthazart等人。，2008; Hilliard等人。，2012)在不同的环境中（歌唱、年龄和分子操纵；Adam等人。，2016). 大多数关于大脑中表达的FoxP亚家族靶基因的工作都集中在FoxP2上，尚不清楚FoxP1和FoxP4的结合位点有多少重叠，以及它们是否能结合到相同的启动子动机上。为了调查此事，我们使用了VLDLR公司-FoxP2在EMSA中可以结合的寡核苷酸（Adam等人。，2016)并测试FoxP1/4是否也与该探针结合。转染空载体（模拟提取物）的HeK293细胞的蛋白提取物呈现非特异性变化（n.s.；图7A、B，第一条车道）。在FoxP1或FoxP4存在的情况下，观察到DNA的特定移位，表明这两种蛋白都能与VLDLR公司寡核苷酸（图7A、B，第二条车道）。加入一个特定的竞争对手降低了这一波段的强度（图7A、B，第三条车道）。将V5抗体添加到FoxP/寡核苷酸混合物中导致了进一步的改变，强化了FoxP1或FoxP4产生改变的概念（图7A、B，第四条车道）。从这些结果中，我们得出结论，FoxP1和FoxP4可以结合到相同的VLDLR公司FoxP2结合的区域，表明所有三个FoxP共享一个共同的靶基因。

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图7

FoxP1/2/4结合并激活极低密度脂蛋白受体 （VLDLR）发起人用FoxP1进行DNA结合分析（A）和FoxP4（B）HeK293细胞的核提取物（1μg）与地高辛标记探针（0.8 ng）孵育VLDLR公司FoxP2结合位点。在每种情况下，显示了瞬时转染空载体和标记探针（第1道）的HeK293细胞的蛋白裂解物，在FoxPs核提取物存在下发生移位（第2道），在特定未标记探针超过200倍摩尔时形成复合物（第3道），以及在标记探针存在下发生超移位，FoxPs蛋白提取物和单克隆V5抗体（1 mg/ml；通道4）。在所有情况下，箭头都指向自由寡核苷酸、非特定移位（n.s.）、FoxP移位和超移位。（C）在HeK293细胞中进行荧光素酶分析，以测量FoxP1/2/4单独或组合对VLDLR公司发起人。从所有组合到空病媒控制的显著性水平用星号表示**第页< 0.001–0.01; ***第页< 0.001. 单因素方差分析；F类= 26.09; DF=7和n个= 8; 其次是Tukey的多重比较。条形图显示了四个独立转染的平均值±SEM，以荧光素酶/肾素比率（RLU）表示，并通过pGL4.75肾素荧光素酶活性校正转染。1x=每孔125 ng过表达向量，2x=每孔250 ng过表达矢量。用空表达载体（pcDNA3.1）获得对照转染值。

FoxP1/2/4差分激活VLDLR公司荧光素酶启动子报告分析中的启动子

测试FoxP1/2/4是否绑定到VLDLR公司启动子导致转录的改变，我们使用先前描述的pGL4-VLDLR载体进行萤光素酶测定（Adam等人。，2016). 在激活VLDLR公司启动子依赖于FoxP蛋白的特定组合（单向方差分析；F类= 26.09; DF=7和n个= 8;第页< 0.0001; 图​图7C）。7摄氏度). Tukey的多重比较试验表明，与空载体相比，FoxP1对VLDLR启动子的激活作用明显优于FoxP2或FoxP4（FoxP1第页<0.0001，FoxP2第页<0.007和FoxP4第页= 0.0024). 然而，FoxP2和FoxP4的效率较低，在激活VLDLR启动子的能力上彼此没有显著差异(第页= 0.999). FoxP1/2/4的组合确实以相似的程度激活了VLDLR启动子（与空载体相比：FoxP1/2第页< 0.0001; 福克斯P1/4第页<0.0001；福克斯P2/4第页=0.0003和FoxP1/2/4第页< 0.0001). 比较FoxP2单独激活与FoxP1/2和FoxP1/2/4组合激活(第页=0.0078和第页分别=0.012）我们发现VLDLR启动子存在显著差异，但FoxP2/4组合没有显著差异(第页= 0.88). FoxP4单独激活与FoxP1联合激活之间没有差异(第页=0.10）或FoxP2(第页=0.98），但FoxP1/2/4组合存在显著差异(第页= 0.034). 总之，FoxP1/2/4不仅是阻遏物，而且能够与VLDLR启动子结合，并根据与其他FoxP的共同表达而不同地激活它。

缩小差距CNTNAP2公司斑马雀促进剂

为了进一步测试斑胸雀FoxPs对X区相关靶基因的调节能力，我们选择CNTNAP2公司因为：（a）CNTNAP2公司与言语障碍、自闭症、阅读障碍和智力残疾有关（Rodenas-Cuadrado等人。，2014)其中一些还与FoxP突变相关（MacDermot等人。，2005; Vargha-Khadem等人。，2005; Shriberg等人。，2006; Zeesman等人。，2006; Lennon等人。，2007; Pariani等人。，2009; Vernes等人。，2009; Carr等人。，2010; Hamdan等人。，2010; 霍恩等人。，2010; 鲍尔斯和科诺普卡，2012; Rice等人。，2012; Zhi ilina等人。，2012; Chien等人。，2013; Le Fevre等人。，2013; Palumbo等人。，2013; Toma等人。，2013); （b）碳纳米管2是小鼠体内Foxp2和人类体内FOXP1的直接靶点（Vernes等人。，2007; O'Roak等人。，2011); （c） FoxP1/2/4和CNTNAP2在斑马雀X区和基底神经节中表达（Haesler等人。，2004; Panaitof等人。，2010; Condro和White，2014; Mendoza等人。，2015); 和（d）FoxP2与CNTNAP2公司斑马雀的启动子区域和两者的表达在成年无定向歌唱和无定向歌唱的青少年以及FoxP2慢病毒击倒后是相关的（Adam等人，综述；个人交流）。

斑马雀的组装基因组区域CNTNAP2公司启动子包含一个序列缺口，位于基因第一外显子起始密码子上游约0.75kb处CNTNAP2公司（图​（图8A）。第8页). 我们克隆并测序了一个462bp的片段，该片段的GC含量高达79.50%，位于CpG岛内。CpG岛位于第一外显子星形密码子上游约0.83–1.2 kb处。在转录起始位点（TSS）约20 bp处发现一个TATA盒。该区域有11个FoxP2结合位点（图​（图8A，第8页，红色形状；Pierrou等人。，1994; Stroud等人。，2006; Nelson等人。，2013)4个位于启动子区，7个位于5′UTR区。我们能够缩小基因组中的差距，使我们能够进一步研究以前不完整的CNTNAP2公司启动子序列并用于荧光素酶分析。

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图8

FoxP1被激活，FoxP2被抑制，FoxP4没有结合或调节Contactin-associated protein like 2(CNTNAP2公司)启动程序。（A）的示意图CNTNAP2公司启动子区。箭头显示用于克隆CNTNAP2公司启动子区。预测转录起始位点（TSS）、TATA盒、CpG岛（蓝盒）、GAP（白盒）、5′UTR（灰盒）、编码序列（CDS、黑盒）和FOXP2结合位点（红色）的位置用线表示。用于EMSA实验的碎片（在Adam等人的综述中描述）由5′UTR区域标记为“EMSA oligo”的垂直线表示。用FoxP1进行DNA结合分析（B），福克斯P2（C）和FoxP4（D）使用CNTNAP2公司寡糖。将HeK293细胞的核提取物（1μg）与地高辛标记的探针（0.8 ng）孵育，该探针代表了HeK292细胞的46-bpCNTNAP2公司FoxP2结合位点。在每种情况下，显示了瞬时转染空载体和标记探针（第1道）的HeK293细胞的蛋白裂解物，在FoxPs核提取物存在下发生移位（第2道），在特定未标记探针超过200倍摩尔时形成复合物（第3道），以及在标记探针存在下发生超移位，FoxPs蛋白提取物和单克隆V5抗体（1 mg/ml；通道4）。在所有情况下，箭头都指向自由寡核苷酸、非特定移位（n.s.）、FoxP移位和超移位。（E）在HeK293细胞中进行荧光素酶分析，以测量FoxP1/2/4单独或联合对CNTNAP2公司发起人。从所有组合到空病媒控制的显著性水平用星号表示**第页<0.001–0.01***第页< 0.001. 单向方差分析；F类= 21.66; DF=7和n个= 8; 然后进行Tukey多重比较测试。FoxP1和FoxP2单次转染通过CNTNAP2启动子中的特定DNA结合位点显著激活或抑制pGL4-CNTNAP1转录活性（单向方差分析；Tukey多重比较试验**P（P）< 0.005; ***P（P）< 0.0001). FoxP4以及所有其他组合均未调节CNTNAP2启动子。条形图显示了七个独立转染的平均值±SEM，以荧光素酶/肾素比率（RLU）表示，并通过pGL4.75肾素荧光素酶活性校正转染。1×=125 ng过表达向量pro-well，2×=250 ng过表达矢量/well。用空表达载体（pcDNA3.1）获得对照转染值。

EMSA透露FoxP1/2绑定到CNTNAP2公司启动子但FoxP4没有

我们使用了一个取自斑马雀5′UTR区序列的寡核苷酸探针CNTNAP2公司（图​（图8A）第8页)测试FoxP1/2/4是否与之结合。该低聚物在FoxP2和CNTNAP2公司交互作用（Adam等人，综述中）。FoxP1能够与CNTNAP2公司寡核苷酸并导致两条移位带，这与它在三个FoxP2结合位点中的两个结合的可能性一致（Pierrou等人。，1994; Enard等人。，2009; Nelson等人。，2013)包含在寡聚物中（图​（图8B，8B类，“材料和方法”部分）。我们还确认了Adam等人的结果（在综述中），表明FoxP2也结合（图​（图8C）。8摄氏度). 有趣的是，FoxP4并没有导致EMSA中的DNA转移（图​（图8D第8天).

CS得到了德国Forschungsgemeinschaft（DFG，SFB665）的支持。EM得到了国家文明与技术委员会（CONACYT）的支持。我们感谢Ursula Kobalz和Nshdejan Arpik提供的宝贵技术帮助。我们感谢Anna Günther和Anne Voigt对该项目的帮助。