全外显子组测序确定一名MRI患者晚发性Leigh综合征的遗传基础，但几乎没有线粒体疾病的生化证据

摘要

介绍

Leigh综合征主要是一种早发、进行性、神经退行性疾病，由参与丙酮酸代谢或线粒体呼吸链复合体（MRC）的至少75个核和线粒体编码基因突变引起，后者主要涉及复合体I（CI）和复合体IV（CIV）（Lake等人。2015)。Leigh综合征的临床特征是脑干功能障碍、脑内对称性海绵状病变、肌张力障碍、痉挛、运动障碍、视觉障碍、眼球震颤、眼睑麻痹、上睑下垂、小脑共济失调、癫痫、脊柱侧凸、，球功能障碍和周围神经病变导致线粒体功能障碍的生化迹象，包括不同体液中的乳酸升高、尿液中的克雷布斯循环中间产物以及不同组织中线粒体呼吸链的功能障碍（Lake等人。2015)。核编码线粒体CI基因的突变NDUFV1型[MIM 161015]之前由Schuelke等人报道(1999)随后，Benit等人发表了一份报告(2001)与本文报道的具有相同突变和Leigh综合征和CI缺乏临床表型的患者（Benit等人。2001; Schuelke等人。1999)。该基因编码CI的黄素蛋白部分的51kDa亚基，包含NADH、黄素单核苷酸（FMN）和Fe-S结合位点（Mimaki等人。2012).NDUFV1型在进化上高度保守，在CI的催化活性中起着关键作用（Benit等人。2001)。CI功能失调是人类最常见的氧化磷酸化障碍，可能是由于其结构、功能和组装所需的亚单位（每个亚单位由不同的核或线粒体基因编码）的绝对数量，CI组装过程中的缺陷通常是错误的（Mimaki等人。2012).

为了确定先证者迟发性儿童Leigh综合征的遗传基础，我们对先证者和四个未受影响的家庭成员的DNA进行了全外显子序列测定，并确定了复合杂合子NDUFV1型序列变量({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_007103.3”，“term_id”：“164664491”，“term_text”：“NM_007103-3”}}NM_007103.3号)先证者。对患者成纤维细胞的功能检测显示NDUFV1蛋白水平降低，MRC装配缺陷，CI和CIV功能障碍，导致ATP生成可能减少。这些变化以前与血浆乳酸水平中度升高的患者的CI缺乏相关，临床特征包括小脑共济失调、持续性癫痫、精神运动退化、斜视、上睑下垂和脑干多个对称高强度区域的脑萎缩（Benit等人。2001).

方法和材料

结果

由于临床怀疑迟发性Leigh综合征，我们最初在肝脏和骨骼肌中进行了MRC复合物分光光度测定（表1)。由于这些结果在参考范围内，且患者有明显的Leigh综合征表型，我们进行全外显子测序，并在MRC CI黄素蛋白亚基编码基因中鉴定出复合杂合突变（c.1162+4A>c和c.640G>a）NDUFV1型桑格测序证实了这两种突变，父母双方各携带一种突变（图1a和c).生物信息学对c.640G>A变异体的综述预测它会影响蛋白质功能，并具有最大的破坏性得分，表明p.Glu214位置在许多物种中都是完全保守的（图1亿).生物信息学对c.1162+4A>c变异的分析预测它会引起疾病，影响供体剪接位点。这些变异具有非常低的次要等位基因频率(http://www.1000genomes.org&ExAc公司http://exac.broadinstitute.org)。由患者成纤维细胞mRNA逆转录产生的患者cDNA扩增在琼脂糖凝胶电泳上显示出两条带：一条密集的高全长带和一条较短的转录物（微弱的低带）（图1天)。较短转录物的Sanger测序证实了外显子8的跳跃（图第1页)患者mRNA中较高全长带中存在错义c.640G>A突变。

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图1

(一)桑格测序剖面图nduv1型来自先证者和在先证者中显示复合杂合突变的父母，包括c.640G>A（p.Glu214Lys；在母亲中杂合）和c.1162+4A>c（在父亲中杂合）。(b条)改变的氨基酸残基（p.Glu214）的进化序列保守性用红色矩形. (c（c）)cDNA扩增显示先证者有两条带：一条强烈的高分子量带和一条微弱的低分子量带。(d日)对扩增cDNA的微弱条带进行Sanger测序，显示患者第8外显子跳跃。(e（电子）)RT-PCR典型图像及外显子8跳跃序列分析

我们检测了患者成纤维细胞中NDUFV1蛋白水平及其对MRC复合物水平的影响。免疫印迹分析显示，与对照组相比，患者成纤维细胞中NDUFV1水平降低了72%（图2a个)。根据MRC复合物形成的蛋白质稳定性，对MRC酶复合物亚单位进行免疫印迹分析，发现患者成纤维细胞中CI（95%）、CIII（45%）和CIV（60%）严重减少（图2亿)。然而，在患者骨骼肌和肝脏中，只有CI分别减少了90%和60%，这表明CI是我们患者最脆弱的复合体（图2厘米和补充图1）。我们尚不清楚哪些因素可能导致我们的患者携带组织特异性nduv1型突变。

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图2

(一)免疫印迹显示，与对照组相比，先证者培养成纤维细胞中NDUFV1表达降低（P）。(b条)免疫印迹显示先证者（P）与对照组（C）在肌肉和肝脏中的OXPHOS表达。(c（c）)免疫印迹显示先证者培养成纤维细胞中OXPHOS的表达（P）与对照组（C）相比。(d日)使用针对复合物I的NDUFA9亚基、复合物II的SDHA亚基、络合物III的UQCRC1亚基和复合物IV的COX1亚基的抗体，对皮肤成纤维细胞线粒体进行BN-PAGE免疫印迹，发现复合物I、III、IV和超复合物CI/CII减少

自从NDUFV1型突变只会影响CI，我们通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）检测患者成纤维细胞中的MRC聚集。观察到CI（60%）、CIII（35%）、CIV（51%）和超复合体I/III（95%）的相对减少（图二维)。然而，我们无法检查患者骨骼肌和肝脏中是否也存在这些组装缺陷，因为我们没有足够的组织材料来进行这些研究。

总之，这些结果证实了NDUFV1型预测的变量生物信息学分析，有力证据表明NDUFV1亚单位水平的变化影响了我们患者的CI装配。然后通过试纸酶分析重新评估线粒体呼吸链酶功能，以确定患者成纤维细胞裂解物中免疫捕获CI和CIV的相对比活性。结果表明，与对照组相比，患者成纤维细胞中CI和CIV的活性分别降低了67%和38%（表1)。通过试纸酶分析降低的CI和CIV活性与患者成纤维细胞免疫印迹上观察到的CI和CIDV水平降低一致（图2b–d日).

讨论

这项研究强调了在临床上患有Leigh综合征但临床上未受影响的组织中MRC酶活性正常的患者的诊断中面临的几个挑战。这些发现加强了使用大规模平行测序鉴定这种遗传异质性疾病潜在遗传基础的价值，并证明了验证性结构和功能分析对建立基因型和表型关联的证据库的重要性。

在大多数情况下，MRC疾病的诊断依赖于识别一种或多种MRC酶的异常活性（Hui等人。2006)。然而，使用MRC酶活性作为主要诊断工具存在局限性。这些主要与稀释水分析系统有关，该系统不完美地反映了膜包埋酶的功能，并且难以区分初级和次级MRC缺陷，如其他地方所讨论的（Thorburn等人。2004)。因此，在67例疑似澳大利亚Leigh综合征病例中，只有29例MRC复合物活性显著下降，强调了酶活性研究在MRC疾病诊断中应该是补充和补充其他结构和功能证据的，并且应该谨慎解释（Rahman等人。1996).

然而，组合MRC酶学方法的实施，如分光光度测定和极谱或尺酶测定，目前不适合作为一线诊断测定，但可用于确认和评估新突变的影响以及研究动物模型（Calvo等人。2010; Wenchic等人。2003)。这些互补方法在方法上有所不同，可能允许对所涉及的路径进行差异化查询（Barrientos等人。2009; Tang等人。2013; Wenchic等人。2003).

Benit等人(2001)据报道，一名患者患有相同的复合杂合子变异，1岁时出现癫痫发作，血浆乳酸轻度升高，神经功能退化，斜视，上睑下垂，病程进展导致3年死亡。MRI显示典型的双侧对称基底节和脑干病变。尸检后组织病理学证实Leigh综合征（Benit等人。2001)。他们报告称肌肉和肝脏CI缺乏。然而，CI在培养的皮肤成纤维细胞中是正常的（Benit等人。2001)。与Benit等人报道的病例相比，我们描述的患者具有不同的临床表现(2001)发病较晚，进展较慢，不对称性上睑下垂和肌张力障碍，但无癫痫发作。这个病人在确诊后10年仍然活着。值得注意的是，尽管我们在当前研究中显示，培养的成纤维细胞中复合物I和IV显著减少，肌肉和肝脏中复合物Ⅰ显著减少，但对肝脏线粒体CI和CIV酶活性的总体评估，肌肉和成纤维细胞被认为对Leigh病的诊断没有帮助。

在哺乳动物中，所有44个CI亚基必须按照正确的顺序正确组装，以形成成熟的功能复合体。在这些成分中，CI的14个核编码结构亚单位的致病突变(NDUFS1型,NDUFS2型,NDUFS3型,NDUFS4型,NDUFS7型,NDUFS8型,NDUFV2型,NDUFS6系列,NDUFV1型,NDUFA1型,NDUFA2型,NDUFA9号机组,NDUFA10型,NDUFA12型)，四个装配因子缺陷(NDUFAF2、NDUFAF5、NDUFAF6、FOXRED1)和6个mtDNA亚单位以前与Leigh综合征有关（Ogilvie等人。2005; Mimaki等人。2012; 勒米尔2015; 莱克等人。2015)。四个CI亚单位（NDUFV1、NDUFS1、NDUWS4和NDUFS6）的突变均位于CI的基质臂（N模块）中，导致BN-PAGE分析显示CI亚单位复合体约为830 kDa，似乎失去了CI的基质手臂（Mimaki et al。2012; Ogilvie等人。2005; Tuppen等人。2010; Leong等人。2012)。根据我们的经验，这些基因突变的患者和小鼠通常对BN-PAGE上完全组装的CI数量的影响明显大于分光光度法CI活性或功能分析（如ATP合成）（Leong等人。2012)。这可能是因为完整内膜中完全组装的CI的数量高于BN-PAGE和酶研究的暗示，其中膜已被洗涤剂、冻融或超声波破坏（Leong等人。2012)这四个CI亚单位基因普遍表达，但对CI酶活性和功能的影响也因组织而异（Bird等人。2014)。此外，正如我们的案例所示，CI基因突变可以影响其他线粒体复合体的稳定性，这可能解释了患者成纤维细胞中CIII和CIV水平降低以及CIV活性降低的原因（Ugalde等人。2004; Suthamarak等人。2010)。在所有基因突变的患者中检测孤立CI缺陷的能力存在一些模糊性，如nduv1型考虑到个体突变的不同严重程度、遗传背景效应以及评估44种蛋白质与其他膜复合物相互作用的膜包埋复合物的活性和组装的不同方法所带来的潜在变异性，这并不奇怪。

总之，我们已经介绍了生物信息学研究和异常NDUFV1型从而降低骨骼肌、肝脏和培养的成纤维细胞中的CI蛋白水平。在之前的研究中也观察到患者骨骼肌和肝脏中CIV和CIII蛋白水平正常（Benit等人。2001)强调了研究原发组织的必要性，因为单靠成纤维细胞可能会导致误导性结果。我们还强调了OXPHOS复合物CI、CIII、CIV和超复合物I/III中的组装缺陷。考虑到对具有迟发性Leigh综合征临床表现的儿童进行生化诊断的局限性，实施了多方面的诊断流程，包括整个外显子序列测定和互补的结构和功能研究，有助于确认NDUFV1型这个病人的基因突变。

电子辅助材料

致谢

脚注

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