简介
一些PARP抑制剂（PARPI）正在进行高级临床试验，奥拉帕尼最近被批准用于携带BRCA突变的晚期卵巢癌。所有临床PARPI都是具有竞争力的NAD+抑制剂。它们都能阻止聚（ADP-核糖基）化（PARylation）[1,2]这是碱基切除修复（BER）的关键步骤，BER是修复DNA单链断裂（SSB）的主要途径[三,4]. 由于SSB是PARP1和PARP2修复的最常见内源性DNA损伤之一，并且在BRCA缺陷细胞中发现了PARP抑制剂的合成致死性，PARPIs发挥细胞毒性的机制主要被解释为SSB的积累，在同源重组缺陷的癌细胞中复制停滞时导致致命的DNA双链断裂[5,6]. 进一步研究表明，与PAR化抑制剂具有同等效力的PARPI具有不同的细胞毒性[2,7,8]这种不同的细胞毒性是由药物在SSB上稳定PARP-DNA复合物的效力所驱动的（PARP-tracting）[7,8]. 因此，临床PARPI因其PARP捕获能力不同而不同（塔拉唑帕林>>尼拉帕林≈奥拉帕林«鲁卡帕林>>veliparib），这与它们的细胞毒性效力相对应[9].
PARP-DNA复合物可能是复制的障碍，并诱导复制性DNA损伤[8]. 为了应对复制性损伤，ATR（共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白激酶）在协调细胞周期进展和DNA修复方面发挥着重要作用[10,11]. ATR通过磷酸化丝氨酸345处的细胞周期检查点激酶1 CHK1激活S期检查点，减缓复制叉（延长检查点），稳定停滞的复制叉并防止复制源触发（源触发检查点）[12-14]. S期检查点促进DNA修复，防止过早有丝分裂，从而保持基因组稳定性[10,11]. ATR或CHK1抑制剂导致S期检查点丢失，导致S期复制源的非计划放电和DNA双链断裂的诱导[13,15-17].
美国国家癌症研究所（US National Cancer Institute）的癌细胞系（NCI-60）来源于9种组织：乳腺、结肠、皮肤、血液、中枢神经系统、肺、前列腺、卵巢和肾脏，是最具注释性的一组癌细胞系，具有全基因组表达和突变特征，对超过200000种化合物有药物反应[18-20]以及各种分子和细胞过程[20,21]. 利用NCI-60，我们之前发现施拉芬11(SLFN11型)表达为对拓扑异构酶（Top）1抑制剂、Top2抑制剂、烷基化剂和DNA合成抑制剂反应的意外基因组决定因素[22-24]. 独立地，SLFN11被确定为癌症细胞系百科全书（CCLE）更大数据库中Top1抑制剂的预测基因组生物标记物[25]. 重要的是，缺乏SLFN11型NCI-60和CCLE组约45%的癌细胞中观察到mRNA表达。SLFN11对药物敏感性的重要性最近已扩展到尤因肉瘤[26]卵巢癌、非小细胞肺癌和结直肠癌患者的反应[23,24,27]. 最近的一项研究表明，SLFN11通过从单链DNA中去除RPA来抑制检查点维持和同源重组[28].
虽然他拉唑帕林是PARP捕获最有效的PARPI[7,9]，大约一半的NCI-60细胞系对该药物高度耐药，即使用100μM的塔拉佐帕林治疗细胞，细胞存活率也高于50%（约为临床相关血药浓度的1000倍）[7]. 另一方面，大约一半的细胞株在IC的低微摩尔或纳米摩尔范围内对他唑帕林高度敏感50（抑制浓度50%）。虽然BRCA状态可能会影响每个细胞系的差异敏感性，但纯合有害突变或缺乏表达导致的BRCA缺乏仅在NCI-60细胞系中发现[22]. 此外，这种BRCA2缺陷细胞系（HCC2998）对他拉唑帕尼具有耐药性[7]（图). 因此，除BRCA外，尚未发现的对他拉唑帕林、奥拉帕林和其他PARPI反应的决定因素尚待发现。在本研究中，我们证明了SLFN11的表达在肿瘤细胞系和异种移植模型中作为塔拉唑啉反应决定因素的重要性，并将这些发现扩展到奥拉帕利和塔拉唑嗪与替莫唑胺的联合应用。我们还为克服PARP抑制剂在SLFN11型-PARP和ATR抑制剂联合使用的阴性细胞。
SLFN11型表达与他拉唑帕林敏感性高度相关答：。以平均值为中心的条形图[20]代表SLFN11型NCI-60中的表达（左）和对他拉唑帕林（左中）、奥拉帕林（右中）和veliparib（右）的敏感性。颜色代码对应于侧面注释的原始组织[20]. 皮尔逊相关系数(第页)和双面P（P）价值(第页)协议双方：SLFN11型每个图表上方显示了转录本和他拉唑帕林或奥拉帕林或veliparib。这个SLFN11型-用于进一步分析的阴性细胞系为蓝色字体（MDA_MB-231、HCT-116、HT29和K-562）SLFN11型-红色阳性细胞系（SF-295、CCRF-CEM、MOLT4和DU-145）。B。所示细胞系和抗体的全细胞提取物的免疫印迹。成绩单等级SLFN11型从所示细胞系中的NCI-60（SF-295、DU145、MDA_MB-231、HCT-116和HT29细胞系）和癌症细胞系百科全书（EW8和A673细胞系）数据库中获得的数据以条形图显示。C、。用所示PARPI连续治疗72小时后，所示细胞系的存活曲线。ATPlite分析用于测定细胞活力。未处理细胞的存活率设置为100%。误差条代表标准偏差（SD，n个≥ 3). 药物IC90值μM在右下角列出。EW8和A673是尤因肉瘤细胞系
结果
SLFN11型表达与PARP抑制剂敏感性相关
为了确定新的基因决定簇对他拉唑帕林的反应，我们利用了他拉唑巴林（BMN 673）已经在NCI-60中进行了测试的事实[7]以及通过Web应用程序CellMiner提供的广泛NCI-60基因组数据库(http://discover.nci.nih.gov/cellminer网站/) [20,22].施拉芬11(SLFN11型)作为排名最高的基因之一（皮尔逊的第页= 0.62,第页= 5.4×10−7)（图). NCI-60数据库中的另外两种PARP抑制剂奥拉帕利和维利帕里布与SLFN11型表达式（图，右侧面板）。
之间的相关性SLFN11型在五个NCI-60细胞系中独立测试了PARPI的表达和反应，其中两个细胞系的SLFN11型转录本，前列腺DU145和CNS SF295，三个低转录本，乳腺MDA_MB231，结肠HT29和HCT116。此外，我们检测了两种尤因肉瘤细胞系EW8和A673，其高表达SLFN11型成绩单[25,26]. SLFN11蛋白水平与转录水平一致（图).SLFN11型-阳性细胞（红色）对低IC的他唑帕林和奥拉帕林更敏感50（抑制浓度50%）SLFN11型-负极电池（蓝色）（图). 差分灵敏度SLFN11型-与奥拉帕林相比，塔拉唑帕林的阳性细胞与阴性细胞更为明显。另一方面，对于veliparib，没有一个细胞达到IC50药物浓度高达25μM。这些结果表明，SLFN11的表达与PARP捕捉抑制剂（olaparib和talazoparib）的敏感性相关，但与相对纯的催化性PARP抑制剂（veliparib）无关[7,9].
遗传失活SLFN11型使癌细胞对PARPI产生耐药性
为了确定SLFN11与PARPI敏感性的因果关系，我们得出SLFN11型-已删除(SLFN11型-del）来自四个高SLFN11型（前列腺DU145、白血病CCRF-CEM和MOLT4以及尤因肉瘤EW8）[23,26]使用CRISPR/Cas9(图S1). 为了避免导向RNA序列与非靶基因组区域的相似性造成的非靶效应，我们设计了两个导向RNA序列（A）和（B），并使用每个细胞系中的每个导向RNA生成独立的克隆。在没有药物治疗的情况下，亲代和对照组的细胞周期或生长速度没有明显差异SLFN11型-四个细胞系的del细胞(图S1).
全部四个SLFN11型-在72小时细胞活力测试中，del细胞系与亲代细胞系相比，对塔拉唑帕林和奥拉帕林均表现出耐药性（图). 克隆测定得到了一致的结果(图S2A)siRNA转染导致SLFN11急性耗竭(图S2B). siRNA对SLFN11的耗竭与PARP1本身的耗竭具有同样的抵抗力，PARP1自身介导了塔拉唑帕林和奥拉帕林的细胞毒性[7,8] (图S2B). 相反，SLFN11在白血病K562细胞中的外源性表达SLFN11型成绩单（图)对他唑帕林和奥拉帕林过敏(图S2C). 因此，我们得出结论：SLFN11型是PARP抑制剂敏感性的主要决定因素。
SLFN11型失活导致对他拉唑帕林和奥拉帕林产生耐药性答：。指示亲本和SLFN11型-del细胞系对他唑帕林或奥拉帕林的反应。活性测定如图所示错误条代表SD(n个≥ 3).B。指示的亲本对（红色）和SLFN11型-单独用替莫唑胺处理的del（蓝色）细胞（圆形）或替莫唑酰胺加上10 nM他唑帕林（+T，三角形）。未处理细胞的存活率设定为100%。误差条代表SD(n个≥ 3)
经FDA批准用于胶质母细胞瘤的替莫唑胺与PARPIs具有高度协同作用，即使其浓度既不影响细胞活力，也不影响细胞存活[7,29]. 这是因为替莫唑胺烷基化鸟嘌呤N7，导致碱性位点和单链断裂，招募PARP1和PARP2并导致PARP捕获[29]. 因此，PARP抑制剂和替莫唑胺的联合应用目前正在对BRCA状态以外的各种癌症进行临床试验[30]. 我们比较了四个等基因亲本和SLFN11型-del单元格（图). MGMT（O）6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶）状态可以确定替莫唑胺的敏感性[31,32]. 用于敲除的所有四个细胞系SLFN11型MGMT有效（数据未显示），因此对替莫唑胺高度耐药，因为O6-甲基鸟嘌呤加合物很容易被MGMT修复，而N7-甲基鸟嘌酰胺产生的DNA缺口[32]在PARP1/2高效细胞中容易修复（图). 添加他唑帕林显著且协同地使亲代细胞对替莫唑胺敏感。然而，在SLFN11型-del细胞，该组合具有边际效应（图). 这些结果表明SLFN11型表达决定了MGMT产生细胞对PARP抑制剂-三唑胺组合的敏感性。
SLFN11型不影响药物渗透或同源重组（HR）激活
对PARPI的两种公认抵抗机制包括[33,34]：1/重新激活HR，使细胞克服复制性损伤[35-37]和2/激活多药耐药（MDR）外排泵，限制细胞药物水平[33]. 为了检查SLFN11是否参与这些抗性机制，我们首先检查了对他拉唑帕尼的PARP捕获动力学[8]（图). 在染色质结合组分中观察到类似的PARP1积累，无论细胞SLFN11型状态，表明SLFN11不影响细胞对他唑帕林的渗透或流出。
DNA损伤和同源重组的可比诱导SLFN11型地位答：。在父母（左）和SLFN11型-使用染色质结合组分通过Western blotting将细胞（右）分离为三对细胞系（CCRF-CEM、MOLT4和DU145）。在不使用药物（0）或使用他拉唑帕林（1μM）加甲基甲磺酸甲酯MMS（0.001%）的情况下处理细胞，以增强PARP捕获检测[8]在指定的时间内。用指示的抗体对斑点进行检测。B。他拉唑帕尼诱导S期损伤。将指示的细胞在不使用或使用他拉唑帕尼（1μM）的情况下处理12小时。流式细胞术分析γH2AX水平。用碘化丙啶（PI）染色的DNA含量位于x轴上，FITC测量的γH2AX水平表示y轴（对数刻度）。每个面板的左上角显示了来自3个独立实验的γH2AX阳性细胞的平均数量（%）。C、。DU145亲本和SLFN11型-del细胞用或不用他拉沙必布（1μM）处理3小时。显示了典型的共焦显微镜图像。使用ImageJ软件（NIH）进行量化。N个= 99-115. ***第页< 0.0001.D。BRCA2与SLFN11并行工作。使用对照siRNA（siCtl）和巴西航空公司2siRNA（si地下二层/硅巴西航空公司2)在指定的细胞系中进行。抑制巴西航空公司2转染后2天通过RT-PCR建立mRNA（top）。对DU145细胞（中部）进行集落形成试验，对EW8细胞（底部）进行72小时存活试验。误差条代表SD(n个≥ 3)
接下来，我们研究了PARP捕捉诱导的复制损伤以及SLFN11的作用是否与HR相关SLFN11型表达式（图)这表明，无论SLFN11状态如何，他拉唑帕林都能诱导复制性损伤。通过免疫荧光显微镜测量的γH2AX和RAD51病灶的强度在DU145亲代和SLFN11型-用他拉唑帕林处理del细胞3小时（图). 由于BRCA1/2是RAD51病灶形成所必需的，因此两种细胞系中RAD51灶形成的水平相似，表明BRCA1/2的功能依赖于SLFN11。
为了进一步研究平行活动SLFN11和HR，我们耗尽了巴西航空公司2通过siRNA转染，比较DU145和EW8亲本和SLFN11型-del单元格（图). 与已知HR在PARPI反应中的作用一致，BRCA2缺失增加了父母对他拉唑帕林的敏感性SLFN11型-表达DU145和EW8细胞。此外，BRCA2的缺失也降低了SLFN11型-del细胞，这种致敏作用与亲代细胞一样广泛。这些结果表明，无论SLFN11如何，HR都是功能性的，并且SLFN1参与的途径与目前公认的HR和药物外排途径不同，后者决定了对PARPI的反应。
SLFN11型在他拉唑帕林治疗下诱导延长S期阻滞，并发挥细胞凋亡作用
因为他拉唑帕林诱导复制性DNA损伤（图)，我们检测了SLFN11对他唑帕林治疗后细胞周期进展的影响。作为对他拉唑帕林的反应，DU145亲代细胞在24小时时表现出明显的S期阻滞，同时抑制了BrdU在S期中期和晚期的掺入，并在48小时时抑制了整个S期的掺入（图, 1, 3, 7). 相比之下SLFN11型-del细胞在24小时时表现出减弱的复制抑制，在48小时时达到G2期（4N）（图, 2, 5, 9). 其他三个等基因细胞系也获得了类似的结果。它们还显示出更高的G2峰SLFN11型-del细胞比亲代细胞中的del细胞明显减少，而亲代细胞在24小时接受他拉唑帕利治疗后出现中期S期阻滞(图S3). 因为长时间的复制分叉停滞会导致致命的复制体解体和分叉断裂[38]，长时间的S期停搏可能导致对PARP抑制剂的超敏反应SLFN11型-表达细胞。
ATR抑制剂（VE-821）增强PARPIs的活性SLFN11型-del细胞答：。DU145亲本和SLFN11型-del细胞按指示处理24或48小时。实验协议如右图所示。垂直虚线对应2N和4N DNA含量。B。对所示细胞系的细胞毒性，以对联合或不联合1μM VE-821（+V）的塔唑帕林和奥拉帕林的反应。未经治疗的父母和SLFN11型-del细胞。绘图和实验如图所示错误条代表SD(n个= 3)
凋亡分析显示，在接受他唑帕林治疗后48小时，DU145和CCRF-CEM亲代细胞的凋亡细胞百分比分别从9%增加到29%和从5%增加到58%。相比之下，在SLFN11型-del DU145和CCRF-CEM细胞中，凋亡细胞的百分比仅从5%略微增加到9%，从5%增加到7%(图S4). 这些结果表明，SLFN11可增强S期阻滞，SLFN1延长S期阻滞可诱导细胞凋亡，并导致对PARP抑制剂的超敏反应。
ATR抑制克服了SLFN11型-PARPI阴性细胞
由于ATR在协调细胞周期进展和DNA修复以应对复制性损伤方面发挥着重要作用，我们研究了SLFN11是否影响ATR依赖的S期检查点。我们测量了ATR的关键效应因子磷酸化-CHK1（S345）[10,11]治疗后。在父母和SLFN11型-四对细胞系中的del细胞(图S5)，证明塔拉佐帕林激活ATR独立于SLFN11。
为了确定SLFN11依赖性S期阻滞是否与ATR有关，我们将ATR抑制剂（VE-821）与他拉唑帕林联合使用SLFN11型-del细胞，但在48小时时随着亚G1群体的积累而诱导不完全复制（图，6和10），表明ATR介导的S期检查点主要调节SLFN11型-del细胞。另一方面，在24小时和48小时时，ATR抑制在亲代细胞中的作用微乎其微，S期峰的大部分仅略微移动到4N（图、4和8）。这些结果表明，SLFN11与ATR介导的S期检查点平行地抑制DNA复制。
ATR抑制剂，正在临床开发中[17]与拓扑异构酶抑制剂、吉西他滨、顺铂和veliparib等DNA损伤剂协同作用，取消S期检查点，导致DNA损伤累积。因为ATR抑制对SLFN11型-阳性细胞，同时对SLFN11型-阴性细胞，我们检测ATR抑制剂是否对SLFN11型-阳性和阴性细胞。PARP抑制剂与VE-821或不与VE-821联合使用的存活率测定表明，ATR抑制与塔拉佐帕尼和奥拉帕尼在亲代和SLFN11型-del单元格（图). 然而，在所有四种同基因细胞系中，协同作用始终更大（组合指数（CI）值更低）SLFN11型-亲细胞中的del（图和表S1).
与细胞周期和生存能力测定结果一致，凋亡细胞从9%增加到34%SLFN11型-del DU145细胞，而单用他拉唑帕林时，细胞数已经很高（29%），而ATR抑制仅使细胞数略有增加（从29%增加到38%）SLFN11型-阳性DU145细胞(图S4A). 使用CCRF-CEM母体和SLFN11型-del细胞(图S4B). 这些结果证明了将他唑帕林或奥拉帕林与ATR抑制剂联合使用的潜在价值，特别是作为克服抗肿瘤药物SLFN11型-PARP抑制剂阴性细胞。
用36个小细胞肺癌（SCLC）细胞系进行筛选，结果显示SLFN11型表达与他唑帕林敏感性
因为PARP抑制剂对小细胞肺癌患者具有良好的活性[39,40]，我们扩展了NCI-60和我们的四个等基因SLFN11型-将细胞株分为36个小细胞肺癌细胞株（表S2）。所有细胞均已从Broad CCLE门户网站发布基因组图谱（基因表达数据），并对SLFN11型表达显示出非正态分布，其中一半的细胞系（36个中的18个）具有最小或没有SLFN11型表达式（Log2值低于4.5）和15/36具有高SLFN11型表达式（大于6.5的Log2值）（图，Y轴）。接下来，我们测量了IC5036个SCLC细胞系中的他拉唑啉（50%抑制浓度）（表S3）。SLFN11型转录水平与IC显著相关50他拉唑帕林(第页<0.01，图). 我们还通过Western blotting测定了小细胞肺癌细胞系中SLFN11的蛋白水平，发现蛋白水平与SLFN11型成绩单（图)，这与我们的NCI-60数据一致（图) [23].
SLFN11型在小细胞肺癌（SCLC）细胞中，表达与单药或与替莫唑胺联合使用塔拉唑啉的敏感性相关在体外和体内答：。之间的相关性SLFN11型表达（mRNA）和IC50在SCLC细胞系中使用他拉唑帕林。皮尔逊系数相关：r=0.438，p<0.01。B。对选定的SCLC细胞系进行检查SLFN11型转录和蛋白质水平。将所示细胞系和抗体的全细胞提取物的蛋白质印迹与SLFN11型从Broad CCLE数据库获得的转录水平。C、。在SCLC细胞系中，联合使用10μM替莫唑胺（y轴）和单药（x轴）对塔拉唑啉的反应之间的相关性。皮尔逊系数相关性：第页= 0.9041,第页< 0.0001.D。使用NCI-H209（高SLFN11型，高MGMT公司)，NCI-H841（低SLFN11型，高MGMT公司)和NCI-H1092（高SLFN11型，低MGMT公司). 荷瘤小鼠（体积~125 mm三)用载体、替莫唑胺、他拉唑帕利或两者联合治疗。治疗计划在图表中有注释（见材料和方法）。绘制肿瘤体积（左）和体重相对变化（右）。误差条代表SEM(n个= 8)
因为他唑帕林与替莫唑胺联合使用具有显著的协同作用[29]尤因肉瘤模型中的活性[41]，我们评估了替莫唑胺和他拉唑帕利在SCLC细胞系中的联合作用。我们将无毒剂量的替莫唑胺（10μM）与一系列他唑帕林浓度相结合，并测定IC50在有或无替莫唑胺的情况下服用他唑帕林（表S3）。在36个细胞系（Pearson’s第页= 0.904,第页<0.0001，图)支持塔拉佐帕林是该组合的细胞毒性成分的观点[29]. 此外，替莫唑胺降低了IC50塔拉佐帕林的值约为10倍（图). 总的来说，这些数据表明，在SCLC细胞系中，SLFN11型表达决定了细胞对他唑帕利和他唑帕林-替莫唑胺联合用药的敏感性，表明替莫唑酰胺与他唑帕里联合用药在SLFN11型-SCLC阳性。
联合应用他唑帕林-替莫唑胺在SCLC异种移植模型中表现出更强的协同作用SLFN11型-正值大于SLFN11型-阴性细胞
接下来，我们使用三种不同的SCLC细胞系在异种移植模型中检测了他唑帕林-替莫唑胺联合用药SLFN11型和MGMT公司状态：NCI-H209（高SLFN11型，高MGMT公司)，NCI-H841（低SLFN11型，高MGMT公司)和NCI-H1092（高SLFN11型，低MGMT公司)（表S3）（图). 先前的一篇论文表明，MGMT阳性癌细胞对替莫唑胺和PARP抑制剂（PARPi）的联合反应强烈，而MGMT缺乏的细胞则没有反应，因为MGMT阴性细胞主要被低剂量替莫唑酰胺产生的未修复的O6-甲基鸟嘌呤杀死[42].
作为NCI-H209细胞（高SLFN11型表达）对每日塔拉唑帕林治疗反应良好[43]在本研究中，为了检测他唑帕林+替莫唑胺联合用药的效果，我们在最初的4或5天内给药，然后让小鼠停药至少14天。我们首先使用低剂量替莫唑胺测试了一系列联合方案，并发现不同宿主小鼠菌株可以耐受替莫唑酰胺（3 mg/kg/天，持续4-5天）和他唑帕林（0.25-0.33 mg/kg/日，持续4-五天）（图). 然后，我们对这些模型中的每种单药与他唑帕林和替莫唑胺联合用药进行了比较评估。虽然替莫唑胺和他拉唑啉单独在NCI-H209和NCI-H841异种移植模型中具有边际抗肿瘤活性，但联合用药在NCI-H209中诱导了显著的协同作用（高SLFN11型)但不在NCI-H841中（低SLFN11型)（图). 另一方面，替莫唑胺单独使用足以降低NCI-H1092的肿瘤生长（低MGMT公司)异种移植（图). 这些结果表明SLFN11型在肿瘤模型中，这种表达可以决定细胞对他唑帕林和替莫唑胺联合治疗的敏感性，如果肿瘤细胞MGMT阴性，替莫唑酰胺单次治疗足以减少肿瘤生长。
讨论
我们的研究将SLFN11确定为细胞对PARPIs（他唑帕林和奥拉帕林）反应的因果和主导决定因素，并将其作为单一药物与替莫唑胺联合使用。这是第一份证明SLFN11通过阻断DNA复制而独立于ATR，从而独立于同源重组和药物流出影响细胞对PARPI的反应的报告。此外，我们为评估SLFN11作为PARPI治疗患者反应的潜在重要生物标志物，以及联合ATR和PARP抑制剂以克服SLFN11型-PARPI阴性细胞。
的临床意义SLFN11型用于精准医疗
值得注意的是，SLFN11的影响取决于PARP捕获，PARP捕获取决于PARPI[8,9]. 我们对NCI-60的数据挖掘很容易挑选出塔拉唑帕利，它是最有效的PARP捕捉抑制剂[7]显示了癌细胞杀伤与SLFN11型转录水平（图). 我们还发现，olaparib敏感性而非veliparib敏感性与SLFN11型表达式（图). 此外SLFN11型表达和olaparib反应也出现在最近发布的独立数据库中，其中包括780个接受olaparip治疗的癌细胞株(http://www.broadinstitute.org/ctrp/) [44]. 然而，在我们的实验中，SLFN11状态对药物敏感性的影响塔拉唑帕利高于奥拉帕利。与PARP捕获和SLFN11型我们发现，通过联合使用他唑帕林或奥拉帕林和替莫唑胺增加PARP捕捉[29]屈服，屈服SLFN11型-相关响应（图). 虽然绒毛膜肋骨具有微弱的PARP捕捉能力[8,9]与替莫唑胺通过催化抑制和高剂量PARP捕捉发挥细胞毒性[45]. 随着研究的深入，Lok等人使用SCLC细胞系和SCLC患者衍生异种移植模型得出了类似的结论[46]. 这两项研究共同表明SLFN11型作为一种主要的生物标记物，用于预测PARPIs作为单一药物对PARPI的反应，单一药物通过诱捕PARP和破坏DNA发挥作用（塔拉唑帕利、奥拉帕利，可能还有尼拉帕利和鲁卡帕利），以及广泛的PARPIs与替莫唑胺联合方案，这些方案正在进行大量临床试验。
PARPIs对BRCA缺陷细胞的合成致死性是一个很好的策略，但事实上并非所有BRCA缺陷肿瘤都对PARP抑制剂有反应[47,48]PARPI在同源重组缺陷（HRD）之外也具有活性[8,49,50]. 这里我们展示一下SLFN11型表达对PARPI的敏感性与BRCA缺乏状态平行（图和). 因此，含有HRD的肿瘤以及SLFN11型表达应该比含有这两个参数的肿瘤有更好的反应。相反，没有HRD和缺乏HRD的肿瘤SLFN11型表达应该是PARPI反应最差的（图). 因为大约45%的癌细胞系SLFN11型-转录水平为阴性[23,25]，经常通过启动子超甲基化[24]，除了BRCA突变和HRD外，SLFN11可以被认为是一种可测试的生物标志物，用于预测PARPI的应答。SLFN11可通过免疫组织化学方法从组织样本中检测到[27] [46]. 由于SLFN11决定了除PARPI外对广泛的DNA损伤药物的反应，因此需要进一步的临床研究和分析来评分肿瘤样本中SLFN1的表达，如乳腺癌中雌激素受体的常规免疫组织化学检查。
提出SLFN11在平行于ATR和同源重组（BRCA1/2）中的作用的总结方案红色方框表示细胞存活的不利因素，而蓝色方框表示细胞生存的支持因素。有关详细信息，请参阅讨论。
如何SLFN11型使癌细胞对PARPIs敏感？
对PARPI的两种公认抵抗机制包括[33,34]：1/重新激活HR，使细胞克服复制性损伤[35-37]和2/激活多药耐药（MDR）药物外排泵，限制细胞药物水平[33]. 然而，两者都与SLFN1无关，因为SLFN1在早期并不影响DNA损伤水平（PARP-trapping、γH2AX和RAD51水平，图和). 我们的结论是，无论SLFN11型表达，这似乎与最近出版的Mu等人[28]他发现SLFN11通过去除单链DNA上的RPA来抑制检查点维护和同源重组。然而，他们的结论是基于喜树碱脉冲治疗（1小时治疗，然后在无药物培养基中清洗和释放）后24小时和48小时收集的数据得出的，当细胞周期分布不同于SLFN11型-阳性和阴性细胞[23]. 我们的研究表明，SLFN11诱导延长的S期阻滞，至少持续到塔拉唑帕利治疗后48小时，而SLFN11型-阴性细胞继续细胞周期进程直到达到G2期（图). 由于姐妹染色单体在S期中期被SLFN11阻断复制的情况下不完全可用，因此，在相对较晚的时间点，SLFN11可间接降低以RPA和RAD51病灶为标志的HR，并因RPA负载减少而降低ATR激活。与Mu等人的报告一致，我们观察到在SLFN11型-del单元格比SLFN11型-塔拉佐帕利治疗24小时后阳性细胞（数据未显示）。我们不排除Mu等人提出的SLFN11通过去除RPA聚合物抑制HR的可能性[28]. 然而，我们和Mu等人在药物治疗后的早期时间点观察到RAD51病灶的形成与SLFN11无关（图)，表明BRCA对RAD51沉积有效，SLFN11不会直接干扰BRCA等HR因素。我们使用siRNA BRCA2的实验支持了我们的结论，即SLFN11与HR并行作用（图和). 因此，我们得出以下结论：SLFN11型-缺陷细胞不是由药物渗透受损或同源重组激活引起的，而是由DNA损伤后持续的细胞复制潜能引起的。
我们的数据清楚地表明，SLFN11抑制复制，并在塔拉唑帕林治疗下迫使细胞周期中期停滞，而SLFN11型-阴性细胞继续复制并达到G2（图). 因为复制叉的长时间停滞会导致致命的复制体解体和叉断裂[38]SLFN11延长S期阻滞可能是导致SLFN11型-PARP抑制剂的依赖性细胞杀伤。事实上，我们发现在接受他拉唑帕林治疗后，凋亡细胞数量增加SLFN11型-阳性细胞(图S5). 因此，我们认为SLFN11延长S期阻滞会导致细胞凋亡和对PARP抑制剂的超敏反应。需要进一步研究来阐明SLFN11如何抑制复制的分子细节。
结合ATR和PARP抑制剂克服PARPI耐药性的原理SLFN11型灭活
尽管缺乏SLFN11型表达是对PARP抑制剂产生耐药性的主要原因，我们证明添加ATR抑制剂可以克服这种耐药性（图). ATR是复制性损伤下S期细胞周期的守护者[10,11]. ATR抑制促进非计划起源放电，并产生过量单链DNA，导致分叉断裂和细胞死亡[16]. ATR抑制通过在复制应激下加速复制而杀死细胞，相反，SLFN11通过在PARP抑制剂治疗下延长S期阻滞而杀死细胞。我们的实验表明，ATR和PARP抑制剂的组合在SLFN11型-del单元格比SLFN11型-阳性细胞（图和表S1). 图提供了SLFN11在ATR激活上下文中的作用的示意图。为了应对PARP诱捕造成的复制性损伤，SLFN11型-阳性细胞使用双细胞周期调节：一种是SLFN11型-依赖性延长复制停滞导致细胞死亡，另一个是ATR-依赖性S期检查点，它减缓细胞周期并促进细胞存活。相比之下，SLFN11型在复制性损伤下，缺陷细胞主要依赖ATR激活进行细胞周期调控。这就产生了一种合成致命性场景[49,50]ATR抑制剂SLFN11型-PARP和ATR抑制剂联合使用时，缺陷细胞完全取消了细胞周期调控SLFN11型-缺乏细胞，但仅部分存在于亲本细胞中。因此，ATR-PARP抑制剂组合对SLFN11型-负数比inSLFN11型-阳性细胞。这一结论可能具有广泛的意义，因为45-50%的癌细胞株失活SLFN11型[23-25].
此外，我们的发现提供了尤因肉瘤（EWS）细胞对奥拉帕林显著敏感性之间的联系[51]和高SLFN11型EWS细胞中的表达[25]. 结合我们最近的发现，FLI1，一种转录因子，上调SLFN11型表达式[26]EWS细胞与PARP抑制剂超敏反应之间的联系可以从SLFN11型由诱导的表达EWS-飞行1EWS细胞中的易位。EWS细胞对PARP抑制剂超敏反应的另一个机制可能是，基于EWS-FLI1和PARP1之间的蛋白质相互作用，PARP1作为FLI1辅因子的重要性，以及EWS-FLI 1:PARP1在转录激活中的正反馈回路[52]. 因为尤因肉瘤最初对DNA损伤剂有反应，而细胞杀伤依赖于SLFN11[22,24,44]因此，确定复发患者肿瘤的SLFN11状态非常重要。
总之，我们的研究揭示了SLFN11与单独或与替莫唑胺联合用药的PARPI的相关性。开发用于评估SLFN11状态的分析方法，作为肿瘤对DNA损伤剂反应的预测标记，并澄清SLFN1生物学基础的分子细节，是未来的紧迫任务。
实验程序
细胞系、培养物和药物
DU145、CCRF-CEM、MOLT4和K562来自癌症治疗部（DCTD）、发育治疗计划（DTP、NCI），EW8和A673是Lee Helman博士（NCI/NIH）的礼物。所有细胞在含有10%FBS（Gibco BRL）的RPMI培养基中，37°C，5%CO中生长2有关SCLC线路的信息如表S2所示。ATR抑制剂VE-821、olaparib和veliparib均来自DCTD。塔拉佐帕利由BioMarin Pharmaceutical Inc.提供，替莫唑胺（T2577）和甲基磺酸甲酯MMS（129925）从Sigma-Aldrich购买。
细胞活力测定
细胞连续暴露于指示的药物浓度下72小时，一式三份。将5000个CCRF-CEM、MOLT4和K562细胞和1500个SF295、DU145、EW8、A673、MDA_MB231、H29和HCT116细胞接种在96个白色平板（#6005680 Perkin-Elmer Life Sciences）中，每孔100μl培养基中。使用ATPlite一步法试剂盒（PerkinElmer）测定细胞活力。未处理细胞中的ATP水平定义为100%。处理细胞的存活率定义为：（处理细胞中的ATP）/（未处理细胞的ATP）x 100。36个小细胞肺癌细胞系（取自美国类型培养物收集、欧洲细胞培养物收集或日本研究生物资源收集，表S2）在供应商建议的培养基中生长，并以基于细胞加倍时间的预定细胞密度接种在96孔板中。24小时后，将2000、400、80、16、3.2、0.64 nM的塔拉唑帕林分两次加入0.2%二甲基亚砜中，并再培养5或7天。通过CellTiter-Glo分析（Promega）测定细胞活力。集成电路50（抑制浓度50%）通过GraphPad Prism5计算处理后的细胞数相对于未处理对照组。
克隆测定
将处理过或未处理过的细胞置于六孔板上，并在含有或不含药物的培养基中连续培养10天，以允许菌落形成。然后固定菌落并用0.05%（wt/vol）亚甲基蓝（Sigma-Aldrich）染色。
免疫印迹法
为了制备全细胞裂解物，用CelLytic™M裂解试剂（C2978，Sigma-Aldrich）裂解细胞。在彻底混合并在4°C下孵育30分钟后，将裂解物在4°C下以15000 g离心10分钟，并收集上清液。为了制备染色质结合的亚细胞组分，我们遵循了Thermo Scientific（78840）亚细胞蛋白分馏试剂盒的方案[8]. 使用标准程序进行免疫印迹。
细胞周期和凋亡分析
细胞与10μM 5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）孵育1小时，然后用70%乙醇固定。通过流式细胞术检测BrdU（抗BrdU-FITC，BD Biosciences，347583，遵循制造商方案）。使用Annexin V/PI协同染色（FITC-Annexin V Apoptosis kit；BD Biosciences）在塔拉唑帕利治疗48小时后检测到凋亡细胞。用碘化丙锭（PI）测定DNA含量。细胞在FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）上进行分析。
免疫荧光显微镜
用新制备的4%（wt/vol）多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定细胞10分钟，然后在0.5%Triton-X100/PBS中渗透10分钟。然后用5%牛血清白蛋白/0.1%吐温20/PBS封闭样品1小时，并用一级抗体孵育2小时。用0.1%吐温20/PBS洗涤后，用Alexa Fluor 488和/或Alexa Fluor 568对细胞染色1小时。使用共焦显微镜（Nikon PCM2000）拍摄图像。使用ImageJ软件对γH2AX和RAD51的信号强度进行量化。设置比常规细胞核尺寸稍小的圆圈来量化每个图像中单个细胞核的信号。在整个测量过程中使用了相同大小的圆圈。两种信号（γH2AX和RAD51）的平均强度显示为散点图，以比较细胞系和条件。
的生成SLFN11型-删除的单元格
要删除SLFN11型基因，我们设计了两个独立的导向RNA（A和B），靶向4第个外显子使用CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu) [55]. 从Addgene购买人类密码优化的SpCas9和嵌合导向RNA表达质粒（pX330:pX330-U6-chimeric_BB-CBh-hSpCas9）。将每个引导RNA插入pX330质粒（pX330-A和pX330-B）。制备了含有同源臂和嘌呤霉素抗性基因的基因靶向结构。简单地说，利用PCR方法从基因组DNA中扩增了Cas9裂解位点上游和下游的~1 kb基因组序列。将上游位点（左同源臂）和下游位点（右同源臂）的PCR产物分别按所需方向亚克隆到TA克隆位点和ApaI/XhoI限制性内切酶位点的pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen）中。最终在NotI限制性内切酶位点的同源臂之间亚克隆了嘌呤霉素抗性基因。通过脂质体转染将靶向结构与pX330-A或pX330-B共同转染到DU145和EW8细胞中，通过电穿孔将其转染到CCRF-CEM和MOLT细胞中。转染后，将细胞释放到无药物培养基中48小时，然后选择嘌呤霉素，直到形成单个集落。单克隆扩增，Western blotting证实基因缺失。PCR引物和引导RNA序列将按要求提供。
的生成SLFN11型-表达细胞
SLFN11型用正向引物（5′-ATGGATCC GCGGCAACACATGGAGGCAAATCAGTGC-3′）和反向引物扩增cDNA，并将其克隆到pCDH-EF1-MCS-（PGK-copGFP）慢病毒表达载体（System Biosciences）In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech）。慢病毒SLFN11型-将表达载体和pPACKH1慢载体包装质粒共转染到293TN细胞（System Biosciences）中，并收集病毒颗粒以用Transdux™（System Biosciences）感染K562细胞。这个SLFN11型-用荧光激活细胞分选仪（FACS）对GFP信号的表达细胞进行分选。
抗体
从圣克鲁斯获得抗PARP1（sc-7150）、CHK1（sc-8408）、RAD51（sc-8394）和SLFN11（E-4）（sc-374339）的抗体；来自Abcam的磷酸化-CHK1（S345）（ab58567）和GAPDH（ab9485）；来自Upstate Biotechnology的γH2AX（05-636）和组蛋白H3（07-690）；以及来自Sigma-Aldrich的肌动蛋白（A3853）。次要抗体是针对小鼠或兔IgG的辣根过氧化物酶（HRP）结合抗体（英国GE Healthcare）。
siRNA转染和RT-PCR
人类BRCA2（L-003462-00-0005）、人类PARP1（L-006656-00-0005。根据制造商的说明，用Lipofectamin RNAiMAX试剂（13778，Invitrogen）将每种10纳摩尔的siRNA转染到DU145或EW8细胞中。转染后6-8小时更换培养基。转染两天后，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，然后使用PureLink RNA Mini Kit（Life Technology）和DNA酶处理（Qiagen）进一步纯化。使用SuperScript II逆转录酶试剂盒（Invitrogen）合成互补DNA（cDNA）。用正向引物5′-GAGGCCTATAAAGACCTTGAATTA-3′和反向引物5’-GATTGTGAACAAGTCAC-3′扩增人BRCA2 cDNA。
异种移植实验
雌性Balb/c裸鼠（6-8周龄）取自上海BK实验动物中心（中国上海），雌性NCr数值/数值小鼠购自Charles River Laboratories，Inc.（马里兰州弗雷德里克）。根据实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的规定，本研究中与动物处理、护理和治疗相关的所有程序均由上海化学伙伴动物护理与使用机构委员会（IACUC）或南方研究IACUC批准。在塔拉佐帕利和替莫唑胺联合实验中，在CB17雌性SCID小鼠（中国北京维塔尔河实验动物有限公司）的侧面皮下注射NCI-H209或NCI1092肿瘤细胞，在Balb/c雌性裸鼠的侧面皮下感染NCI-H841肿瘤细胞。当肿瘤达到~150mm时三平均体积，动物被随机分为治疗组(n个=每组6-8个）。NCI-H209和NCI-H1092肿瘤在第1-4天和第17-20天每天口服一次，或与相应的单一药物以相同的剂量和时间表联合使用，或与他拉唑帕林（0.25 mg/kg）、替莫唑胺（3 mg/kg）或与之联合使用；NCI-H841肿瘤在第1-5天通过口服灌胃的方式进行治疗，给药方式为：他唑帕林（0.165 mg/kg）每日两次，替莫唑胺（3 mg/kg）每天一次，或联合给药（他唑帕利0.165每日两次、替莫唑酰胺3 mg/kg每日一次）。
统计分析
使用皮尔逊相关系数对基因表达和药物细胞毒性进行关联，并认为与未修正的双尾第页< 0.05. 采用双尾独立样本t检验来确定两个实验组之间差异的统计显著性。使用GraphPad Prism版本5.0（GraphPad Software，http://www.graphpad.com网站).
组合效应分析
采用Chou-Talalay方法对组合效应进行了协同分析[56]. 使用CalcuSyn软件（英国剑桥Biosoft公司）计算每个联合治疗的联合指数（CI），CI:0.3-0.7，CI:0.1-0.3和CI:<0.1分别定义为协同作用、强协同作用和非常强协同作用[57].
