液体活检中的新概念

摘要

背景

随着精确医学在癌症管理领域的概念不断发展，在诊断、预后和预测治疗耐药性方面的挑战和需求也在不断发展[1,2]. 尽管发现了能够针对转移性癌症患者特定基因组变化的分子制剂，使患者护理发生了革命性变化，但肿瘤异质性仍然是临床医生需要根据个人癌症基因组优化治疗方案的一个巨大障碍[三]. 不幸的是，目前仍代表肿瘤诊断标准的组织活检只反映了肿瘤单个部位的一个时间点。因此，这种取样方法不足以全面描述患者肿瘤的特征，因为已经证明原发肿瘤或转移瘤中的不同区域实际上可能包含不同的基因组图谱[4]. 肿瘤内的分子遗传多样性也可能随着时间的推移而改变，从而使基于历史活检信息的未来治疗决策可能不准确且不理想[5,6]. 此外，由于可重复性、患者年龄和共病性、成本和时间有限，手术活检程序受到阻碍，可能导致临床并发症。尽管存在这些持续存在的临床问题，但新一代测序（NGS）技术的出现证明了其在寻找新的、更全面的、侵袭性更小的生物标记物方面的价值，以真正实现癌症精确医学的目标[1].

这种微创检测称为“液体活检”[7,8]，在过去几年中获得了很大的吸引力，该方法甚至最近被麻省理工学院技术评论列为2015年十大技术突破之一(www.technologyreview.com/s/544996/10-breakthrough-technologies-of-2015-where-are-they-now/). 这种方法的一种策略是利用血液血浆成分中发现的循环游离DNA（cfDNA）来评估癌症基因组的当前状态。自1948年发现cfDNA以来，许多研究工作都试图在癌症患者的循环中利用这一易于获取且丰富的基因信息。此外，其他成分，如循环肿瘤细胞（CTC）或外泌体，也已被深入研究。在此，我们简要总结了当前的技术和应用，健康个体根据年龄正常突变数量的检测率，以及液体活检应用的新技术和新概念以及现有挑战。最后，我们将介绍我们对液体活检信息何时可靠和临床适用的看法。

当前技术和应用

在这里，如果可以将技术视为一些描述其适用性的出版物中反映的既定方法，则我们将其称为“当前”技术。相比之下，“新兴技术”是一些新颖的想法和概念，其概念验证或仅发布了一些应用程序。广泛回顾了液体活检研究中应用的当前技术[9–12]因此，我们在此仅对其进行了简要总结。

健康个体的突变基线值

液体活检的一个巨大前景是，它有可能在临床症状出现之前或先进的成像系统能够检测到癌症之前，早期检测癌症，甚至检测出前驱病变。然而，一个主要问题是健康个体中发生的体细胞突变数量。

关于什么构成典型的体细胞变异以及它在表型方面的形成程度的问题，最近标志性的大规模研究已经引起了关注[51,52]. 有趣的是，健康人可能携带不利的变异而不表现出任何明显的疾病表型[51,52]. 事实上，对预测功能基因型丧失的罕见纯合子的鉴定表明，大多数蛋白质的丧失对个体相对无害[52]. Exome Aggregation Consortium研究分析了60706个不同地理祖先个体的高质量Exome测序数据，确定了3230个对功能丧失高度不耐受的基因。有趣的是，72%的这些基因还没有确定的人类疾病表型[51]. 因此，尽管我们对人类基因组的了解不断增加，但对于已确定的变异，需要对表型的潜在后果进行谨慎的解释。

在癌症的背景下，根据癌症的体细胞突变理论[53]恶性疾病在很大程度上是后天遗传和表观遗传变化的结果，这一点现已被NGS技术广泛证实[54,55]. 然而，一个巨大的挑战是测量正常组织中的体细胞突变率并确定基线值，即在特定年龄段健康人的正常突变数量。一般来说，体细胞突变率高于种系突变率。例如，据估计，在人类中，肠上皮或成纤维细胞/淋巴细胞的每代比率分别约为生殖系的13倍和5倍[56].

由于体细胞突变发生在单个细胞中，每个突变都代表一个低频事件，因此需要特殊的NGS方法来检测这种罕见的突变。有希望的方法包括单细胞基因组测序[6,34,57–59]分子条形码及其应用[60,61]. 瓶颈测序系统是一项新技术，它可以量化正常人体组织中的体细胞突变负荷，即使是在全基因组水平上[62]. 瓶颈是由于PCR扩增前对测序文库进行稀释，导致对双链模板分子进行随机取样。与野生型序列相比，这增加了罕见突变的信号，从而能够检测到发生在6×10^–8每个碱基对。通过这种方法，研究表明，在正常结肠上皮中，91岁以上个体的线粒体DNA突变率平均增加了30倍，核DNA突变率增加了6.1倍[62]. 重要的是，正常结肠和肾脏组织中罕见突变的光谱与相应癌症类型的光谱相似[62]，证实了以前的报道，癌相关突变也可能发生在正常干细胞中[63,64].

因此，有必要对成人干细胞的突变进行直接测量，因为成人干细胞中突变的逐渐积累被认为对组织的突变负荷有着特别大的影响，因为它们具有自我更新的潜力和向子细胞传播突变的能力[63]. 事实上，最近的统计分析表明，维持组织内环境平衡所需的成体细胞分裂总数与癌症的终生风险相关[63]. 然而，这些计算不能排除外部风险因素作为癌症风险的其他重要决定因素[65].

测量各种人体组织中干细胞的体细胞突变负荷是一个巨大的技术问题。Blokzijl等人[66]通过使用能够形成长期类器官培养物的细胞来应对这一挑战。类器官可以定义为包含多种细胞类型的细胞结构，这些细胞类型是从干细胞或器官祖细胞发展而来的，通过细胞分类和空间限制的谱系承诺进行自组织[67]. 来自小肠、结肠和肝脏组织的单个成体干细胞在增殖率和癌症风险方面存在很大差异，将其扩增为上皮类器官，以获得足够的DNA进行全基因组测序。捐赠者的年龄从3岁到87岁不等，不出所料，研究发现干细胞积累的突变与年龄无关，与组织类型无关[66]. 突变率，即每个干细胞中体细胞点突变数量的增加，在所有评估组织中都处于相同的范围内，每年约有36个突变，尽管这些组织的癌症发病率差异很大（图1a个). 重要的是，研究结果表明了一种普遍的基因组老化机制，即作用于DNA分子的化学过程，与细胞功能或增殖率无关。此外，这种内在的、不可避免的突变过程可以导致与癌症驱动基因中观察到的突变类型相同的突变[66].

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图1

成人干细胞的突变率及其潜在后果。一来自结肠、小肠和肝脏的成人干细胞的体细胞点突变数量与供体年龄的相关性（改编自[66]); 每成年干细胞每年增加约36个突变。b条“癌症三击模型”综述[68]对于结直肠癌，在特定的驱动基因中发生突变。在突破阶段空气污染指数并导致相应细胞的异常分裂。随后KRAS公司随后可能会出现扩张期，并可能导致良性肿瘤。至少在所列路径中的一条中，驱动基因发生进一步突变座椅模块组件4,TP53型,PIK3CA公司，或FBXW7型可能使肿瘤侵袭周围组织，并随着肿瘤细胞的扩散和转移形成侵袭期[68]. cfDNA中可能检测到突变；此外，根据ctDNA等位基因频率和肿瘤分期，体细胞拷贝数可能会发生变化（以8号染色体为例：蓝色：丢失；绿色：平衡；红色：获得区域）。c（c）由于驱动基因突变的顺序很重要，如果TP53型在起始突变发生之前，结肠干细胞发生突变。这样一个TP53型单纯的突变不足以导致细胞增殖增加，甚至不足以将细胞转化为肿瘤细胞。然而，由于干细胞的自我更新能力，具有这种突变的细胞可以在结肠的各个部分繁殖。根据凋亡或其他事件清除了多少这些细胞，超灵敏的ctDNA分析可以检测到血液中的这种突变；这通常不会伴随拷贝数的改变（如第8号染色体的绿色散点所示）

考虑到成人干细胞的高突变率，癌症发病率实际上并不高，这可能令人惊讶。根据“三振出局”理论[68]（图1亿)，只有三个驱动基因的改变可能足以使细胞进化为晚期癌症。然而，癌症发病率相对较低可能有几个原因。首先，干细胞的突变是非随机分布的，并且与外显子区域的缺失有关。第二，如果突变发生在外显子区域，它必须位于癌症驱动基因中，并且人类基因组中只有少数基因被证明是驱动基因[69]. 第三，驱动基因突变积累的顺序很重要，这意味着引发事件的突变必须首先发生[68]. 第四，许多起始驱动基因突变是组织特异性的；因此，驱动基因突变必须发生在正确的基因中，而不是发生在任何驱动基因中。

根据这些发现，在健康人的血浆DNA中发现与癌症相关的突变并不奇怪。最近的一项研究表明了这一点，该研究使用了一种专门设计用于准确检测TP53型低等位基因片段突变，其中cfDNATP53型-在123名匹配的非癌症对照中，11.4%的人发现了突变片段[70]（图1c个). 然而，在文库准备和/或测序过程中发生的背景错误可能会阻碍低等位基因变异的检测。为了解决这一问题，已经开发了诸如分子条形码和通过复杂的生物信息学方法减少背景的方法，如下所述。

新的液体活检技术和新兴概念

表观遗传学：血浆亚硫酸氢盐测序和核小体定位

特别令人感兴趣的是cfDNA甲基化模式的研究，因为血浆中含有来自不同组织和器官的DNA混合物。由于某些甲基化模式是组织特异性的，它们可以作为释放DNA进入循环的相应细胞或组织的表观遗传特征。这些努力极大地受益于国际人类表观基因组联盟提供的多种组织类型的参考甲基体。例如，“血浆DNA组织定位”是一种利用血浆DNA的全基因组亚硫酸氢盐测序和测序数据的甲基化去卷积，以全基因组方式追踪血浆DNA起源组织的方法[74]. 为了提高这种检测的信噪比，可以使用邻近组织特异性甲基化标记位点的四到九个CpG位点的延伸[75]（图2a个). 事实上，这种方法不仅可以检测癌症，还可以检测其他临床疾病，如I型糖尿病、多发性硬化症、心脏骤停后的急性脑损伤或创伤性脑损伤[75].

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图2

总结液体活检领域的一些新兴技术。一血浆DNA组织标测：血浆DNA组织标测是一种利用血浆DNA的全基因组亚硫酸氢盐测序和测序数据的甲基化去卷积以全基因组方式追踪血浆DNA起源组织的方法（此处以肝脏特异性标记物为例）。通过分析与组织特异性甲基化标记相邻的几个CpG位点的延伸，可以提高此类分析的信噪比。b条核小体定位：分析血浆DNA片段的基因组测序覆盖率可以揭示核小体的位置，因为血浆DNA是受核小体保护的DNA。在转录起始位点（TSS；由灰色箭头指示），特别是在核小体亏损区域，读取深度较低，并且在高表达基因的TSS周围具有明显的覆盖模式（以蓝色显示），这与未表达基因的覆盖模式不同（以红色显示）。c（c）血浆RNA-seq：从血浆中提取无细胞RNA并进行DNase I消化后，从无细胞RNA合成并扩增cDNA。使用微阵列对无细胞转录组进行反褶积，以根据已知的组织特异性表达谱确定样本中某些组织的相对RNA贡献。同时，通过qPCR（基于[81]).d日单链DNA（ssDNA）文库的制备：该方案说明了ssDNA连接过程中的关键步骤。ssDNA（顶部面板）不是为了避免消除较短的片段而选择大小的，它被连接到生物素化探针（第二面板），在连接双链引物后，延伸到双链DNA（第三面板）。可以获得不同长度的DNA分子，其有效捕获下限约为40–60 bp（改编自[86]).e（电子）CTC衍生外植体（CDX）：患者血液中富含CTC（顶面板中的绿色细胞），并注射到小鼠的一侧或两侧（第二面板）。然后通过组织病理学、免疫组织化学和基因组分析对获得的CDX（第三组中的棕色肿瘤）进行分析，以确认原始肿瘤的特征保持不变。携带CDX的小鼠可以接受治疗，以评估对各种药物的反应

最近的一项研究采用了一种完全不同的方法进行全基因组测序，并利用了血浆DNA是核小体保护的DNA这一事实。这反映在转录起始位点（TSS）周围血浆DNA片段的基因组测序覆盖率上，因为读取深度较低，并且在看家基因和其他高表达基因的TSS周围具有明显的覆盖模式。测序覆盖范围不同于未表达的基因，这些基因被核小体紧密包裹[76]（图2亿). 事实上，根据血浆DNA的全基因组测序推断出的核小体位置与无癌受试者的血浆RNA水平密切相关。此外，在癌症患者的血浆中，TSS周围的覆盖率反映了相应肿瘤中基因的表达水平[76].

此外，Snyder等人[77]最近还确定了cfDNA和核小体定位之间的直接关联，并同样证明cfDNA水平和片段大小反映了淋巴和髓细胞的表观遗传特征。这些当前的研究都扩大了ctDNA分析用于其他应用的潜力，而不仅仅是突变或SCNA分析。这些发现带来了新的可能性，例如研究患者的单个癌症转录组，跟踪治疗期间基因亚型表达的变化，甚至帮助确定原发肿瘤未知的癌症的起源组织[78].

液体活检应用的挑战以及我们与诊所的距离

特别是，对ctDNA、CTC和外泌体背后的生物学有更成熟的了解，将有助于我们了解从这些来源生成的分子图谱是否真正反映了患者的生理疾病状态，以及它们是否能够帮助医生可靠地检测和监测疾病。为了证实这一点，我们必须揭示这些肿瘤部位在循环中的起源和动力学，并进一步确定其生物学意义和临床相关性。

尽管cfDNA释放和动力学的确切机制尚不清楚，但仍存在一些假说来解释血液中肿瘤DNA的存在。也许最广为接受的理论是肿瘤细胞通过凋亡、坏死或肿瘤微环境中的细胞分泌释放DNA[14,93,94]. 一些被检查的癌症病例检测到了ctDNA水平，但没有检测到CTC水平[13]. 反之亦然，描述了一名CTC数量超过100000个的患者，尽管患有进行性疾病，但其ctDNA等位基因频率较低，仅为2–3%[26]. 而在大多数患者中，CTC数量和ctDNA水平是相互关联的[26]，这类案例说明存在例外情况，并且对CTC和ctDNA释放的潜在生物学仍知之甚少。

关于临床液体活检实施的其他基本未知因素围绕着这样一个问题：如果所有现有的转移瘤都与血液中发现的ctDNA、CTC和外泌体有关，那么ctDNA是否真的能够完整地代表患者的癌症，或者如果所有肿瘤细胞向循环中释放等量的ctDNA。为了确定ctDNA在多大程度上代表转移异质性，一项研究对一名转移性ER阳性和HER2阳性乳腺癌患者进行了为期3年的随访[95]. 疾病的基因组结构是从肿瘤活检和血浆样本中推断出来的，实际上，血浆样本中的突变水平表明ctDNA可能允许实时采样多灶克隆进化[95]. 进行温热的尸检，即在死亡后数小时内快速确定肿瘤特征，可能有助于更全面地回答这些问题，因为从肿瘤尸检中获得的数据可以与之前从患者收集的ctDNA进行比较[96].

此外，已经证明，ctDNA在总cfDNA中的百分比在患者之间可能存在很大差异，从小于10%到大于50%，或者，正如最近提出的那样，甚至可以检测到0.01%的分数[13,19,97]. 然而，尽管不同癌症患者的ctDNA水平差异很大，但许多研究表明，患者体内ctDNA水平与肿瘤负担和疾病进展相关[14,17–20,27,29,98–102]，为使用ctDNA水平作为肿瘤进展和治疗反应的替代测量提供了证据。因此，在结直肠癌中，ctDNA分析揭示了肿瘤基因组如何适应给定的药物计划，因此液体活检可以指导临床医生决定重新挑战基于EGFR阻断的治疗[98]. 对于非小细胞肺癌患者，食品和药物管理局批准在表皮生长因子受体通过一种名为“眼镜蛇”的测试进行突变分析表皮生长因子受体突变测试v2“（罗氏），作为第一个基于血液的辅助诊断，用于测试哪些患者是药物Tarceva（erlotinib）的潜在候选患者。在最近的一项研究中[103]，该试剂盒用于确认使用一线EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的患者获得了表皮生长因子受体T790M（p.Thr790Met）突变，对第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性[103]. 作者随后表明，与接受铂类药物治疗的患者相比，接受西美替尼治疗的具有T790M突变的非小细胞肺癌患者的有效率和无进展生存期更好[103]. 这是一个很好的例子，其中侵入性肺组织活检被基于血浆DNA的血液检测（即液体活检）所取代，以确定可从特定治疗中受益的一组患者。这可能会推动基于NGS的进一步发展表皮生长因子受体突变检测分析，这与亚洲人群特别相关，其中表皮生长因子受体突变阳性肺癌的发生率高于高加索人群[104].

然而，在液体活检可作为可行的诊断分析之前，必须对预分析步骤进行标准化，例如收集生物流体（例如血液、血清、血浆）、离心设置、隔离试剂和储存条件，以确保可重复的处理程序。此外，必须验证分析步骤，例如cfDNA的量化和随后的突变分析，即NGS分析和测序平台本身，以模拟临床设置。此外，所用分析的灵敏度和特异性必须稳健、可重复，并具有适当的内部和外部质量控制[72]. 也许最迫切的步骤是需要根据应用情况在不同的时间点评估ctDNA的临床相关性，例如患者分层、治疗反应、疗效和耐药性的评估，以及在大型多中心临床研究中验证这些数据[72]. 此外，cfDNA检测的临床性能必须满足相应监管机构的要求，例如美国的临床实验室改进修正案或欧洲国家的基因检测实践。在欧洲，统一液体活组织检查的努力得到了CANCER-ID的支持，CANCER-ID是一个由欧洲创新药物倡议支持的欧洲联盟，旨在建立基于血液的生物标记物的标准协议和临床验证(网址：www.cancer-id.eu/).

结论

癌症是一种复杂的、异质的、动态的疾病，涉及多种基因-环境相互作用，并影响许多生物途径。因此，开发可靠和强大的非侵入性平台是朝着实现精确医学的承诺迈出的重要一步。液体活检领域的当前工作在癌症患者的诊断和分层方面继续显示出巨大的潜在效用，并且与组织活检方法相比，进一步证明了监测治疗反应的替代方法。与标准手术程序相比，连续液体活检采集的方便性和频率提供了很多优势，尤其是有机会更快地纠正治疗过程。随着技术的不断进步和液体活检方法的进一步创新，这种方法有望使癌症风险的预诊断评估方法成为可能。随着我们对cfDNA背后生物学知识的提高，作为液体活检方法的癌症患者管理也将成为临床现实之一。

致谢

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参与者信息

萨曼莎·佩拉基斯，电子邮件：ta.zarginudem@sikarep.ahtnamas邮箱.

Michael R.Speicher，电话：+43 316 380 4110，电子邮件：ta.zarginudem@rehcieps.leahcim.

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