我们以前证明，胰腺癌细胞的代谢被重组，以促进生物合成，并在胰腺肿瘤营养不良的情况下维持氧化还原平衡2,14,15而细胞外蛋白可以为饥饿的癌细胞提供营养11,13我们假设基质可能为肿瘤提供额外的代谢支持途径。胰腺星状细胞（PSCs）是胰腺肿瘤基质中的主要细胞类型，是促结缔组织增生反应的重要介质。它们的丰富性表明它们可能有助于癌细胞的新陈代谢。为了验证这一观点，我们评估了用来自特征良好的人PSC（hPSC）系的条件培养基处理的PDAC细胞中耗氧率（OCR）和细胞外介质酸化率（ECAR）的变化，分别是线粒体活性和糖酵解的测量16(和). ECAR检测到，用PSC条件培养基处理细胞时，PDAC糖酵解显示出最小的变化(). 相比之下，我们观察到用hPSC培养基治疗后基础OCR持续增加20–40%(和)，在调节过程中独立于血清的特征()并且可以用多个原始样本进行复制(和). 值得注意的是，这种代谢表型是胰腺癌细胞特有的；未转化的胰腺导管上皮细胞对PSC培养基的反应没有表现出OCR增加().
胰腺星状细胞分泌的代谢物刺激胰腺癌代谢一与用PDAC CM（红线）或对照（含10%血清的DMEM，黑线）处理的细胞相比，来自hPSCs的条件培养基（CM）可增加PDAC OCR（绿线）。线粒体应激试验期间OCR变化的代表性痕迹。误差条描述了6个独立实验代表性追踪中6个独立井的s.d.（如b条).b条，与用标准培养基处理的8988T细胞相比，用不同细胞系的条件培养液处理的8988 T细胞的基础OCR变化百分比。误差条描述了集合独立实验的s.e.m(n个=3，用于主要hPSC#1，#2，主要mPSC；n个对于hPSC#2、IMR90和MiaPaCa2，=4；n个=6（对于8988T，hPSC#1）。c（c），在100°C下加热15分钟后，PSC调节介质的OCR活性保持不变。独立实验的误差条形图(n个=4).d日，在PSC条件培养基中显著升高的代谢物，在双重条件培养基（将PSC-条件培养基添加到8988T细胞中，然后收集）中降低的代谢品，以及在经PSC-调节培养基处理的PDAC细胞中细胞内升高的代谢物。误差线，s.d(n个=3).e（电子），NEAAs（1 mM丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸）混合物或丙氨酸单独增加PDAC OCR。将数据归一化为用标准培养基处理的细胞。独立实验的误差条(n个=4).（f），使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定条件培养基样品中丙氨酸的浓度。误差线，s.d(n个=3). 用单因素方差分析确定显著性b条,c（c）,e（电子）;t吨-在中测试d日,（f）.面板d日,（f）,n个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. 计算的对值和比较报告于补充信息.
为了确定改变PDAC代谢的PSC分泌因子的性质，我们对条件培养基进行了三次冻融循环（−80°C，60°C）或加热（100°C，15分钟），并观察到它保留了增加PDAC OCR的能力(和)，表明因子缺乏三级结构。此外，活性保留在通过3-kDa截止过滤器的介质中(). OCR增加因子的小尺寸和对极端温度的耐受性排除了蛋白质等大候选分子，表明该因子可能是代谢物。
接下来我们进行了一系列代谢组学研究17鉴定PSC分泌并被PDAC细胞吸收的代谢物(). 具体来说，我们寻找了在PSC培养基中过度表达的分子（因此由PSC分泌）；与PDAC细胞接触后在PSC培养基中出现低表达（用PDAC细胞去除）；在用PSC培养基处理的PDAC细胞内过度表达（被PDAC细胞吸收）。在分析的大约200种代谢物中，只有非必需氨基酸（NEAA）丙氨酸和天冬氨酸遵循这种模式(和). 用单个氨基酸处理PDAC细胞表明，只有丙氨酸能够将PDAC OCR增加到与PSC调节培养基相当的程度(和).
为了证明PSC衍生代谢物，特别是丙氨酸被PDAC细胞吸收，我们进行了代谢物追踪实验，其中PSC在含有均匀碳-13-标记（U13C-）葡萄糖和U13C-谷氨酰胺标记分泌的NEAA(). 然后将来自标记细胞的条件培养基添加到PDAC细胞中，使我们能够跟踪PSC产生和分泌丙氨酸，并跟踪与PDAC细胞接触时PSC培养基中丙氨酸的消耗情况(). 定量分析表明，PSC培养基中分泌的丙氨酸在条件作用24小时内达到毫摩尔浓度(和)而这与培养基中的血清无关(). 在肿瘤的背景下体内，需要评估的更重要参数是丙氨酸相对于其他营养素的释放和吸收。因此，我们进行了动力学研究，发现PSC分泌丙氨酸的速度在14种氨基酸中最高，甚至比乳酸分泌速度更快(). 丙氨酸也是PDAC细胞中积累的仅有的两种氨基酸之一，其富集程度超过五倍().
接下来我们研究了PDAC细胞如何代谢PSC衍生丙氨酸。丙氨酸可以通过促进TCA循环来增加OCR，一种可能的途径是通过丙氨酸转氨为丙酮酸(). 细胞溶质或线粒体丙氨酸转氨酶持续耗竭(通用条款1或GPT2项目分别）在PDAC细胞中()导致丙氨酸积累增加()PSC培养基处理的PDAC细胞OCR降低(和). 此外，直接向PDAC细胞中添加丙酮酸可增加OCR(). 然后我们表演了U-13C-Ala追踪研究评估丙氨酸如何用于PDAC代谢。用1 mM U处理细胞-13C-Ala导致细胞内丙氨酸库增加5-10倍(). 丙氨酸中的碳对上游糖酵解中间产物没有贡献()或改变糖酵解通量()或NAD+/NADH比率()对细胞内乳酸池的贡献最小()，与细胞外葡萄糖浓度无关(). 这些结果表明，丙氨酸衍生的丙酮酸被用于线粒体，因为它不影响胞浆糖酵解代谢。事实上，丙氨酸是TCA循环的主要碳源；13C明显并入柠檬酸盐和异柠檬酸盐中，苹果酸盐和富马酸盐在较小程度上并入(和,)以及天冬氨酸和谷氨酸的NEAA(–)，可以从PDAC细胞中的TCA循环中间体生物合成14事实上，柠檬酸盐是丙氨酸碳的主要受体之一，在PDAC株系中标记率从23%到46%不等(和,).
丙氨酸由星状细胞分泌，并被PDAC用于促进生物合成反应一，丙氨酸转氨酶（GPT1/2）在中枢碳代谢中的作用。葡萄糖（Glc）、丙酮酸（Pyr）、乳酸（Lac）、Ac-CoA、柠檬酸（Cit）和α-酮戊二酸（αKG）。b条，的击倒通用条款1或GPT2项目经PSC条件培养基处理后，PDAC细胞内的丙氨酸进一步增加。误差线表示s.d(n个= 3). 将数据归一化为每个shRNA用标准培养基处理的细胞。c（c），击倒通用条款1或GPT2项目在PDAC细胞中，PSC条件培养基增加OCR的能力显著减弱。数据标准化为用标准培养基处理的细胞。误差条描述了独立实验的s.e.m(n个=3).d日丙氨酸处理PDAC细胞以剂量依赖的方式增加OCR，并可被丙酮酸重复。数据标准化为用标准培养基处理的细胞。误差条描述了代表性实验（共3个实验）中4个独立井的标准差。e（电子）经U处理的PDAC细胞代谢物的丙氨酸衍生碳标记模式-13C-Ala显示，在TCA循环代谢物柠檬酸盐、异柠檬酸盐（Iso）、苹果酸（Mal）和富马酸（Fum）中有大量标记掺入。误差条描述了s.d(n个=3).（f），U-13PDAC细胞系中柠檬酸的C-丙氨酸标记表示为柠檬酸与标记碳的分数。误差线表示s.d(n个=3).克,小时，U-13C-Ala标记的PDAC细胞显示丙氨酸大量掺入从头开始棕榈酸脂肪酸的生物合成(克)和硬脂酸盐(小时). 数据表示为包含丙氨酸衍生标签的所有同位素的总和。误差条描述了s.d(n个= 4). 用单因素方差分析确定显著性b–d段.面板b条,（f）,n个=3; 面板克,小时,n个=4个技术复制品，来自单个井的独立制备样品*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. 计算的对值和比较报告于补充信息.
我们还观察到丙氨酸衍生的丙酮酸与基于柠檬酸盐（M2，其中M表示代谢物，2表示代谢产物的数量）的线粒体而非细胞溶质葡萄糖衍生的丙氨酸有意义地竞争13存在C原子）和乳酸（M3）标记模式-13C-Ala或U-13C-葡萄糖示踪研究(,,,). 这些结果表明丙氨酸碳被选择性地用于促进线粒体代谢，这与我们早期的观察结果一致，即丙氨酸的添加不会破坏糖酵解(). 线粒体丙酮酸在增殖细胞中的主要功能是通过转化为乙酰辅酶A（Ac-CoA）促进柠檬酸盐的生成。然后将柠檬酸盐（用两个Ac-CoA碳标记，M2）释放到胞浆中，并用作脂肪酸生物合成的构建块。如所示含有丙氨酸衍生物的棕榈酸总酯和硬脂酸总酯分别占20%和10%以上13C、 与葡萄糖的贡献相当（分别约为50%和20%；)并说明丙氨酸在脂质生物合成中的重要性。从丙氨酸生产柠檬酸用于脂肪酸生物合成需要额外的TCA循环输入来支持回补。事实上，我们观察到丙氨酸也可以通过丙酮酸羧化酶发挥这一作用，正如来自U的柠檬酸盐和其他TCA循环中间体的M3标记所证明的那样-13C–阿拉(,).
我们还发现，丙氨酸的添加增加了PDAC细胞中丝氨酸生物合成途径的通量(). 该途径利用葡萄糖生成NEAAs丝氨酸和甘氨酸，除其他过程外，NEAAs用于从头开始核酸的生物合成。U型-13C-葡萄糖示踪研究证实丙氨酸通过该途径促进葡萄糖衍生碳的流量()这种作用在葡萄糖限制条件下更为明显，类似于灌注不良的胰腺肿瘤(). 总的来说，这些结果表明丙氨酸衍生碳可以在TCA循环代谢中取代葡萄糖衍生碳（生成脂质和NEAA），从而使葡萄糖用于其他生物合成功能，如丝氨酸生物合成途径。在外源丙氨酸存在的情况下，谷氨酰胺代谢也发生了改变，更多的丙氨酸取代谷氨酰胺碳被纳入TCA循环()，但在大多数PDAC品系中，相对于葡萄糖衍生的碳，这种情况发生的程度要低得多。
PSC分泌丙氨酸的一个可能来源是蛋白质分解代谢。鉴于自噬在PDAC中的关键作用18,19，我们测试了丙氨酸的分泌是否依赖于自噬。培养中的PSC表现出易于检测的基础自噬水平，如LC3点所示（代表自噬体；)并表现出明显的自噬通量(和). 值得注意的是，与PDAC细胞共培养()或用PDAC条件培养基处理(和)PSC自噬流量显著增加。为了评估自噬在丙氨酸分泌中的重要性，我们使用针对基本自噬基因的短发夹（sh）RNA来抑制PSC的自噬自动液位计5和自动液位计7()并测量了PSC调节介质提高PDAC OCR的能力。PSC培养基提高PDAC细胞OCR的能力在自噬基因敲除后消失(和)并且可以通过添加外源丙氨酸来挽救(). 我们一致地观察到，当hPSCs自噬受损时，细胞内丙氨酸和分泌的丙氨酸水平均下降(和). 此外，经自噬受损的PSC条件培养基处理后，PDAC细胞内丙氨酸的积累也减少了(). 与PDAC细胞相反，PDAC细胞对自噬抑制反应强烈18,19，PSC增殖对自噬损伤基本不敏感(). 即使在缺乏营养的条件下，自噬受损时PSC的存活率也没有改变()表明PSC存活率的改变不是丙氨酸分泌减少的原因。总之，这些数据为双向瘤内代谢串扰提供了证据，在这种串扰中，癌细胞向PSC释放信号，导致自噬诱导和丙氨酸释放。
丙氨酸分泌依赖于星状细胞自噬一，使用LC3串联荧光（GFP–RFP）报告器的PSC基础自噬通量的代表性图像。PDAC细胞没有荧光标记，并且用星号表示。b条与多个PDAC株共培养后，PSC中的自噬增加，表现为自溶体增加。误差条，s.e.m.ofn个仅hPSC为32；n个8988T共培养=38；n个Tu8902共培养=41；n个MiaPaCa2共培养=24，来自3个独立实验。c（c），PDAC系条件培养基处理的星状细胞自噬流量的定量。误差条，s.e.m.ofn个=65 hPSC调节介质；n个=50 8988T条件培养基；n个=61 Tu8902条件培养基；n个=62 MiaPaca2-条件培养基，每种条件下，独立hPSC细胞中的培养基来自3个独立实验。d日，通过抑制PSC自噬自动液位计5或自动液位计7敲除减弱PSC条件培养基提高8988T PDAC细胞OCR的能力。数据标准化为用标准培养基处理的细胞。误差条显示了集合实验的标准误差(n个=ATG7#1、#2为6；n个=5（对于shGFP，8988T条件培养基）；n个=ATG5#1、#2）。e（电子）PSC条件培养基中含有升高的丙氨酸，当自噬被抑制时，丙氨酸显著降低。（f），经PSC条件培养液处理的PDAC细胞显示胞内丙氨酸升高，当PSC自噬被抑制时，这种升高被显著抑制。的误差条e（电子）,（f），显示的s.dn个=3个技术复制品，来自独立制备的单井样品。用双向方差分析确定显著性b条,c（c）; 单向方差分析d–f日. *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. 计算的对值和比较报告在补充信息.
接下来，我们试图确定这些PSC诱导的PDAC代谢改变是否会对PDAC增殖产生影响。毫不奇怪，在高营养培养基（25 mM葡萄糖，4 mM Gln，全血清）中，PSC培养基对PDAC增殖的影响并不显著(). 相比之下，当生长在低营养环境（无血清或限制葡萄糖的条件）中时，重现了严峻的微环境体内PSC培养基对PDAC增殖有显著的正向作用(和). 值得注意的是，自噬受损细胞的PSC培养基没有产生这种促生长作用(和). 用丙氨酸补充无血清或低血糖培养基也能以类似于PSC培养基的方式挽救生长(和)在营养丰富的环境中效果最小(). 此外，丙氨酸能够从自噬受损的细胞中恢复PSC培养基的促生长能力(). 与所提出的机制一致，丙酮酸（丙氨酸转氨作用的产物）而非乳酸能够在葡萄糖限制的培养基中维持PDAC增殖(). 同样，通用条款1在无血清条件下生长的PDAC细胞中的敲除显著减弱了PSC培养基或丙氨酸对增殖的影响().
星形细胞代谢物的分泌支持PDAC在营养限制条件下的生长，并促进肿瘤生长一PSC条件培养基可促进无血清培养基中生长的8988T细胞的增殖，这一特征与外源性丙氨酸补充有关。相比之下，PSC中抑制自噬的条件培养基不能支持PDAC生长。添加10%的血清作为阳性对照。误差线，s.e.m(n个=7）独立实验。b条,c（c），注射后35天分析，8988T PDAC细胞与PSC共注射可显著促进早期肿瘤生长(b条)，并降低无瘤生存率(c（c）)在异种移植模型中。当PSCs中的自噬受到抑制时，这种作用会显著减弱。误差线，s.e.m(n个=10）每个时间点每种情况的肿瘤数，PSC–shGFP对照除外，其中(n个=5）注射动物。d日,e（电子）在注射后7天，将诱导型KRAS小鼠PDAC细胞与mPSCs共同注射到同基因小鼠胰腺中，可显著促进早期肿瘤生长(d日)降低无瘤生存率(e（电子）)在原位同种异体移植物模型中，当PSC中自噬被抑制时，这种效应显著减弱。误差线，s.e.m(n个=10）每个条件每个时间点的肿瘤，mPSC–shGFP对照除外，其中(n个=5）注射动物。（f），肿瘤模型-基质代谢串扰。用单因素方差分析确定显著性一,b条,d日; log-rank Mantel–考克斯测试c（c）,e（电子）. *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. 计算的对值和比较报告于补充信息.
为了确定这种交叉喂料机制是否有效体内，我们开发了一种联合注射系统，在该系统中，PSC可以通过基因操作，然后与癌细胞一起植入小鼠的两侧。尽管先前的研究表明，PSC与PDAC细胞联合注射可促进肿瘤生长16，代谢串扰对此效应的贡献尚未探讨。事实上，PSC丙氨酸分泌需要自噬，而自噬对增殖的影响最小，对生存无影响()，允许选择性衰减这种代谢串扰，以便评估其在肿瘤生长中的作用。因此，我们对有限数量的PDAC细胞以及具有自噬能力或不具备自噬功能的PSC进行了联合注射研究(). 与在体外当联合注射自噬活性PSC时，增殖数据、肿瘤摄取和肿瘤生长动力学均显著增加，而当PDAC细胞与自噬不活性PSC联合注射时，这种增加显著减弱(和). 值得注意的是，在这些分析中，PSC生长支持的主要作用似乎是在肿瘤开始或肿瘤服用期间(和); 在以后的时间点，自噬功能不全的PSC相关肿瘤与自噬能力相似(). 事实上，即使是野生型PSC，癌细胞最终也会形成大多数移植瘤(). 通过western blot对星状细胞进行RFP定量（外源性PSCs用RFP标记）表明，虽然RFP的表达水平因单个肿瘤而异，但根据自噬状态，各组之间没有显著差异().
与皮下模型的结果一致，原位检测中PSC自噬减少减缓肿瘤生长并增加无瘤生存率(). 原位肿瘤中PSCs的含量高于皮下肿瘤，但PSCs含量也低于肿瘤细胞(). 为了进一步验证体内为了证实这种机制的相关性，我们使用了一个由癌细胞和来源于我们的小鼠PDAC自体模型的PSC组成的同基因系统15与我们使用人类PDAC和PSC系的研究结果一致，小鼠PSC以自噬依赖的方式改善了肿瘤植入(和).
我们的工作证明了基质PSCs和上皮癌细胞之间促进生长的代谢串扰(). 先前的研究表明，肿瘤中不同细胞群之间可能会发生肿瘤内代谢串扰20,21例如，在结直肠癌和肺癌模型中，缺氧癌细胞优先消耗葡萄糖，并向氧合良好的癌细胞提供乳酸以进行氧化代谢21最近，其他人认为基质细胞可以改变胰腺癌细胞的代谢22作为非选择性代谢物递送的载体，外泌体可能会发生这种情况20虽然最近在小鼠模型中使用胰腺癌进展过程中的成像研究报告了乳酸盐和丙氨酸的变化，但这些研究没有空间分辨率来区分肿瘤内的不同细胞类型，并且无法检测癌细胞和成纤维细胞之间的代谢串扰23我们的工作，使用胰腺癌模型系统和体内联合移植试验证明了PSC衍生丙氨酸的特殊作用，其碳与葡萄糖衍生碳竞争，作为代谢底物效应，而非与外源乳酸重复。
通过自噬分解的蛋白质是PSC分泌丙氨酸的来源。鉴于丙氨酸是蛋白质中第二大代表性氨基酸，分解代谢可以提供游离丙氨酸的重要来源24我们发现PDAC细胞刺激PSC中的自噬，并选择性地消耗释放的丙氨酸，在转化为丙酮酸后的TCA循环中使用这种碳。值得注意的是，丙氨酸衍生丙酮酸与细胞溶质丙酮酸不平衡。因此，它提供了直接的线粒体碳源，而不改变胞浆NAD+/NADH氧化还原平衡。这导致线粒体耗氧量增加以及脂质生物合成。重要的是，丙氨酸的代谢使葡萄糖等传统碳源更适用于其他生物合成过程，如丝氨酸和甘氨酸的合成，这是核酸生物合成的前体。这种协同代谢促进肿瘤生长，在营养有限的条件下尤为重要。
根据这一机制，我们可以预测，在胰腺癌细胞能够直接通过血管系统获得营养的情况下，PSC介导的丙氨酸分泌将不太相关，例如在PSC切除的胰腺肿瘤中8,9相反，如果PSC特征发生改变（例如抑制自噬）而不进行消融，则可以持续、通过PSC介导抑制肿瘤生长，同时可能使肿瘤对治疗过敏。最近的一个例子表明，PDAC与维生素D的基质重编程使其对化疗敏感25.
总的来说，这些发现很重要，原因如下。首先，他们揭示了肿瘤与基质相互作用的复杂生物学。此外，他们强调了在适当的背景下研究高促结缔组织增生性肿瘤（如PDAC）代谢的重要性，在本例中，存在相关的支持细胞类型。最后，癌细胞和PSCs之间依赖于自噬的这种协同代谢进一步证实了代谢清除在PDAC中的关键作用，并表明抑制自噬和其他溶酶体降解途径在该疾病中可能比以前认识到的更具治疗效用。
方法
细胞培养
细胞系8988T、MiaPaCa2、Tu8902、Panc1、MPanc96和IMR90来自ATCC或DSMZ。hPSC（hPSC#1）已在前面进行了描述16hPSC#2是从未经治疗的人类PDAC切除中分离出来的，根据IRB批准的方案03-189和11-104被认为是未经鉴定的“手术废物”组织。患者在知情的情况下同意采集组织。通过差异胰蛋白酶化分离出培养中超出癌细胞的基质细胞，并通过感染hTERT和SV40gp6（Addgene质粒#22396和#10891）逆转录病毒使其永生化。这些细胞保存在补充了10%FBS和1%Pen/Strep（生命技术15140）的DMEM（生命技术11965）中。根据IRB批准的方案STU 102010-051，以与上述类似的方式从肿瘤切除中分离出人胰腺癌相关的原代成纤维细胞，但未永生。细胞保存在补充了10%CCS（Thermo Scientific）和1%Pen/Strep的DMEM中。通过测量Desmin和SMA的表达来验证PSC。HPDE之前已经过描述，并按照指示生长26所有细胞均通过PCR进行支原体常规检测，PDAC细胞系通常通过指纹图谱和目视检查进行鉴定，并小心保存在中央细胞库中。从正常小鼠胰腺中分离出mPSC，并使用Nycodenz梯度离心纯化，通过在体外文化，如所述25.
黑色6（B6）mPSC是由B6雌性（Taconic，B6NTac）携带小鼠PDAC产生的。这些动物预先接受强力霉素饮食治疗，在实验期间保持强力霉素方案，并注射5×105iKRAS mPDAC细胞15进入胰腺。在2周时切除胰腺肿瘤，用胶原酶和脱氨酶消化并机械粉碎。在不存在多西环素的情况下，将细胞接种在含有15%FBS的DMEM（Gibco）中的细胞培养皿中，以限制iKRAS小鼠PDAC细胞的生长。mPSC通过hTERT和SV40gp6（Adgene质粒分别为#22396和#10891）逆转录病毒感染而永生。细胞保存在含有10%FBS和1%Pen/strep的DMEM（Gibco）中。
mCherry-hPSCs是通过感染表达mCherry的慢病毒而标记为mCherri的hPSC#1。
将新鲜培养基添加到50%以上的细胞中，生成条件培养基。48小时后收集培养基，并通过0.45-μm过滤器。对于尺寸截止实验，条件培养基通过3-kDa截止柱过滤（EMD Millipore，UFC900308）。将浓缩（>3kDa）培养基重新悬浮在与初始培养基体积匹配的DMEM体积中。通过在100°C下加热处理过的介质15分钟，然后在0.45μm下过滤以去除沉淀物，进行沸腾介质实验。将冻融培养基在−80°C下连续处理3次，每次15分钟，然后在60°C下处理15分钟，随后过滤以去除沉淀物。
用pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B（Addgene质粒#22418）逆转录病毒感染hPSCs产生串联荧光LC3-报告子稳定的hPSC细胞。对于自噬通量定量实验，7.5×104hPSC-LC3细胞被镀在带有盖玻片和3×10的12孔板中54小时后加入PDAC或hPSC细胞。在电池接触24小时后，将盖玻片固定在4%多聚甲醛中（ThermoFisher，28908）。盖玻片安装在含有DAPI的安装溶液中（Life Technologies{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P36931”，“term_id”：“2506707”，“term_text”：“P26931”}}第36931页). 细胞在横河旋转盘上以FITC、RFP和DAPI通道共聚焦成像。红点与黄点的比率是通过使用细胞计数器imageJ插件计数点来确定的。
对玻璃盖玻片上的细胞进行油红O染色，并在4%多聚甲醛（Thermo-Fisher，28908）中电镀24小时后固定15分钟。用PBS冲洗细胞，然后用60%异丙醇冲洗，并用新制备的油红O工作液染色，该工作液由3 ml 0.5%溶液（Sigma，O1391）和2 ml h组成2O静置15分钟，用60%异丙醇冲洗，并用己二醛复染。然后在H中清洗盖玻片2O、 安装在Vectashield上，使用徕卡DM2000明亮视野显微镜成像。
生长测定
生长曲线如前所述19。使用条件培养基或代谢物处理48小时后，CellTiter-Glo（Promega G7572）分析评估了透明底部96-well板（Costar 3603，Corning Incorporated）中超过48小时的细胞生长，并通过每个条件下至少三个孔的平均值进行测定。在北极星欧米茄平板阅读器上测量了发光度。
代谢实验
使用Seahorse Bioscience的XF-96仪器进行OCR和ECAR实验。在实验前一天，针对每种情况，至少四次对细胞进行电镀（8988T每孔16000个细胞；Tu8902或Panc-1每孔20000个细胞；HPDE每孔50000个细胞）。第二天，将培养基完全替换为条件培养基（75μl条件培养基和25μl新鲜培养基）或含有1 mM l-丙氨酸（Sigma A7469）、1 mM NEAAs（Gibco 11140）、1 m M甘氨酸（Sigga G8790）、1 mM M天冬氨酸（SigmaA4534）或1 mM半胱氨酸（SignaA9165）的新鲜培养基。20小时后，将培养基替换为含有25 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺（无碳酸氢钠）的重组DMEM，调节pH至7.4，并在37%的CO中培养30分钟2-免费培养箱。对于线粒体应激试验（Seahorse 101706-100），分别注射寡霉素、FCCP和鱼藤酮至最终浓度2μM、0.5μM和4μM。对于糖酵解应激试验（Seahorse 102194-100），分别将葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖注射至最终浓度为10 mM、2μM和100 mM。OCR和ECAR归一化为实验结束时CellTiter-Glo分析确定的细胞数。
代谢组学
如前所述，进行了稳态代谢组学实验14简单地说，PDAC细胞系在生长培养基（DMEM，2 mM谷氨酰胺，10 mM葡萄糖，10%CCS）中生长至约80%的融合处，在6 cm培养皿上进行生物三次培养。在代谢物收集前两小时进行完全的培养基更换。为了追踪丙氨酸对谷氨酰胺和葡萄糖代谢的影响，如上所述生长PDAC细胞系，然后转移到含有10%透析FBS的无谷氨酰胺（含10 mM葡萄糖）或无葡萄糖（含2 mM谷氨酰胺）DMEM中，并补充2 mM U-13C-谷氨酰胺（±1 mM丙氨酸）或10 mM U-13C-葡萄糖（±1 mM丙氨酸）隔夜。为了追踪丙氨酸代谢，如上所述培养PDAC细胞系，然后将其转入DMEM（含10 mM葡萄糖、2 mM谷氨酰胺、10%透析FBS）并补充1 mM U-13丙氨酸过夜。此外，在提取代谢物进行稳态分析前2 h，交换含有标记代谢物的新鲜培养基。为了在低血糖条件下跟踪葡萄糖代谢，细胞在0.5 mM葡萄糖中生长，在24 h标记期内每8 h刷新一次培养基，以实现稳态标记。对于所有代谢组学实验，将分析的代谢物部分的数量调整为在6-cm培养皿中处理平行孔后计算的相应蛋白质浓度。
为了收集标记的条件培养基，hPSC或8988T细胞在含有10 mM U的DMEM中培养三代-13C-葡萄糖，2 mM U-13C-Gln和10%透析FBS。然后用DMEM替换该培养基，用未标记的葡萄糖、谷氨酰胺和10%透析的FBS，培养48小时，过滤并处理以提取代谢物。通过向800μl冷（−80°C）甲醇中添加200μl经过滤的新鲜调理培养基，在−80℃培养30分钟，然后在10000℃离心，进行培养基的代谢物提取克在4°C下保持10分钟。将所得上清液用speedvac冻干，并在−80°C下保存，直至分析。将干燥的代谢物颗粒重新悬浮在20μl LC-MS级水中，将5μl注入Prominence UFLC中，并使用4.6 mm i.d.×100 mm Amide XBridge HILIC柱以360μl/min的速度分离，从85%缓冲液B（100%ACN）到0%B，持续16分钟。缓冲液a:20 mm NH4OH/20 mM信道三库恩4（pH=9.0）在95:5水/ACN中。使用5500 QTRAP混合三重四极杆质谱仪，通过靶向LC-MS/MS的正负极性切换捕获287个选定的反应监测（SRM）跃迁。
对于hPSCs的代谢物分泌动力学，将在正常条件下培养的三份亚流出物hPSC样品更改为含有10%透析FBS的新鲜DMEM，允许其调节2、4、8、24、48或72小时。使用含有10%透析的FBS的鲜DMEM作为空白对照。然后通过添加冰凉的100%MeOH至最终浓度80%MeOH，从条件培养基中提取代谢物。
对于PDAC代谢物摄取动力学，在培养48小时后收集含有10%透析过的来自亚流出物hPSC的FBS的条件DMEM，然后通过0.45μm过滤器过滤。将8988T PDAC细胞一式三份接种，并用PSC条件培养基或含有10%透析FBS的新鲜DMEM处理1、2、4、8或24小时。取出培养基，用冰冷的80%MeOH收获细胞裂解物。通过离心清除可溶性代谢物组分，在氮气下干燥，然后在50:50 MeOH:H中重新悬浮2LC-MS分析用O混合物。
动力学分析采用岛津Nexera X2超高效液相色谱与Sciex 5600 Triple TOFMS相结合，由Sciex Analyst 1.7.1仪器采集软件控制。使用Supelco Ascentis Express HILIC（7.5 cm×3mm，2.7μm）柱，流动相（A）由5 mM NH组成4OAc和0.1%甲酸；流动相（B），由98%CAN，2%5 mM NH组成4OAc和0.1%甲酸。梯度程序：流动相（A）在10%下保持0.5分钟，然后在3分钟内增加到50%；然后在4.1分钟内达到99%，并在返回初始条件之前保持1.4分钟。将色谱柱保持在40°C，并以0.4 ml/min的流速将5μl样品注入LC-MS。
TOFMS的校准通过参考APCI源实现，平均质量精度小于5 ppm，丙氨酸除外，丙氨酸为20 ppm。MS的关键参数是正产物离子捕获的25 eV和10 eV的碰撞能量和扩散，负产物离子捕获为−35 eV和15 eV。在MS方法上设置了100个MRM转换。数据处理软件包括Sciex PeakView 2.2、MasterView 1.1、LibraryView（64位）和MultiQuant 3.0.2。
为了分析棕榈酸盐和硬脂酸盐，对数生长的PDAC细胞在生物四硅酸盐中用5.5mM U标记-13C-葡萄糖或1 mM U-13DMEM中含有2 mM谷氨酰胺和10%透析FBS的C-Ala，持续3天。在相关情况下，以同等浓度使用未标记的物种。每天刷新标记培养基。72 h时，刷新培养基2 h，并在ddH中通过快速冲洗收集样品2O之后，液氮直接在细胞上淬火。然后在提取之前，将板储存在−80°C的温度下。如前所述，使用甲醇/水/氯仿提取极性代谢物和脂肪酸27将样品置于冰上，并将10μl 1.2 mM D27肉豆蔻酸作为内标物引入每个细胞板。向每个样品中添加400μl冷水和400μl甲醇。将细胞收集在离心管中，并向每个管中添加400μl冰镇氯仿。提取物在4°C下涡流30分钟，在14000×G下离心20分钟。回收较低（有机）相，并在60°C下用50μl甲基-8试剂（Thermo）在50μl中重新组合前对样品进行氮干燥，以生成脂肪酸甲酯（FAME）。
使用配备30 m DB-5MS+DG毛细管柱和Leap CTC PAL ALS作为样品注射器的Agilent 7890A GC进行GC-MS分析。GC与Agilent 5975C四极质谱仪相连，该质谱仪在70 eV正电子碰撞电离下运行。使用ChemStation E.02.01、PAL Loader 1.1.1、Agilent PAL Control Software Rev A和PAL Object Manager更新固件进行调谐和数据采集。MS调谐参数进行了优化，使PFTBA调谐离子丰度比69:219:512为100:114:12，增加了高离子丰度。使用Agilent Fiehn保留时间锁定（RLT）GC方法，并用标准FAME（Agilent）进行校准，并用Agilent G1677AA-Fiehn GC/MS代谢组学RTL库进行确认。为了测量FAME，GC注射口设置为250°C，GC烘箱温度保持在60°C 1分钟，并以10°C/min的速度增加到320°C，然后在恒定流量下保持10分钟，初始压力为10.91 psi。MS源和四极分别保持在230°C和159°C，探测器以扫描模式运行，记录35–600范围内的离子丰度米/z（z）使用Agilent MassHunter工作站软件GCMS定量分析版本B.07进行数据提取。使用MATLab的内部软件工具进行额外的同位素校正28.
全部13C同位素试剂购自剑桥同位素实验室。
定量聚合酶链反应
根据制造商的说明，使用TRIzol（Invitrogen）提取总RNA，并使用寡核苷酸-dT和MMLV HP逆转录酶（Epicenter）从2μg总RNA中进行逆转录。使用Mx3000PTM仪器（Stratagene）对SYBR绿色染料进行定量RT-PCR。以18S核糖体或肌动蛋白RNA序列为对照，采用比较CT法计算cDNA的相对量。
抗体
将LC3B（Novus Biologicals NB100-2220）用于1:200稀释度的IF。以1:200的比例使用二级抗兔GFP抗体（Invitrogen A21206）。对于western blot，使用ATG5（Novus Biologicals NB110-53818）、ATG7（Sigma A2856）、β-肌动蛋白（SigmaA5441）、LC3B（Novus Biologicales NB600-1384）、RFP（Rockland 600-401-379）和二级HRP结合抗兔（Thermo-Fisher，31460）和抗鼠（Thermi-Fisher 31430）抗体，如前所述14对于IHC分析，在1:500时使用αSMA（Dako M0851），然后使用抗鼠–HRP二级抗体（载体实验室PK6101）。
慢病毒mRNA靶点
shRNA载体从Dana Farber癌症研究所的RNA干扰筛选设施获得。每个shRNA的序列和/或RNAi联盟克隆ID如下：shGFP:GCAAGCTGACCCTGAGTTCAT（Addgene质粒#30323）；shATG5#1:TRCN0000150645（序列：GATTCATGGAATTGAGCAAT）；shATG5#2:TRCN0000150940（序列：GCAGAACCATACTATTGCTT）；shATG7#1:TRCN0000007584（序列：GCCTGCTGAGGAGCTCTCCAT）；shATG7#2:TRCN0000007587（序列：CCCAGCTATTGGAACACTGTA）；shGPT1#1:TRCN0000034979（序列：GCAGTTCCACTCATTCAAGAA）；shGPT1#2:TRCN0000034983（序列：CTCATTCAAGAAGGTGCTCAT）；shGPT2#1:TRCN0000035024（序列：CGGCATTTCTACGATCCTGAA）；shGPT2#2:TRCN0000035025（序列：CCATCAAAATGGCTCACAGACAT）。小鼠shATG5:TRCN0000099430（序列：GCCAAGTATCTGTCTGTATA）；小鼠shATG7 TRCN0000092163（序列：CCAGCTTCTGAACTCAATA）。
化学制品
U型-13C-标记葡萄糖（剑桥同位素实验室CLM-1396-10），U-13C标记的L-谷氨酰胺（剑桥同位素实验室CLM-1822-H-0.1），U-13C标记的L-丙氨酸（剑桥同位素实验室CLM-2184-H-0.1）。NEAAs（Gibco 11140）、D-葡萄糖（Sigma G7528）、L-谷氨酰胺（Sigma-G3126）、L-丙氨酸（SigmaA7469）、甘氨酸（Signa G8790）、L-丝氨酸（Sigram S4311）、丙酮酸钠（Sigman P5280）、L-乳酸钠（Sigrama L7022）、氯喹（Waterstone technology 32152）。
引物序列
qPCR引物的序列如下：αSMA_Fw，GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT，αSMA_Rv:GCTGGGACATTGAAAGTCTCA，Desmin_Fw:TCGGCTCTAAGCTCCTC，Desmin_Rv:CGTGCAGAAA-CTCTGTTT，GPT1_Fw:GTGCGGAGAGTAGTACG，GPT1_Rv:GATGACTCGGTGAAGCTT，GPT2_Fw:CATGGACATTGAACC，GPT2_Rv:TTACGCGACCTCTT。
套件
线粒体应激试验（Seahorse 101706-100）和糖酵解应激试验（Seahorse 102194-100）试剂盒购自SeahorseBioscience。纳德+/NADH试剂盒从Biovision（Biovison K337-100）购买，并按照制造商的说明使用。
统计分析
使用GraphPad PRISM软件进行统计分析。没有使用统计方法预先确定样本量。
当比较具有多个变化变量的多个组时（例如，用不同shRNAs和不同条件培养基处理细胞的实验），进行双向方差分析测试。对于我们分析多个条件下一个变量的实验，进行了单向方差分析。在这两种情况下，Tukey的方差分析事后测试允许多组比较。使用log-rank（Mantel–Cox）检验进行生存曲线统计分析。将两组学生进行比较时t吨-进行测试（未配对，双尾）。
当对< 0.05. 相关计算值对值报告于补充信息，其中还可以找到每个实验的详细统计信息。
超声肿瘤监测
如前所述，使用高分辨率超声（Vevo 770）识别肿瘤并测量其尺寸和体积29简单地说，用3%的异氟醚麻醉小鼠，用细剪和脱毛膏去除腹部毛发。通过腹膜内注射给药预热无菌生理盐水（100-200μl）。在腹部涂抹超声凝胶，并使用超声换能器识别腹部标志性器官（肝脏/脾脏），然后是胰腺和肿瘤。一旦确定，传感器被转移到3D运动阶段，并进行3D扫描以测量肿瘤的尺寸和体积。肿瘤体积轮廓如所述29.
台盼蓝排除试验
为了测定细胞在饥饿条件下的存活率，将细胞以50%的汇合度放置在完整的培养基中。细胞附着后，用无血清DMEM代替培养基。48小时后，将细胞胰酶化，重新悬浮在自己的培养基中，用台盼蓝（Thermo-scientific 15250061）稀释，并使用血细胞仪进行计数。通过台盼蓝掺入法测定死亡细胞的百分比。
异种移植物
如前所述进行异种移植研究14简单地说，2×105将8988T或MiaPaCa2细胞单独或联合注射到6周龄裸鼠（Taconic ncrnu-f）的侧翼，1×106根据方案10-055，hPSC先前感染了shGFP、shATG5或shATG7 shRNAs。肉眼和双向触诊监测肿瘤摄取情况。根据肿瘤长度和高度的卡尺测量值，使用肿瘤体积=（长度×宽度）的公式计算肿瘤直径和体积2)/2. 当最大肿瘤直径超过2 mm时，动物被认为患有肿瘤。
对于同基因原位注射，12周龄的黑6雌性小鼠（Taconic B6NTac）在胰腺内注射1×10的多西环素，在实验期间预先用多西环素来调节饮食并保持多西环碱方案5从纯黑色PDAC GEMM（KrasG12D，P53 L/+）分离的iKRAS mPDAC细胞15单独或联合注射5×105先前感染shGFP、shATG5或shATG7 shRNAs的mPSC（或mPSC–shGFP单独用作阴性对照）。简单地说，在脾脏上方的侧面做了一个切口。确定脾脏，并通过切口轻轻拉出，露出胰腺。使用Hamilton注射器将含有20%Matrigel（BD-Biosciences 354234）的10μl细胞悬浮液注入胰腺尾部，该注射器保持在原位30 s，以允许Matrigel聚合。将脾脏和胰腺小心地重新导入动物体内，并缝合腹膜。用手术钉夹住伤口，让动物恢复1周，直到每周对肿瘤摄取和进展进行超声波监测。
人类PDAC原位注射以类似的方式进行，通过注射5×105MiaPaCa2和/或1×106hPSC#1在8周龄裸鼠（Taconic ncrnu-f）胰腺尾部感染shGFP、shATG5或shATG7 shRNAs。当在胰腺中检测到的肿块达到至少1mm的体积时，动物被认为是肿瘤阳性三根据3D超声计算。所有动物研究都不是盲法或随机的。根据DFCI IACUC方案#10-055进行研究，其中允许的最大肿瘤尺寸小于2 cm。
