RGMs：结构洞察力、分子调控和下游信号

RGMc的自催化和蛋白水解裂解在控制体内铁水平中的作用

所有RGM均含有自催化Gly-Asp-Pro-His（GDPH）裂解位点(图1A)已知由于特定构象和/或一般酸催化作用，在弱酸性条件下不稳定[24]. 纯化的重组RGMc在pH 5.5下孵育会增加自催化裂解，支持RGMc会在GDPH序列中经历部分自催化裂解的观点[24]. GDPH位置位于连接两个β板的回路中(图1A和​和3A）3A级)并且在物种间高度保守。自催化裂解不会产生RGM分泌片段，因为生成的两个多肽通过二硫键共价连接，形成稳定的结构单元。自催化裂解似乎对蛋白质的正确折叠很重要[16]. 关于RGM自催化裂解功能重要性的线索来自JHH患者的遗传学研究。几个JHH相关突变位于RGMc的自催化切割位点附近[16，36，37]. 这些突变体通常保留在内质网中，具有低信号活性，这表明自催化处理对RGMc质膜表达及其铁调节功能是必要的。此外，使用不可清除RGMa突变体的实验表明，RGMa对轴突的生长抑制作用也需要自催化过程[38]. 因此，自催化处理似乎是RGM的一个普遍而重要的特征。

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图3

排斥性导向分子（RGMa）的蛋白质水解过程产生N-和C-RGMa片段，调节视网膜构造路径发现的不同方面体内。

（A） 枯草杆菌蛋白酶kexin异酶-1（SKI-1）和弗林蛋白酶的自催化加工（箭头）和蛋白水解产生C-和N-RGMa片段。（B） 鸡视顶盖C-和N-RGMa肽的异位表达导致明显的轴突定位缺陷。正常情况下，眼睛中的两个新基因梯度（蓝色）和顶盖中的RGMa梯度允许视网膜轴突的正确前后定位。在对照实验中，眼睛中视网膜神经节细胞的所有轴突在顶盖的终末前（TF）终止，并在浅层灰质和纤维层（SGFS）的a–f层中形成树状结构。C-RGMa的异位表达导致轴突超出TF，异常的视网膜轴突仍局限于浅层视神经（SO）层。相比之下，N-RGMa的异位表达诱导过度表达到TF以外的深层（超出SGFS层g）。缩写：N，鼻音；T、 暂时的。

除自催化裂解外，RGMc通过furin和丝氨酸蛋白酶基质酶-2（TMPRSS6）的蛋白水解过程在调节体内铁水平方面也有作用。膜结合的RGMc作为BMP的共受体，调节铁调素的表达，从而增加铁吸收。RGMc通过furin在RGMa或RGMb中不存在的特定C末端切割位点进行切割，释放出42-kDa可溶性蛋白，该蛋白充当诱饵受体，与膜结合的RGMc竞争结合BMP配体，从而抑制hepcidin的表达[39]. 此外，丝氨酸蛋白酶基质酶-2（TMPRSS6）结合并切割细胞表面RGMc。然而，基质酶-2释放的RGMc片段降低了结合BMP的能力，并且不能抑制BMP诱导的庚肽表达在体外[40，41]. 与呋喃不同，人们认为基质蛋白酶-2主要通过降低膜结合RGMc的水平来影响铁稳态。然而，其他研究表明，基质蛋白酶-2和RGMc之间的相互作用更为复杂（例如，独立于蛋白酶活性）[42]. 还需要进一步的工作来评估基质酶-2对RGMc裂解的需求体内以及基质蛋白酶-2、RGMc、BMP信号和hepcidin之间的精确联系[10]. 然而，这些研究揭示了RGMc蛋白水解过程在调节hepcidin表达和铁水平方面的重要作用。

新生蛋白外胚乳脱落

在过去的几年里，许多研究小组已经证实RGM能够利用不同类型的神经元诱导轴突排斥、轴突生长抑制和生长锥塌陷[11，13，29，43——46]. RGM在发育过程中在轴突引导和轴突生长抑制中的作用已在青蛙和鸡胚中显示出来，而体内RGM阻断促进中枢神经系统（CNS）轴突再生的能力为RGM在哺乳动物中抑制轴突生长提供了证据。RGM对细胞死亡、迁移和分化的其他重要影响也已得到证实(方框1和2) [11，13，47——49]. RGM的神经突起生长抑制作用已被广泛研究，并依赖RGMa下游Rho-GTPases的信号传导。RGMa与Neogenin的结合通过鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）LARG以Unc5B依赖方式[50]. 同时，RGM–新生蛋白相互作用通过黏着斑激酶（FAK）和p120GAP触发Ras活性降低[51] (图2，关键数字）。然而，这些信号事件提供了RGM信号的简化视图，如下文所述，精确调节神经元对RGM的敏感性，将RGM加工成不同的多肽，似乎是形成适当神经元网络的先决条件。

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图2

RGM作为骨形态发生蛋白（BMP）的共同受体，被认为是BMP和新生蛋白之间的结构桥梁。最近提出的一个模型表明，RGM诱导BMP受体复合体的内吞，从而激活典型的SMAD信号。RGM和BMP信号之间的相互作用与铁稳态和软骨内骨发育有关。RGM与Neogenin的结合抑制了Lrig2和Neogeni之间的相互作用，允许A去整合素和金属蛋白酶域包含蛋白17（ADAM17）脱落外结构域，导致信号终止。通常，RGM–Neogenin结合导致通过Unc5和LARG激活RhoA，并通过粘着斑激酶（FAK）和p120-RasGAP失活Ras，从而诱导生长锥塌陷。然而，信号传导依赖于RGM的蛋白水解过程，因为C-RGM触发RhoA-依赖的信号传导，而N-RGM的作用依赖于γ-分泌酶和LMO4对新生蛋白胞内结构域的脱落。新基因胞内结构域可能与LMO4一起进入细胞核，并调节基因转录。在上皮细胞中，新基因结合并定位WAVE调节复合物（WRC），导致肌动蛋白通过Arp2/3成核，这也需要Rac1激活和粘附连接稳定性。这些信号通路对选择细胞类型或细胞功能的特异性程度尚待确定。

关键人物

排斥导向分子（RGM）下游的信号机制

新生蛋白细胞表面脱落的发现一种去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白17（ADAM17）使轴突对RGMa脱敏，提示蛋白质水解在新生蛋白信号传递中的作用[52]. 新生蛋白的胞外部分与ADAM17结合并被其裂解。这种分裂事件会导致外结构域脱落，从而降低新生蛋白细胞表面的表达。然而，最初如何阻止ADAM17对新生蛋白的裂解，使其仅在配体结合后才允许裂解，目前尚不清楚。最近的研究表明，跨膜富含亮氨酸重复蛋白Lrig2负性调节ADAM17介导的神经元导向受体蛋白水解[48]. Lrig2结合新基因并通过ADAM17防止新基因过早脱落(图2). RGMa减少Lrig2–Neogenin的相互作用，使ADAM17能够接触Neogeni，并允许该蛋白酶诱导胞外区脱落。本研究确定了ADAM控制受体脱落的独特配体门控机制，并表明RGM对神经突起生长、皮层神经元迁移和再生失败的影响需要Lrig2的功能。

RGM蛋白水解成不同功能蛋白片段

前蛋白转化酶（PC）由九种蛋白酶组成。其中两种，furin和subtilisin kexin同工酶-1（SKI-1）将RGMa加工成C端膜结合（C-RGM）和N端可溶性（N-RGM）片段(图3A) [38，46]. 有趣的是，这些卵裂事件依赖于RGM自溶。自催化裂解序列中的D149A和H151A突变不会改变RGMa向细胞表面的加工，但会取消SKI-1和furin的加工[38]. C-RGMa和N-RGMa片段的功能意义体内已经使用小鸡视网膜顶盖系统进行了研究。视网膜神经节细胞（RGC）神经元位于眼睛中，以地形方式将轴突通过视神经发送到大脑顶盖(图3B). RGMa在胚胎顶盖中表达为前低后高梯度，而新生蛋白在视网膜中表达为颞高鼻低梯度(图3B). 顶盖中的RGMa梯度将颞叶RGC轴突限制在顶盖的前部，而鼻轴突可以瞄准后部。当视网膜轴突到达顶盖时，它们首先延伸到视顶盖的最浅层，即视层（SO）。一旦轴突到达顶盖中适当的前后坐标，它们就会变成更深的层，在浅层灰质和纤维质（SGFS）的a–f层内建立终末乔木(图3B) [27]. C-RGMa在整个顶盖的异位表达导致轴突主要在表层过度运动，而N-RGMa异位则导致RGC轴突过度运动进入顶盖的深层(图3B). 与C-RGMa和N-RGMa在视网膜覆盖路径发现中的作用一致，体内重组抗体抑制鸡C-RGMa或N-RGMa导致RGC轴突靶向缺陷[46].

尚不清楚C-RGMa和N-RGMa异位顶盖表达对视网膜轴突靶向性的不同影响体内一种可能的解释是，这些肽激活不同的下游信号通路，对胚胎轴突产生定量或定量的不同影响。事实上，虽然C-RGMa和N-RGMa都需要新生蛋白来调节轴突的发育，但N-RGMa影响轴突的生长和引导在体外而C-RGMa仅影响轴突生长。此外，这些效应是通过激活不同的下游通路而诱导的。C-RGMa可刺激涉及LARG、RhoA和ROCK激活的信号级联，而N-RGMa下游的信号传导被认为依赖于新生蛋白胞内区的γ-分泌酶裂解[53] (图2). 许多细胞表面受体被γ-分泌酶切割，随后触发其细胞内结构域（ICD）的释放。通常，在这种细胞内分裂事件之前，先是受体外结构域的蛋白水解释放，然后ICD穿梭进入细胞核。NeICD包含NLS和NES序列，结合各种核蛋白，并作为基因转录的反式激活剂[54]. RGMa介导的轴突排斥需要γ-分泌酶裂解在体外和异位NeICD表达诱导RGC轴突靶向效应体内[53]. NeICD的结合伙伴之一是LIM-only蛋白4（LMO4），它是一种转录共激活物[55]. LMO4是RGMa的轴突抑制活性和N-RGMa靶向顶盖中RGC轴突所必需的。最近的证据表明，新基因的密切同源物DCC/Frazzled（Fra）也被γ-分泌酶处理以释放其胞内结构域（Fra-ICD）[56]. Fra-ICD在细胞质和细胞核之间穿梭，在那里它作为转录因子调节无公社表达以控制轴突中线交叉。NeICD可能具有类似的功能并充当转录因子。有趣的是，LMO4在发育中的皮层中作为神经原蛋白2（NGN2）的一种新的辅因子发挥作用[57]. LMO4结合NGN2形成多蛋白转录复合物。这个复合物被招募到包含NGN2靶基因增强子的E盒中，该增强子调节皮层发育的各个方面并激活NGN2介导的转录[57]. 确定LMO4和NeICD（也许还有NGN2）是否形成一个转录复合物来调节参与轴突生长的基因将是一件有趣的事情。While期间体内研究表明，N-RGMa的轴突再刺激效应与LARG无关，在体外研究表明，LMO4敲低通过RGMa抑制RhoA激活[55]. 因此，需要进一步研究以探讨N-RGMa下游RhoA的作用，并解决其他问题，例如是否需要γ-分泌酶体内N-RGMa的影响。

总之，这些研究表明，通过PC处理RGMa会产生不同的RGMa片段，这些片段通过不同的信号级联（LARG–RhoA–ROCK vs.NeICD–LMO4）发出信号，以发挥特定的生物效应。这表明RGM的蛋白水解过程以及RGM发出信号的能力反式和顺式以及它们与不同信号系统（新生蛋白和骨形态发生蛋白）的联系，使这些蛋白质的作用多样化。这有助于解释一小类蛋白质如何调节不同组织和器官系统中数量不成比例的大量生物事件。最后，值得注意的是，Neogenin与C-RGMa的预孵育消除了Neogenin-N-RGMa的结合，反之亦然，N-RGMa减少了C-RGMa和Neogenin之间的相互作用[38]. 因此，C-RGMa或N-RGMa的局部浓度可能决定了这两种肽中的哪一种将普遍与新生蛋白相互作用以影响轴突。

新生蛋白的脂筏定位

RGM在BMP信号传导中起着关键作用。关于与这些效应有关的信号通路的广泛描述以及新生素的拟议作用，我们请读者参阅其他综述[8，10，58]. 然而，值得注意的是，虽然早期研究未能表明BMP参与RGM介导的对发育中神经元的作用，但最近的研究表明RGM通过BMP作用于神经元[27，45，59]. RGM、Neogenin和BMP之间功能相互作用的一个引人注目的例子是这些蛋白质在骨骼形成过程中软骨内骨发育中的作用。在此过程中，新生素通过促进BMP诱导的受体与脂筏的结合来控制软骨细胞的成熟，从而提高有效的BMP受体浓度或BMP结合亲和力，增加SMAD磷酸化和下游基因转录[9]. 新生蛋白如何将BMP受体定位于脂筏？RGM被发现在新生蛋白和BMP受体之间形成蛋白质桥，从而诱导形成多聚受体复合物。由于RGM含有GPI结构域，这些蛋白质定位于脂筏[29]，作者提出RGM负责将新生蛋白–RGM–BMP受体复合物转移到脂筏中。新基因不仅在软骨内骨发育过程中需要脂筏中的存在，而且在神经系统中也需要其抑制神经突起生长和诱导神经元死亡的作用[15，27]. 使用特定蛋白片段或抗RGMa抗体干扰RGM–新生蛋白结合，导致新生蛋白移出脂筏，并阻止促凋亡和神经突起生长抑制作用。在大脑或轴突损伤模型中应用这些工具（例如大脑中动脉阻塞或视神经挤压）可促进再生和功能恢复[11，15，27]. 这表明，干扰Neogenin的脂筏定位是中和RGM–Neogenin在损伤或疾病后的有害影响的有力手段。

上皮细胞粘附过程中肌动蛋白的调节

上皮形态发生是胚胎器官发生的基础。上皮片经过精心设计的运动产生复杂的结构，如神经管。神经上皮中新生素或RGMa的早期耗竭导致粘附和根尖极性丧失，从而导致神经管闭合失败[31，47，60，61]. E-钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附粘连连接（AJ）在维持上皮细胞的保真度方面起着关键作用。连接稳定性需要钙粘蛋白和与AJ平行运行的周向肌动蛋白环之间的相互作用。肌动蛋白环会不断翻动，如果无法修复，则会导致粘附力下降。有趣的是，最近的工作确定了新基因是调节AJ稳定性的肌动蛋白成核机制的关键组成部分[62]. 新生素通过空间耦合Arp2/3-介导的肌动蛋白核化到AJ，通过补体的募集促进AJ稳定肌动蛋白环的形成波浪调节复合体（WRC）(图2). 新生蛋白之间的直接相互作用WRC-相互作用受体序列（WIRS）域和WRC对于WRC和Arp2/3到交界处的受限定位至关重要。新基因不足以激活Arp2/3，这需要激活Rac和Sra1结合。新生蛋白也影响E-cadherin的循环，但这种影响是否取决于其控制肌动蛋白动力学的能力尚不清楚。RGMa的敲除导致AJ稳定性和WRC定位缺陷，与新基因缺失后观察到的缺陷类似[62]. 这表明RGMa和Neogenin在AJ共同作用。然而，RGMa在AJ的精确作用模式（例如，它是否在顺式或反式与Neogenin）仍然未知。鉴于生长锥的转向高度依赖于肌动蛋白的调节，确定Neogenin对肌动蛋白成核的诱导是否也在神经元生长锥中发挥作用将是一件有趣的事情。

我们感谢原田英治帮助我们做好准备图3作者实验室中关于RGM的工作得到了荷兰科学研究组织（ALW）VICI拨款的部分支持，UU战略主题“青年动力”对R.J.P.C.S.的拨款得到了英国癌症研究高级研究奖学金（C20724/A14414）和欧洲研究委员会（ERC）的支持合并奖（647278）。