基因发育。2004年12月15日；18(24): 3004–3009.
AMP激活的蛋白激酶AAK-2将能量水平和胰岛素样信号与寿命联系起来秀丽线虫
Elixir Pharmaceuticals，美国马萨诸塞州剑桥02139
收稿日期：2004年8月27日；2004年10月18日接受。
摘要
虽然限制能量利用可以延长许多生物体的寿命，但人们还不清楚寿命是如何与能量水平相耦合的。我们发现，AMP:ATP比率是衡量能量水平的指标，随着年龄的增长而增加秀丽隐杆线虫并且可以用于预测预期寿命。这个秀丽线虫AMP激活的蛋白激酶α亚单位AAK-2被AMP激活并发挥延长寿命的作用。此外，无论是增加AMP:ATP比率的环境压力源，还是降低胰岛素样信号的突变，都会延长患者的寿命aak-2型-依赖方式。因此，AAK-2是一种将寿命与能量水平和胰岛素样信号相关的信息耦合起来的传感器。
关键词：老化，秀丽线虫、AMPK、胰岛素信号、FOXO、能量水平
限制能源可用性的干预措施延长了一系列生物体的寿命(Weindruch和Sohal 1997;Osiewacz 2002年;蒂森巴姆和瓜伦特2002). 限制能量的一种常见方法是限制饮食，这会延长酵母菌、线虫和啮齿动物等生物的寿命(Lakowski和Hekimi 1998;Longo and Finch 2003年). 然而，关于衰老是如何与动物能量状态的信息联系在一起的，我们知之甚少。
在人类中，衰老伴随着肌肉线粒体功能障碍的增加(Petersen等人，2003年)这将降低细胞的能量水平。同样，衰老的人成纤维细胞比年轻的成纤维细胞具有更高的AMP:ATP比率，这是一种能量水平的敏感测量(哈迪和霍利2001;Wang等人，2003年). 我们推测，动物会主动感知能量水平的变化，并通过调整寿命做出反应。为了研究这种可能性，我们研究了AMP-activated protein kinase（AMPK）在调节秀丽隐杆线虫.
AMPK属于一个保守的真核蛋白激酶家族，其功能是作为能量传感器来协调对降低能量水平的条件的反应(哈迪和霍利2001). 例如，当啮齿动物的能量供应有限时，AMPK通过刺激骨骼肌中的葡萄糖摄取和心脏中的糖酵解，以及通过调节下丘脑回路促进进食，从而恢复正常的能量水平(Marsin等人，2000年;Mu等人，2001年;Andersson等人，2004年;Minokoshi等人，2004年). AMPK通过变构机制被AMP激活并被ATP抑制。因此，AMPK是一种低能量水平的传感器，当AMP:ATP比率较高时会激活。AMPK是一种异三聚体复合物，由催化α亚基和调节β和γ亚基组成。这里，我们报告说秀丽线虫AMPKα亚单位AAK-2被AMP激活并发挥延长寿命的作用。我们发现高温脉冲（HTP）是一种降低能量水平、延长寿命和降低生育能力的环境压力源aak-2型-依赖方式。胰岛素样信号调节人的寿命秀丽线虫、果蝇和啮齿动物(蒂森巴姆和瓜伦特2002); 我们发现aak-2型和daf-16/FOXO平行调节寿命延长的功能daf-2/胰岛素样受体突变体。总之，我们的研究结果表明，AAK-2是一种将寿命与能量水平和胰岛素样信号相关的信息耦合起来的传感器。
结果和讨论
研究能量水平的变化是否是正常衰老过程的一部分秀丽线虫，我们首先测量了AMP:ATP比率随年龄的变化。活体动物的AMP:ATP比率从成年后第4天的<0.1增加到第18天的0.8，这个年龄接近种群的最大寿命(; 补充表2）。由于AMP:ATP比率随年龄变化，我们还询问AMP:TP比率是否与预期寿命相关。我们记录了一组平行动物的存活率，然后得出了每个年龄段动物的预期寿命。线性回归表明AMP:ATP比率和预期寿命之间有很强的相关性(). 基于这一观察结果，我们询问同龄动物AMP:ATP比率的差异是否可以作为预期寿命的预测因素。由于随机事件，老龄人口具有表型异质性(Herndon等人，2002年). 在同一年龄段的动物中，那些表现出自发运动的动物（I类）比那些只因刺激而运动的动物活得更长（II类）(Herndon等人，2002年). 我们在成年后第12天和第14天将活体动物分为这两类。然后将这些动物分组，以测量AMP:ATP比率或寿命。我们发现，与II类动物相比，I类动物的AMP:ATP比率更低，并且正如预期的那样，寿命更长(). 我们使用观察到的I类和II类动物的AMP:ATP比率，通过线性回归得出的拟合来预测预期寿命(). I类和II类动物的预期寿命与实验观察结果非常吻合(; 例如，在12天的成年人中，I类：预测4.3天，观察4.1天；II类：预测1.0天，观察1.3天）。因此，AMP:ATP比率的差异反映了随机事件对寿命的影响。确定AMP:ATP比率是否与包括人类在内的其他生物体的预期寿命相关将是一件有趣的事情。预期寿命的预测因素，如AMP:ATP比率，在临床上可能有用，可以预测老年痴呆症和心血管疾病等年龄依赖性疾病的易感性。
AMP:ATP比率预测预期寿命。(A类)生存曲线和AMP:ATP比率随年龄增长而增加。fem-1（hc17）；fer-15（b26）动物在25°C下生长；在这种温度下，它们缺乏精子，这有利于大量动物的生长。在平行培养中，在指定的时间记录存活动物的数量或腺嘌呤核苷酸的测量值。(B类)AMP：根据运动能力划分的12天和14天动物的ATP比率。“未选中”表示一组未根据运动性进行分离的动物。★P（P）<0.01和†P（P）<0.0001，与“未选定”相比#P（P）与I级相比<0.0001（未配对t吨-测试）。(C类)基于运动能力的12-d I类或II类或“未选择”动物的存活曲线。14天大鼠也获得了类似数据。寿命统计数据见补充表1。(D类)AMP:ATP比率作为动物预期寿命函数的最小二乘回归A类。在数据点旁边注明“未选定”动物的年龄。配合和R2数值仅从“未选择”的动物中确定。根据AMP:ATP比率和预期寿命（测量单位：B、 C类); 实际预期寿命与根据AMP:ATP比率预测的值密切相关。AMP:ATP比率随年龄的增加不仅仅是由于II类动物相对于I类动物的比例增加，因为12天I类动物AMP:TP比率高于4天I类的动物(P（P）<0.0001，未配对t吨-测试）。
由于能量水平随着年龄的增长而下降，预计寿命为秀丽线虫，一种感知能量水平的机制可能起到调节寿命的作用。一个可能的候选者是AMPK复合体(哈迪和霍利2001). 我们在秀丽线虫、AAK-1和AAK-2，分别与人类AMPKα1相同52%和40%，也与无脊椎动物SNF1蛋白有关(; 补充图1）。AAK-1和AAK-2的激酶域与人类AMPKα1亚单位的激酶域分别具有80%和71%的氨基酸同源性，包括保护关键苏氨酸残基，其磷酸化是激活AMPK所必需的(哈迪和霍利2001). 虽然初步证据表明aak-1型似乎不需要控制寿命（数据未显示），aak-2（ok524）突变体的寿命比野生型动物短12%(). 此外，一种类似脂褐素的荧光色素以年龄依赖的方式积聚在肠道中(Garigan等人，2002年;Herndon等人，2002年)以更快的速度积累aak-2型野生型动物的突变().aak-2型突变体在其他方面看起来很健康，因为它们能够正常移动、进食和排便（补充图2）。总之，这些结果表明aak-2型突变体是由于加速老化。此外，转基因动物具有较高的aak-2型基因剂量平均寿命比对照组长13%(). 因此aak-2型基因以剂量依赖的方式调节寿命。
AAK-2具有激酶活性和延长寿命的功能。(A类)AAK-1和AAK-2序列的系统发育分析。使用的其他序列包括hAMPKα1（GI:20178277）、hAMPK-α2（GI:20177276）、DmSNF1A（GI:17137472）、AtSNF1（GI:30678280）和ScSNF1（GI:6320685）。Bar为每个站点0.1个替换。(B类)减少、正常或增加动物的生存曲线aak-2型基因剂量。统计数据见补充表1。(C类)成人年龄和基因型对前肠荧光的代表性图片和量化（400毫秒曝光；bar为50μm；前部为左，背部为上）。★P（P）< 0.0001; 否则P（P）>0.05（未配对t吨-测试）。(D、 E类)使用SAMS肽测定法测量AAK-2-GFP免疫沉淀物中的激酶活性。(D类)增加AMP浓度会导致激酶活性增加。(E类)蛋白磷酸酶-1治疗可大大降低激酶活性。★P（P）<0.0001与未治疗组相比（未配对t吨-测试）。
为了确定AAK-2是否具有AMPK活性，我们询问它是否能磷酸化经典AMPK底物SAMS肽，以及它是否受AMP和磷酸化调节(Davies等人，1989年;Stein等人，2000年). 一种免疫沉淀的AAK-2-GFP融合蛋白秀丽线虫提取物磷酸化SAMS肽。此外，AMP使其激酶活性增加了三倍，在2.3μM时达到一半最大效应(). 对照GFP转基因动物的免疫沉淀物没有显示SAMS激酶活性（数据未显示），表明AAK-2-GFP的激酶活性是由于AAK-2。我们还发现，用蛋白磷酸酶-1处理AAK-2-GFP可使激酶活性降低90%(). 这表明AAK-2通常通过磷酸化激活，磷酸化对AAK-2的活性是必要的，即使存在AMP。因此，AAK-2表现出AMPK的特征(哈迪和霍利2001).
我们还研究了aak-2型在其他影响寿命的条件下。在许多生物体中，在生命早期亚致死剂量的应激源可以延长寿命（兴奋）(Minois 2000公司). 在秀丽线虫在生命早期接受高温、高压氧或氧化应激治疗可延长寿命(Cypser和Johnson 2002). 我们询问环境压力是否影响AMP:ATP比率。暴露于秀丽线虫高温、饥饿或线粒体中毒会导致AMP:ATP比率增加，恢复正常生长状态后会逆转(). 因此，AMP:ATP比率随着环境压力的存在而变化。然后我们确定高温对寿命的激素效应是否需要aak-2型活动。暴露于35°C高温高压下2 h存活时间较未经处理的对照组延长约30%的1 h龄野生型成年人(). 相反，相同的治疗不会影响aak-2（ok524）突变体(). 因此，aak-2型因高温应力导致的寿命延长。我们认为，高温应激后AMP:ATP比率的增加通过增加AAK-2活性导致寿命延长(). 随着寿命的延长，AMP:ATP比率在成年早期的短暂增加持续了许多天，应激源的“分子记忆”很可能是由下游靶点的AAK-2磷酸化介导的。
压力对野生型和aak-2型突变体。(A类)AMP：正常和应激条件下野生型动物的ATP比率。应力状态与正常生长的比较(★)，以及应力状态与应力反转的比较（†）。★和†，P（P）< 0.01;★★和††，P（P）<0.0001（方差分析）。(B类)高温脉冲对野生型动物寿命的影响aak-2（ok524）突变体。（HTP）早产儿1小时龄成人暴露2小时至35°C。统计数据见补充表1。(C类)35°C培养动物的存活率。aak-2（ok524）动物的寿命比野生型短28%(P（P）<0.0001，logrank检验）。aak-2（RNAi）与对照动物相比，动物在35°C下的寿命也较短（数据未显示）。(D类)对1 mM叠氮化钠杀灭18小时的敏感性。★P（P）与野生型相比<0.0001（未配对t吨-测试）。未经治疗的两种基因型对照动物均未在18小时后死亡（数据未显示）。(E类)高温脉冲（35°C下2小时）对野生型动物和aak-2（ok524）突变体。P（P）所有成对比较（ANOVA）均<0.0001。
之间的相互作用aak-2型胰岛素样途径突变体。(A类)的影响aak-2（ok524）关于daf-2型和daf-16型突变体。统计数据见补充表1。(B类)的角色aak-2型达斡尔族地层。★P（P）<0.0001与daf-2（e1368）（方差分析）。底部小组显示野生型动物和aak-2（ok524）变种在测试温度下不会形成dauer。aak-2（RNAi）也抑制了daf-2（e1368）突变体（数据未显示）。(C类)模型。AAK-2根据AMP:ATP比率和胰岛素样信号的变化调节寿命。
我们推断，无法感知和应对应激诱导的AMP:ATP比率增加可能导致aak-2型变种人应对压力能力较差。事实上，aak-2（ok524）变种动物比野生型动物更容易被高温杀死()或线粒体中毒(). 我们还测量了高温胁迫对后代生产的影响。使用HTP治疗1小时龄野生型优先成年人可使生育率降低82%(Lithgow等人，1994年;). 相反，aak-2（ok524）在这些条件下，突变体的生育率仅下降40%(). 因此，接触HTP会延长寿命并降低生育率，而这些过程取决于aak-2型这些结果与衰老的“一次性躯体”理论相一致，该理论预测，动物具有一种在能量限制条件下积极权衡寿命和生育能力的机制(Kirkwood等人，2000年). 我们认为AAK-2是该机械的能量传感器，因为AAK-2活性直接响应AMP:ATP比率的变化。
我们还询问是否aak-2型在调节寿命的胰岛素样信号通路中发挥作用(蒂森巴姆和瓜伦特2002). 影响胰岛素样受体DAF-2的功能减退突变延长寿命(Kenyon等人，1993年). 我们测量了aak-2（ok524）突变体和daf-2（m577）突变体，以及daf-2（m577）；aak-2（ok524）双突变体。daf-2（m577）；aak-2（ok524）双突变体的寿命与aak-2（ok524）单个突变体(). 的双突变体aak-2（ok524）和更强daf-2型功能减退等位基因的寿命也比daf-2型单个突变体（补充图3），尽管它们的寿命比aak-2（ok524）单个突变体。因此，aak-2型-独立以及aak-2型-需要依赖机制来产生超长的寿命daf-2型突变体。
我们还研究了aak-2型在dauer形成的调控中，另一个过程受胰岛素样信号通路调控。高温下，少年daf-2型突变体进入滞育状态（称为“dauer”），而不是成长为可生育的成虫(Riddle和Albert 1997). 他们不是以dauers的身份被捕daf-2；aak-2型双突变体在25°C下生长为可育成虫(). 这些结果表明aak-2型促进胰岛素样途径突变体的寿命延长和dauer形成(). 因为AMP:ATP比率daf-2型突变体与野生型动物的突变体相同()，其机制daf-2型突变体延长寿命必须独立于AMP:ATP比率。
表1。
| 基因型 | 平均ADP:ATP比值±SD | 平均AMP：ATP比率±SD | n个 | 能源费用 |
|---|
| 野生型 | 0.069 ± 0.011 | 0.020 ± 0.004 | 15 | 0.95 ± 0.01 |
| daf-2（e1370） | 0.068 ± 0.009 | 0.023±0.002 | 8 | 0.95 ± 0.01 |
FOXO转录因子DAF-16是胰岛素样途径突变体延长寿命所必需的(Kenyon等人，1993年;蒂森巴姆和瓜伦特2002). 如果aak-2型仅通过激活延长寿命daf-16型或调节其活动，然后aak-2型活动不应进一步缩短daf-16（mu86）空突变体(Lin等人，1997年). 相反，daf-16（mu86）；aak-2（ok524）双突变体的寿命比单突变体短15%(). 因此，aak-2型能够影响daf-16型-独立的方式。这些发现表明daf-16型和aak-2型是延长寿命所必需的daf-2型突变体，它们同时影响寿命().
最近的研究表明，LKB1激酶是一种广泛参与细胞过程的肿瘤抑制因子，可以通过直接磷酸化激活AMPK(Hawley等人，2003年;Woods等人，2003年;Shaw等人，2004年). 这个秀丽线虫同系物lkb1，标准杆-4，在早期胚胎细胞极性的调节中起作用(Watts等人2000). 我们询问是否第4部分，比如aak-2型，也在寿命和dauer形成的调节中发挥作用。因为第4部分突变体在早期胚胎发生过程中死亡，我们使用了对温度敏感的第4部分等位基因它47绕过胚胎需求第4部分活动。我们发现第4部分（it47ts）部分抑制daf-2（e1368）突变体（补充图4）。PAR-4和AAK-2可能在共同的途径中发挥作用，与AAK-2的PAR-4激活一致，因为第4部分和aak-2型突变体引起类似的胚胎后表型。
我们的研究结果强调了AAK-2是秀丽线虫调节寿命以应对环境压力和胰岛素样信号(). 该电路也可能受到来自感觉神经元和生殖系统的信号的影响，因为这些输入调节胰岛素样信号通路的活性(阿普菲尔德和凯尼恩1999;辛和凯尼恩1999). 值得注意的是，在大鼠心脏中也有类似的电路，胰岛素阻止AMPK被缺血或缺氧后出现的较低能量水平激活(Beauloye等人，2001年). 确定AAK-2磷酸化的靶点将有助于揭示AAK-2延长寿命的机制。这个电路对寿命的调节可能在进化上是保守的，因为它的许多成分调节其他生物体的寿命(Tschape等人，2002年;Tatar等人，2003年). 这个电路可能已经进化成允许动物在成年早期繁殖时优化利用其能量资源，这一想法与衰老的“一次性躯体”理论相一致(Kirkwood等人，2000年). 我们建议AAK-2通过整合来自AMP:ATP比率和胰岛素样信号的信息来协调这一过程。因此，动物的寿命可以根据各种生理和环境条件进行调整。
材料和方法
一般方法和菌株
野生型秀丽线虫是Bristol N2。除非另有说明，否则实验是在20°C下进行的。所有涉及的实验fem-1（hc17）；fer-15（b26）在25°C下进行。使用了以下基因和突变：LG I：daf-16（mu86）; LG二：fer-15（b26）; LG三：daf-2（e1368）、daf-2; LG四：fem-1（hc17），par-4（it47）; LG X（长度X）：aak-2（ok524）.
菌株的构建
通过杂交构建双突变体aak-2（ok524）雄性到具有所需第二个突变的雌雄同体，允许个体F1后代自我受精，然后识别F2具有与第二个突变对应的表型的动物，将这些动物转移到单独的平板上并鉴定aak-2（ok524）利用引物ATGTCGTTGGAAAAGATTCGC和CAATGCTGGACTCTCTCTCGG对其后代进行PCR，得到纯合子。27°C Daf-C表型用于鉴定daf-2型突变体。daf-16（mu86）和daf-16（+）通过PCR进行区分(Lin等人，1997年).daf-2（e1368）；第4部分（it47ts）双突变体是按照类似的方案构建的，首先是第4部分（it47ts）杂合子男性。第4部分（第47页）纯合子被鉴定为其后代在25°C时均为Emb的动物。
转基因动物
通过微量注射100 ng/mL PCR-扩增DNA片段以生成染色体外阵列来进行转化挽救。这个aak-2型基因组片段由引物TGGGATTCCGTCAAAGAGACATG和AACAGAAAACAATCGCTGAAGG生成，分别包含3.0 kb和1.2 kb的DNA上游和下游aak-2型编码序列。这种转基因完全挽救了daf-2（e1368）；aak-2（ok524）双突变体。cc:：GFP构建物（由P.Sengupta提供）在体腔细胞中表达GFP，并用作转化标记物。AAK-2-GFP结构是通过PCR-融合aak-2型基因组区域和GFP cDNAunc-54号机组来自pPD95.77的3′UTR，使用所述的引物GAAGAGAGAGAAAGTGGGCGTATGCC、AGGGTCCTGAATGTTCCAGCCAGTGTTCCAATCAATCAC、GCATTGGAACTGTCCGGGAACATTTTCAGGAGCTCT和AAGGGCCCGACTAGTAGG(霍伯特2002).daf-2（e1368）；aak-2（ok524）；fyIs2[AAK-2-GFP 100 ng/mL]通过紫外光（254nm）照射整合染色体外阵列生成，并四次交叉为野生型。财年2完全挽救Daf-d表型daf-2（e1368）；aak-2（ok524）温度为25°C。
激酶测定
约100002号财年在250μL IP缓冲液（pH 7.5下50 mM Tris，50 mM NaCl，50 mM-NaF，1 mM EDTA，1 mM-EGTA，1 m M DTT，5 mM焦磷酸钠，1mM PMSF4和蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche]）。用兔多克隆抗GFP抗体ab290（Abcam）孵育约1 mg蛋白质提取物，并用蛋白G Sepharose珠（Amersham）在IP缓冲液中进行免疫沉淀。通过简单离心收集免疫复合物，并在IP缓冲液中广泛清洗。免疫沉淀物中的AMPK活性通过SAMS肽（HMRSAMSGLHLVKRR）的磷酸化测定，如所述(Hardie等人，2000年)使用[γ-33P] ATP并在MicroBeta TriLux液体闪烁计数器（PerkinElmer）中计数。通过SDS-PAGE解析的激酶反应放射自显影证实SAMS肽被磷酸化。在适当的情况下，免疫沉淀用0.5单位重组兔蛋白磷酸酶-1（NEB）在30°C下脱磷酸30分钟，然后在IP缓冲液中洗涤三次，然后进行SAMS分析。
寿命分析
按照说明进行寿命分析(阿普菲尔德和凯尼恩1999). 在L4蜕皮时，将动物转移到含有20μM 5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR，Sigma）的培养皿中，该培养皿将其后代作为胚胎杀死。对照实验表明，FUDR的浓度对寿命没有显著影响。我们使用L4蜕皮作为t吨=0表示寿命分析。每个年龄段的预期寿命计算为该年龄段存活动物的剩余平均寿命。按照说明进行生存能力和运动评估(Herndon等人，2002年). 我们使用JMP 5.0（SAS）软件进行所有统计分析，并确定平均值和百分位数。
核苷酸测量
采用Stocchi等人报告的方法获得高氯酸提取物(1985)至秀丽线虫用M9缓冲液（22 mM KH）清洗100到400只手抓活蠕虫2人事军官4，34毫微米K2高性能操作4，86 mM氯化钠，1 mM硫酸镁4单位H2O） 并重新悬浮在20μL M9缓冲液中。40微升冰镇8%（v/v）HClO4然后立即进行三次30秒的超声波处理和30秒的冰上处理。溶液用1N KHCO中和三并短暂离心，上清液通过0.2μm过滤器（Nanosep），并使用Targa C18 250×4.6 mm 5μm柱进行反相色谱，如所述(Stocchi等人，1985年). 用Waters 486可调检测器在260 nm处检测核苷酸。使用Peak Explorer软件测量峰面积。核苷酸的同一性通过与已知标准的结合得到了证实。除非另有说明，动物都是1-d岁的成年人。
致谢
我们感谢Piali Sengupta提供cc:：GFP构造；Mary Sym、Douglas Crawford、Andrew Dillin、Natasha Libina和Joy Alcedo负责协议；詹妮弗·旺博（Jennifer Whangbo）、辛西娅·凯尼恩（Cynthia Kenyon）、莱尼·瓜伦特（Lenny Guarente）以及凯尼恩实验室和药剂的成员对手稿进行了有益的讨论和评论；以及长生不老社区的支持和鼓励。一些秀丽线虫本研究中使用的菌株由隐杆线虫病遗传中心。
笔记
补充材料可在http://www.genesdev.org。
文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1255404。
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