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生物化学杂志。作者手稿；PMC 2016年11月28日发布。
以最终编辑形式发布为：
生物化学杂志，2008年8月15日；414(1): 31–41.
数字对象标识：10.1042/BJ20071240
预防性维修识别码：PMC5125090型
NIHMSID公司：NIHMS504520
PMID：18370930

鞘氨醇合成酶调节高尔基体二酰甘油的生成

玛丽斯泰拉·维拉尼,*† 马里穆图·苏巴特拉,* Yeong-Bin进口,* 小崔,* 保拉·西尼奥雷利,‡ 毛里齐奥·德尔·波塔,*§‖和奇亚拉·卢贝托*,1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

SMS[SM（鞘磷脂）合成酶]是一类通过将磷酸胆碱部分转移到神经酰胺上而产生SM的酶。PC（磷脂酰胆碱）被认为是反应产生DAG（二酰甘油）的磷酸胆碱供体，DAG是一种重要的生物活性脂质。在本研究中，通过调节SMS1和SMS2的表达，研究了这些酶在DAG难以捉摸的调节中的作用。因为我们发现SMS1或SMS2的调节并不影响休息细胞内源性DAG的总水平，而它们产生DAG体外研究表明，一旦酶的急性激活被触发，SMS可能会调节DAG的亚细胞池。短链神经酰胺类似物或增加质膜上的内源性神经酰胺均可刺激SM合成，并使用荧光标记的传统C1结构域[来自PKC（蛋白激酶C）]增强其DAG结合活性，以探测细胞中DAG的亚细胞池。通过这种方法，我们发现，使用共焦显微镜和亚细胞分馏，SMS1和SMS2的调节在较小程度上影响高尔基体DAG的形成。同样，SMS1和SMS2的下调减少了DAG结合蛋白PKD（蛋白激酶D）在高尔基体的定位。这些结果提供了直接证据，证明这两种酶都能够调节细胞中DAG的形成，DAG池具有生物活性，并且首次直接暗示SMS1和SMS2是高尔基体中DAG结合蛋白的调节器。

关键词：神经酰胺、二酰甘油、二酰丙三醇结合域、高尔基体、鞘磷脂、鞘磷脂合成酶

简介

SMS[SM（鞘磷脂）合成酶]是一类参与合成SM的酶，SM是一种丰富的磷脂，在质膜完整性中具有重要的结构作用。PC（磷脂酰胆碱）是磷酸胆碱基团的提议供体，SMS将其转移到神经酰胺的初级羟基上，生成DAG（二酰甘油）作为反应的附加产物[1–5]. 因此，有人认为，SMS的生物学重要性不仅在于SM的生物合成，还在于以相反的方向调节神经酰胺（一种经常对细胞增殖产生负面影响的生物活性分子）和DAG（一种成熟的信号脂质）的水平[6]. 此外，SMS活性通过控制SM和神经酰胺的水平，也可能参与质膜脂筏的功能调节[7,8].

为了支持SMS超越SM合成的内务管理功能的作用，有报道称其活性的正调控与增强的增殖和转化条件有关，如肝再生、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）刺激的星形胶质细胞、SV40（猴病毒40）-转化成纤维细胞与肝细胞癌[6,9,10]. 另一方面，在Kym-1横纹肌肉瘤细胞中TNF（肿瘤坏死因子）启动凋亡后，观察到半胱氨酸蛋白酶依赖性抑制SMS活性[11]Jurkat细胞中的Fas交联[12]这导致了一个假设，即SMS的抑制可能是细胞凋亡程序充分发展所需的调节过程。

到目前为止，只有少数潜在的SMS下游目标被确定。特别是，有人提出，通过血清刺激激活SM合成以响应Madin–Darby犬肾细胞的生长启动，从而产生DAG，DAG与PKC（蛋白激酶C）的激活相关，通过其膜移位进行测量[13]. SMS在PKC调节中作用的间接证据来自于对U937人单核细胞白血病细胞的研究，其中使用SMS的药物抑制剂D609可诱导神经酰胺的显著积累和DAG水平的显著降低，随后导致细胞死亡。用PKC激活物PMA预处理或补充细胞渗透性DAG类似物可大大减弱D609介导的细胞毒性，绕过SMS抑制的作用[14]. 我们小组的其他研究表明，活性SM合成与核移位和NF-κB（核因子κB）激活相关[15]，一种重要的转录因子，通常与生存途径和炎症反应有关。最后，来自鞘脂代谢的DAG可能与PKD（蛋白激酶D）向高尔基体的易位有关[16].

哺乳动物SMS（即SMS1和SMS2）最近才被分子鉴定出来[17,18]. 总的来说，SMS1和SMS2之间没有发现显著的生化差异[17]. 另一方面，当在HeLa人宫颈癌细胞中表达时，两种SMS显示出不同的细胞定位，其中SMS1定位于高尔基体，SMS2定位于高尔基体和质膜[17]. 这种定位模式与早期使用分馏技术进行的生化研究相一致，这些研究报告了高尔基体中SMS的大部分活性以及其他细胞隔室（包括质膜）中的残余活性[三,19].

在哺乳动物模型中进行的研究证实了两种SMS调节细胞中SM和神经酰胺水平的能力[7,18,20–23]. 另一方面，没有明确证据表明SMS1或SMS2参与DAG的调节。事实上，在这些报告中，SMS的下调并没有引起PC或DAG水平的显著变化。

在本研究中，我们通过siRNA（短干扰RNA）下调和过度表达上调来研究SMS1和SMS2在DAG水平调节中的作用。在验证了我们的siRNA序列和表达系统的作用后，我们发现SMS1和SMS2都能够调节高尔基体DAG的形成，并且通过这样做，它们影响了DAG结合蛋白PKD在这个隔间的定位。

实验

材料

DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基）和RPMI 1640培养基、胰蛋白酶/EDTA和FBS（胎牛血清）来自Gibco/Initrogen；抗FLAG单克隆抗体来自Sigma，抗（小鼠IgG）购自Santa Cruz Biotechnology；抗V5单克隆抗体购自Invitrogen。下一个工作日[N个-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）]-C6-神经酰胺和NBD-C6-SM是从Molecular Probes公司购买的。[9,10-三H（n）]棕榈酸和[甲基-三H] 氯化胆碱购自美国放射性标签化学品公司。所有其他脂质均购自Avanti Polar lipids（美国亚利桑那州Alabaster）。

细胞培养

HeLa和SV40转化的WI38（成纤维细胞）细胞在高糖DMEM中培养。培养基中添加10%的FBS，细胞在37°C的加湿5%CO中生长2孵化器。

SMS1和SMS2下调

通过siRNA寡核苷酸靶向实现SMS1或SMS2的下调SMS1型（CACACTATGGCAATCAGCA）或SMS2型（AAGGCACAAAAAGTACCGG）由Qiagen合成，并使用寡效胺™转染试剂（Invitrogen）。非特异性全明星siRNA序列（SCR；加扰siRNA）用作对照（Qiagen）。通常为0.2–0.23×106将不超过20代的指数生长培养物中的HeLa细胞置于直径为10-cm的培养皿中。大约24小时后，根据制造商的说明，在Optimem培养基中总共6 ml含有siRNA和Oligofectamine™的转染混合物中用siRNA转染细胞。培养6小时后，将6毫升含有20%FBS的DMEM添加到平板中。

DAG测量

DAG水平使用大肠杆菌DGK（二酰甘油激酶）测定，如[6].

SMS分析

收集HeLa细胞，并通过28.5 gauge针头在冰镇裂解缓冲液中均匀化20次。裂解缓冲液含有25 mM Tris/HCl（pH 7.4）、5 mM EDTA和1 mM PMSF。细胞裂解物在300℃下离心克在4°C下持续5分钟，并使用上清液测量酶活性。蛋白质浓度使用Bio-Rad分析测定。使用50µg蛋白质进行SMS分析。基底是40µM NBD-C的混合物6-通过超声波和涡流，神经酰胺和200µM PC在100 mM Tris/HCl（pH 7.4）、50 mM KCl和1 mM EDTA中再次悬浮，直至澄清。对于NBD-C的实验6-或NBD-C12-使用PC，基底制备为40µM C的混合物6-神经酰胺、100µM NBD-PC和100µM天然PC。将底物与再悬浮在裂解缓冲液中的蛋白质按1:1稀释（最终培养体积为100µl），并在30°C的黑暗中培养30 min。通过添加3体积的氯仿/甲醇（1:1，v/v），在冰上停止反应。旋涡作用后，通过2400℃的离心作用澄清相克将下相转移到新管中5分钟，干燥，用40µl氯仿/甲醇（2:1，v/v）重新悬浮脂质，并在氯仿/乙醇/15 mM CaCl中通过TLC分离2（90:52.5:12，按体积计）。使用Amersham Biosciences（英国）的Storm 860成像分析系统测量荧光。使用Amersham Biosciences的ImageQuant软件对结果进行分析。

FLAG–SMS或SMS2–V5的过度表达

用0.3×10电镀HeLa细胞6每10-cm直径培养皿中的细胞数。2天后，Effectene将1µg pcDNA3.1转染细胞，其中在N端含有FLAG标记的SMS1或SMS2，或在C端含有V5标记的SMS2®Qiagen的转染试剂应符合制造商的说明。通过对购自Open Biosystems（Alabama）的全长cDNA克隆进行PCR获得构建物，对于FLAG–SMS1，使用5′-引物CAATAGCTTGCCACCATGAAAGGACGACGAGAAGAGTGTTATTGGTAC和3′-引子CACGAATCACCGGCTGTGTGTG；对于FLAG–SMS2，使用了5′-引物CAATAGAGCGCCACCATGGATATAGAGGACGACGATAGATATACAGACAAAAC和3′-引子CACGAATTCAGGTCGATTTCATCTTCAC；对于SMS2-V5，使用了5′-引物CAATAGAGCCACCATGGATAGACAGAAACTTG和3′-引子CACGAATCCACGTAGAGAGAGAGGGGTTAGGAGGCTACGGTCGTCGATTCTCATTGTTCAC。

NBD-C的细胞代谢6-神经酰胺

将HeLa细胞以0.2×10的密度放置在直径为10-cm的培养皿中6或0.3×106分别用于沉默RNA或过度表达FLAG-SMS1和FLAG-SMS2。在48小时和72小时的siRNA处理或36小时的过度表达后，在新鲜培养基中用5µM NBD-C处理细胞6-神经酰胺最多持续8小时。将细胞刮入2ml冰镇PBS中，并用额外2ml PBS清洗每个平板。将细胞和清洗液合并，并在1000℃下离心5分钟克（4°C）。使用Bligh和Dyer方法从细胞颗粒中提取脂质[24]. 将有机相分为两等分，300µl用于脂磷测定，1 ml用于脂分析。干燥脂质分析的有机相，用50µl氯仿/甲醇（2:1，v/v）重新悬浮脂质，然后在氯仿/乙醇/15 mM CaCl中用TLC分离2（90:52.5:12，按体积计）。荧光使用Amersham Biosciences的Storm 860成像分析系统进行测量，并使用ImageQuant进行量化。收集未经处理的转染细胞作为对照，通过Western blot检测FLAG–SMS1或FLAG–SM S2的表达和SMS活性。

bMase（细菌SMase）处理和SM再合成

将HeLa细胞以0.3×10的密度放置在直径为10-cm的培养皿中6FLAG–SMS1或FLAG–SM S2过度表达。在过度表达24小时后，用生长培养基清洗细胞，然后用50 mU/ml bSMase处理60分钟。然后取出培养基，用PBS清洗细胞三次。添加新鲜生长培养基后，将细胞培养指定时间。然后收集细胞，并按照前面所述进行SM质量水平的非放射性测量[6]. SMS证实了FLAG–SMS1和FLAG–SM S2的表达体外每个实验的活动。

免疫荧光和共聚焦显微镜

将HeLa细胞以5×10的密度接种在直径为35mm的共聚焦培养皿中424小时后，用1µg携带常规C1结构域的pcDNA3.1质粒转染细胞，该结构域突变以增加其对DAG的结合亲和力（YFP–DBD；黄色荧光蛋白–DAG结合结构域），由Alexandra Newton博士（美国加利福尼亚州圣迭戈加利福尼亚大学）提供[25]. 转染22小时后，更换培养基，用20 nM PMA、10µM DiC8（1,2-二辛醇）处理细胞30分钟-锡-甘油）1小时，3µMd日-电子商务6-神经酰胺或我-电子商务6-神经酰胺（其中e为红的)在生长培养基中培养1h。为了下调SMS的表达，将细胞以3×10的密度进行培养4在直径为35mm的共焦皿中。24小时后，用10 nM siRNA或Oligofectamine™单独处理细胞（对照）。48小时后，用上述1µg YFP–DBD质粒转染细胞并培养22小时。在一些实验中，由O.Rey博士和E.Rozengurt博士（美国加利福尼亚州洛杉矶市加利福尼亚大学大卫·格芬医学院）提供的1µgPKD–RFP（PKD–红色荧光蛋白）根据制造商的说明，使用来自Qiagen的Superfect试剂转染16小时。然后根据需要处理细胞。在bSMase处理的情况下，将50 mU/ml的bSM ase与细胞孵育1 h，然后洗去bSMase，并用常规生长培养基孵育细胞3 h。在室温（24°C）下，用3.7%甲醛固定15 min，停止处理。用PBS清洗平板后，用共焦显微镜对细胞进行分析。使用LSM 510 META激光扫描显微镜（德国耶拿蔡司）捕获并处理共焦图像。在一些实验中，用1µg YFP–DBD和pcDNA 3.1（空载体）、SMS1–FLAGor SMS2–V5共转染HeLa细胞22 h，然后用3µM C处理6-神经酰胺。在室温下用3.7%甲醛固定15分钟后，用100%甲醇（−20°C）渗透细胞5分钟。用1.5%FBS在PBS中清洗细胞三次，每次5分钟，然后在室温下在2.5%FBS中封闭1小时。使用小鼠单克隆抗V5或抗FLAG抗体（分别来自Invitrogen和Sigma）在1.5%FBS中用0。5%皂苷，1:100稀释，室温下1.5小时。然后用1.5%FBS/PBS将细胞再清洗三次，每次5分钟，并用抗鼠Alexa Fluor孵育®633-结合抗体（1.5%FBS中1:400，含0.5%皂苷）在室温下黑暗中1小时。在共焦显微镜下分析之前，用1.5%FBS/PBS再清洗细胞三次，每次5分钟。在一些实验中，giantin和TGN38(反式-高尔基网络蛋白38）被用作高尔基标记物。来自Covant的抗大黄素抗体以1:200稀释度使用，而来自Santa Cruz的抗TGN38抗体以1:50稀释度使用。Alexa Fluor公司®633或488结合的抗兔或抗羊抗体用作次级抗体。在SV40转化的WI38细胞的实验中，0.025×106将细胞接种在未涂布的共聚焦培养皿中。48小时后，用50 nM siRNA处理细胞。48小时后下调，用效应基因转染1µg YFP–DBD细胞®Qiagen试剂，按照制造商的说明。16小时后，用3µM C处理细胞6-神经酰胺，然后进行相应处理。

YFP–DBD分馏

将HeLa细胞以0.2×10的密度放置在直径为10-cm的培养皿中6，每个治疗组有四块钢板。48小时后，用0.2–0.5µg携带YFP–DBD的哺乳动物表达质粒转染细胞。16小时后，用3µM C处理细胞6-神经酰胺作用1h，然后在PBS中通过刮取收集。细胞通过超声溶解（三个周期，15 s，间隔30 s）。一等分样品用于检测YFP–DBD总量，其余样品在1000℃下旋转克分离细胞核10分钟。核后裂解物在100000下离心克在4°C下保持1小时。将总膜组分重新悬浮在样品缓冲液中，并用于蛋白质印迹。在SDS/10%PAGE凝胶上加载来自每个样品的总裂解液等分样品，其中转染的YFP–DBD水平大致相同。同时加载与所用总裂解物分数相对应的总膜等分样品。将凝胶转移到硝化纤维素膜上，然后用抗GFP/YFP单克隆抗体进行印迹（克隆泰克；1:1000稀释）。用HRP（辣根过氧化物酶）结合的抗小鼠二级抗体（1:6000）印迹膜后检测到信号，并由ECL开发®（增强化学发光）（Amersham）。使用Labworks软件通过密度测定法测定信号强度。

统计分析

使用Student’st吨-测试，以及P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

结果

SMS1或SMS2调节的有效性和特异性

为了表征人SMS1和SMS2在DAG形成中的作用，通过用siRNA或SMS表达质粒瞬时转染细胞，通过下调或上调两种酶的表达来调节这两种酶，从而进行脂质分析。因为这项研究是在其他最近也使用siRNA的研究发表之前开始的[22,23]这导致本研究中使用的siRNA序列与已发表的不同。因此，对其有效性和特异性进行了深入分析。如图所示补充材料截面（位于http://www.BiochemJ.org/bj/414/bj4140031add.htm)英寸补充图S1，这两个siRNA序列在下调每个SMS中都是有效且特异的。SMS1或SMS2的下调或上调减少或增强从头开始SM的合成(补充图S2)和SM质量水平(补充图S3)分别。任一SMS的下调均导致神经酰胺水平升高(补充图S4). 这些结果证明了本研究中用于调节SMS表达的实验模型的有效性和特异性。

SMS1或SMS2的下调不影响总的基础DAG水平

我们在哺乳动物细胞中进行的研究(补充材料)和其他[7,18,20–23]已证实两种SMS都有调节细胞内SM和神经酰胺水平的能力。另一方面，没有公开的明确证据表明SMS1或SMS2参与DAG的调节。因此，研究了SMS1或SMS2的下调是否也会影响这种生物活性脂质的内源性水平。有趣的是，如所示图1（A），通过DGK测定，SMS1和SMS2的下调均未引起总DAG水平的显著变化。

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SMS1和SMS2调节DAG生产体外但它们的下调并不影响基础总DAG水平

(A类)用siRNA靶向处理细胞SMS1型（SMS1−）或SMS2型（SMS2−）48或72小时，然后收集用于通过DGK分析测定DAG。所示结果是两次独立实验的平均值。误差线代表S.D(B类和C类)用空载体FLAG-SMS1或FLAG-SMS2转染细胞24小时。然后收集细胞并进行处理体外SMS酶分析如实验部分所述。荧光标记短链PC类似物（NBD-C6-PC或NBD-C12-PC）用作基底。所示结果是三个独立实验的平均值。误差线代表S.D.和*P（P）与矢量相比<0.05。

SMS1和SMS2生产DAG体外

由于下调任一SMS后均未观察到PC（假定底物）和DAG（假定产物）的基础水平发生显著变化，因此在哺乳动物细胞中表达后，测定了两种SMS以PC为底物形成DAG的能力体外在过度表达24小时后，两种FLAG–SMS都能产生NBD-C6-(图1B)或NBD-C12-DAG公司(图1C)来自NBD-C6-或NBD-C12-PC分别具有与使用NBD-C获得的活动概况类似的活动概况6-神经酰胺作为基质(补充图S1D). 这些结果证实了SMS1和SMS2从PC形成DAG的能力，至少在体外设置。

SMS1和SMS2能够调节DAG的形成

因为SMS下调后，在基础条件下未观察到DAG总水平的变化(图1A)，而两种SMS都可以使用PC作为基底来形成DAG体外(图1B和1C)研究了SMS在酶的急性激活被触发后调节DAG亚细胞池的可能性。

为了解决这一问题，YFP–DBD被用于探测细胞中DAG的亚细胞池[25]. 短链神经酰胺类似物被广泛用作研究细胞内SM合成的底物，它首先通过处理诱导SM合成[15,26]. 为了验证SMS1和SMS2在进入细胞后使用这些神经酰胺类似物作为底物，用NBD-C处理HeLa细胞6-SMS调制后的神经酰胺(图2). 在SMS1和SMS2下调（10 nM SMS1或SMS2 siRNA 48小时）后，用5µM NBD-C处理HeLa细胞6-神经酰胺4小时，以及SMSs下调对NBD-C转化的影响6-神经酰胺进入NBD-C6-确定SM。如所示图2（A）SMS1（SMS1−）或SMS2（SMS2−6-SM产量分别约为70%和40%。重要的是，NBD-C的产量没有下降6-观察到了葡萄糖神经酰胺（结果未显示），这也支持了所选SMS1和SMS2 siRNA诱导效应的特异性6-神经酰胺培养（结果未显示）。另一方面，FLAG-SMS1或FLAG-SMS2的24小时过度表达显著增强了NBD-C的细胞合成6-NBD-C的SM6-4h神经酰胺(图2B). 有趣的是，NBD-C的增强6-SM产量导致NBD-C略有下降6-葡萄糖神经酰胺的产生，表明可能存在对底物的竞争（在处理2、6和8小时以及过度表达36小时后获得相同的曲线；结果未显示）。因此，这些结果表明短链神经酰胺类似物被两种SMS用作细胞基质。此外，自NBD-C6-神经酰胺被传递到高尔基体并被代谢，这些数据也表明该细胞室中的SMS2部分具有显著的SMS活性。

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SMS1或SMS2的调节影响NBD-C的细胞代谢6-神经酰胺至NBD-C6-SM公司

(A类)HeLa细胞单独用寡聚体胺™（CT）处理，用10 nM SCR或siRNA靶向SMS1型（SMS1−）或SMS2型（SMS2−）48小时(B类)用空载体FLAG-SMS1或FLAG-SMS2转染细胞24小时。然后用5µM NBD-C处理HeLa细胞6-神经酰胺4小时，并按照布莱和戴尔的描述提取总脂质[24]; 将等量的总磷脂加载到TLC板上，并在氯仿/甲醇/15mM CaCl中分离脂质2（60:35:8，按体积计算）。荧光脂类使用荧光成像仪进行可视化，并使用真实标准进行鉴定。结果是至少三个独立实验的平均值，误差线代表S.D.和*P（P）<0.05，与单独使用Oligowetamine™相比(A类)或矢量控制(B类).

为了确定YFP–DBD确实能够对细胞中DAG或DAG类似物水平的变化作出反应，HeLa细胞被YFP-DBD转染，然后装载DAG功能类似物（PMA或DiC8）[16]. 尽管对照细胞显示YFP–DBD的弥漫和核周点状模式(图3A)，用PMA处理的细胞(图3B)显示YFP–DBD向质膜的明显且预期的易位，而DiC8处理诱导YFP–DBD向与高尔基体一致的近轴亚细胞室的易位(图3C). 这些结果清楚地显示了YFP–DBD对细胞内DAG类似物水平变化的响应性。一旦系统被证明是功能性的，YFP–DBD在受激SM合成条件下的定位就被解决了。因为短链神经酰胺类似物可以被识别为SMS底物(图2)，用C刺激YFP–DBD表达细胞中SM合成的诱导6-神经酰胺(图3D). 作为对这种治疗的反应，YFP–DBD与高尔基体标记giantin共同定位(图3E和3F)表明YFP–DBD在高尔基体内的易位，高尔基是SM合成的已知亚细胞位点。为了确保神经酰胺处理的细胞中YFP–DBD向高尔基体的移位是由于神经酰胺的代谢而不是由于神经酰胺本身的存在，用我-电子商务6-神经酰胺，一种不在细胞中代谢的立体异构体[26] (图3I). 在这种情况下，控制之间没有显著差异(图3G)和我-电子商务6-观察到神经酰胺处理的细胞(图3I)表明YFP–DBD易位是由于高尔基体内神经酰胺代谢所致。重要的是，当刺激SM合成时，YFP–DBD易位的位置不仅与高尔基体相对应(图3F)也可以到达SMS1的细胞定位点(图4A–4C)以及SMS2的一部分(图4D–4F). 总之，这些结果表明，SM合成受到C代谢的刺激6-神经酰胺通过SMS所在高尔基位点DAG的形成诱导YFP–DBD易位。

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短链神经酰胺代谢诱导高尔基体产生DAG

用1µg YFP–DBD转染HeLa细胞22小时。然后使细胞未经处理(A类)和(G公司)或用20 nM PMA处理30分钟(B类)或使用10µM DiC8(C类)，含3µMd日-电子商务6-神经酰胺(D类), (E类)和(H（H）)或3µM我-电子证书6-神经酰胺(我)固定细胞1小时(A–C)和(G–I型)使用YFP荧光通过共焦显微镜直接分析细胞。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。在(D–F型)，用抗-giantin（高尔基标记物）多克隆抗体对细胞进行间接免疫荧光处理，并用抗兔Alexa荧光染色®633-结合二级抗体（红色）。图像是至少两个独立实验的代表。箭头表示共同本地化的站点。

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短链神经酰胺代谢产生DAG的位点与SMS在高尔基体共定位

HeLa细胞与YFP–DBD（绿色）和携带SMS1–FLAG（SMS 1-F；A–C)或SMS2-V5(D–F型)然后用3µM处理细胞22 hd日-电子商务6-神经酰胺1小时，固定并使用单克隆抗FLAG处理免疫荧光(A–C)或抗V5(D–F型)抗体和二次Alexa Fluor染色®633-共轭抗鼠抗体（红色）。样品通过共焦显微镜进行分析。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。图像是至少两个独立实验的代表。箭头表示共同本地化的站点。

为了研究在高尔基体内SM合成活跃的条件下，SMS是否对YFP-DBD易位负责，研究了SMS1和SMS2基因敲除对C6-测定神经酰胺(图5). 如图所示，SMS1下调(图5C)或SMS2(图5D)在非刺激条件下，未诱导YFP–DBD的并列模式发生显著变化。另一方面，在受到d日-电子商务6-神经酰胺，SMS1的敲除(图5G)与Oligofectamine™相比，诱导YFP–DBD向高尔基体移位的显著丢失(图5E)或SCR(图5F)控制。SMS2敲除后，观察到YFP–DBD易位的抑制作用不太明显，但仍然存在(图5H). 为了确认和量化SMS1和SMS2下调对YFP–DBD易位的影响，在任一SMS下调后，用YFP-DBD和C转染，分离出总膜组分6-神经酰胺处理。将总细胞提取物和各自的总膜级分装载在SDS凝胶上，并通过蛋白质印迹测定YFP–DBD水平(图6A). 如所示图6（B），通过量化每个样品中膜组分中YFP–DBD的水平，发现SMS1下调后，膜组分的YFP-DBD减少了4倍。SMS2下调的影响不太显著，但仍然显著。共焦显微镜分析显示，在人类SV40转化的WI38肺成纤维细胞中也获得了类似的结果(图7和​和8）。8). 同样在该细胞系中，在非刺激条件下，SMS1或SMS2的下调并没有显著改变YFP–DBD在细胞内的扩散模式（结果未显示），而C6陶瓷治疗增强了YFP-DBD在高尔基体的定位，如与高尔基体标记物giantin和TGN38的共同定位所示(图7). 另一方面，SMS1的下调明显抑制了C6陶瓷刺激SM合成诱导的YFP–DBD高尔基体定位(图8C). 与HeLa类似，在SV40-转化的WI38细胞中，SMS2下调的效果不如SMS1敲除时的效果明显，但仍然可以观察到(图8D). 为了进一步证实这些结果，两个额外的特异性和有效的siRNA靶向SMS2型[22,23]也使用了（SMS2.2−和SMS2.3−）(图8E和8F). 重要的是，这些额外的siRNA证实了原始SMS2−序列获得的结果(图8D). 总之，这些结果支持了SMS1和SMS2能够调节高尔基体DAG形成的假设。

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SMS1和SMS2负责通过短链神经酰胺的代谢产生DAG

HeLa细胞用低聚体胺™（CT；A类和E类)，10 nM可控硅(B类和F类)，siRNA靶向SMS1型（SMS1−；C类和G公司)或SMS2型（SMS2−；D类和H（H）)48 h。然后用1µg YFP–DBD转染细胞22 h。然后不处理细胞(A–D)或用3µMd日-电子商务6-神经酰胺（D-e-C6-Cer）1小时(E–H（E–H）)然后用共焦显微镜进行固定和分析。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。这些图像代表了至少三个独立的实验。

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SMS1和SMS2调节膜部分中YFP–DBD的水平

(A类)下调SMS1（SMS1−）或SMS2（SMS2−）和C后，总YFP–DBD及其膜相关部分的水平6-通过Western blotting分析确定神经酰胺处理。(B类)报告了与膜组分相关的YFP–DBD水平与每个样品中存在的总转染YFP-DBD之间的比率的量化。使用Labwork软件量化凝胶上条带的强度。(A类)显示了一个具有代表性的实验。量化结果如所示(B类)是三个独立测量值的平均值。误差线代表S.D.和*P（P）与对照组（CT）相比<0.05。

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在SV40转化的WI38细胞中，刺激SM合成可诱导YFP–DBD定位于高尔基体

用3µM C处理SV40转化的短暂过度表达YFP–DBD的WI38细胞6-神经酰胺固定1h后，使用抗栀子苷或抗TGN38抗体进行间接免疫荧光。YFP–DBD与这两种蛋白的共定位表明YFP-DBD的高尔基体定位。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。

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SMS1和SMS2负责通过SV40转化的WI38成纤维细胞中短链神经酰胺的代谢产生DAG

SV40转化的WI38成纤维细胞用低聚体胺™（CT）处理(A类)，10 nM可控硅(B类)或siRNA靶向SMS1型（SMS1负极）(C类)或SMS2型（SMS2负极）(D类)48 h。然后用1µg YFP–DBD转染细胞22 h。然后，用3µMd日-电子商务6-神经酰胺（De-C6-Cer）1 h，然后固定并通过共焦显微镜进行分析。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。(E类)和(F类)用5 nM靶向SMS2的两个额外siRNA序列处理细胞[5 nM的SMS2.2−或SMS2.3−被发现导致SMS2最大下调，如RT-PCR（逆转录-PCR）所确定]。这些图像代表了两个独立的实验。

为了进一步研究SMS1或SMS2利用内源性底物调节DAG形成的能力，通过急性处理完整HeLa细胞的bSMase诱导SM水解，增加神经酰胺水平，从而刺激SM合成。如所示图9（A）和9（B），用bSMase处理1h后，约60%的SM被水解，一旦bSMases被洗掉，细胞在4h内重新合成SM，约为对照水平的85%。SMS1或SMS2的过度表达导致SM重新合成显著增加，与矢量控制相比，允许在2.5小时内产生两倍以上的SM量（约17 nmol的SM/nmol的P我SMS与7 nmol SM/nmol P的比较我对于矢量）(图9C). 这些结果表明，SMS1和SMS2都有助于由质膜上产生的神经酰胺合成SM。为了评估刺激内源性神经酰胺合成SM是否会诱导DAG的形成，在用bSMase处理的细胞中测定了YFP–DBD的定位，并允许其重新合成SM 3小时，如图所示图10（A）和10（B）质膜神经酰胺诱导YFP–DBD向高尔基体移位合成SM(图10A和10B与…相比图5A和5B). 重要的是，SMS1或SMS2的下调显著抑制了YFP–DBD的易位，导致类似于对照细胞的更广泛的定位(图10C和10D与…相比图5C和5D). 总之，这些结果表明，在质膜上生成的大部分神经酰胺被输送到高尔基体进行SM再合成，高尔基体上的SMS1和SMS2负责SM再合成的发生，SMS1与SMS2都能够利用内源性神经酰胺在高尔基体形成DAG。

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SMS1和SMS2都通过质膜产生的神经酰胺调节SM的合成

(A类)实验条件示意图(B类)和(C类). 在用50 mU/ml bSMase处理1小时后，彻底清洗细胞，并在没有bSMases的情况下培养6小时。按照实验部分所述，在指定的时间点收集细胞，并对非放射性SM测量进行脂质分析。对于(C类)在FLAG-SMS1或FLAG-SMS2过度表达18小时后，用50 mU/ml的bSMase处理HeLa细胞1小时，然后在没有bSMases的情况下培养2.5小时；然后冲洗细胞，收集在冰镇PBS中，并按照实验部分所述对非放射性SM测量进行脂质分析。这些值代表至少3个独立实验，误差条代表S.D.和*P（P）与病媒控制相比，<0.05。

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SMS1和SMS2负责从质膜产生的神经酰胺代谢产生DAG

HeLa细胞用低聚体胺™（CT）处理(A类)，10 nM可控硅(B类)或siRNA靶向SMS1型（SMS1负极）(C类)或SMS2型（SMS2负极）(D类)48 h。然后用1µg YFP–DBD转染细胞22 h。然后，用bSMase处理细胞，如图9去除bMase后，将细胞孵育3小时，然后固定并通过共聚焦显微镜进行分析。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。这些图像代表了至少三个独立的实验。

为了评估高尔基体通过SMS1和SMS2产生DAG的生物学功能，测定了刺激SM合成对DAG结合蛋白PKD定位的影响。C刺激SM合成6-神经酰胺和它被发现可以增强PKD–RFP在类似高尔基体的核周区域的定位（比较图11A和图11B或11E). 为了证实在刺激SM合成时PKD–RFP在高尔基体的定位增强，用PKD–RFP瞬时转染并用C处理的细胞6-神经酰胺用高尔基标记物giantin染色(图11B–11D)或TGN38(图11E–11G). 事实上，用C处理后PKD–RFP与高尔基体标记物的共同定位6-神经酰胺提示PKD–RFP重新定位到SM合成位点。重要的是，SMS1的下调明显抑制了PKD–RFP在高尔基体的定位(图12C与12A和12B的比较)，PKD–RFP分散在整个小区，与控制小区类似(图11A). 与在YFP–DBD病例中观察到的结果相比，使用所有三种不同的siRNA序列下调SMS2的效果(图12D–12F)与SMS1基因敲除后观察到的结果相比，其显著性较低。总的来说，这些结果支持以下结论：SMS1和SMS2能够在高尔基体产生DAG，并且该DAG具有生物活性，因为它能够将DAG结合蛋白（如PKD）招募到该细胞器中。

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刺激SM合成诱导PKD定位于高尔基体

短暂过度表达PKD–RFP（红色）的HeLa细胞要么未经治疗(A类)或用3µM C处理6-神经酰胺1小时后固定(B–G). 对于(B–G)，使用抗栀子苷进行间接免疫荧光(C类和D类)或抗TGN38(F类和G公司)抗体（绿色）。PKD–RFP与giantin和TGN38（箭头）的共同本地化表明PKD–REP的高尔基本地化。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。这些图像代表了两个独立的实验。

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SMS1和SMS2在较小程度上调节PKD在高尔基体的定位，以响应SM合成的刺激

HeLa细胞用低聚体胺™（CT）处理(A类)，10 nM可控硅(B类)或siRNA靶向SMS1型（SMS1负极）(C类)或表面活性剂2（SMS2负极）(D类)将1µg PKD–RFP转染细胞48 h。然后用3µMd日-电子商务6-神经酰胺（De-C6-Cer）1小时，然后固定并通过共聚焦显微镜进行分析。使用LSM 510 META捕获并处理共焦图像。(E类和F类)用5 nM的两个额外siRNA序列靶向细胞SMS2型（分别为SMS2.2−或SMS2.3−）。这些图像代表了三个独立的实验。

讨论

在本研究中，我们提供了直接证据，证明SMS1和SMS2都具有调节高尔基体DAG生成的能力，并且该DAG池具有生物活性。

SMS类酶的相关生化特征之一是DAG的形成。这种生化特性将使SMS成为鞘脂和甘油脂质之间相互作用的潜在重要调节器。有趣的是，我们发现哺乳动物细胞中表达的FLAG标记的SMS使用PC产生DAG体外我们发现两种SMS的下调并没有降低DGK测定的DAG总细胞质量。这一观察结果与最近发表的其他结果一致[22,23]它可能表明以下可能性之一：（i）SMS识别出一个非常有选择性的内源性PC池，从而产生一个特定的DAG池，该DAG池只能通过更具鉴别性的检测方法（如MS）进行测量；（ii）SMS的内源性底物不是PC；（iii）导致DAG形成的替代途径可迅速补偿SMS下调介导的脂质损失；这种可能性将补充一份报告，该报告描述在某些细胞系中不能观察到SM合成的DAG积累，因为它反向转化为PC[27]因此，在某些蜂窝环境中，SMS调节的DAG水平受到严格控制。

另一方面，YFP–DBD与刺激SM合成的治疗相结合，使我们能够可视化SMS1和SMS2调节高尔基体DAG水平的能力。COS-7细胞对UTP治疗的反应显示，这种突变的C1结构域对DAG局部升高的反应性[25]. 在我们的系统中，YFP-DBD被证明非常有用，可以探测SMS1或SMS2下调后DAG急性局部产生的变化。用C或C急性刺激SM合成6-神经酰胺或短期bSMase治疗是该方法成功的关键，因为当SMS1和SMS2下调时，在基础条件下DAG分布没有显著差异。这可能是因为急性刺激不允许其他代谢途径在对照细胞水平上补偿SMS下调导致的DAG损失。

SMS可能在高尔基体调节DAG的观察表明，它们参与了DAG结合蛋白的调节，已知DAG结合蛋白质通过C1结构域的存在对DAG代谢作出反应[28]例如新型PKC或PKD[16]. 特别是后者被发现在鞘磷脂合成反应中易位到高尔基体，可能通过SMS形成DAG[16]. 事实上，我们发现SMS1和SMS2的敲除在较小程度上导致高尔基体DAG形成减少（通过YFP–DBD观察到），同时也导致PKD在该隔室的定位受到抑制。本文报道的SMS产生DAG的能力首次直接证明了Golgi-localized SMS与PKD之间的联系，从而最终证明了SMS对分泌的调节。另一方面，PKD向高尔基体的移位通过CERT（神经酰胺转移蛋白）的失活对SM合成产生负反馈作用，而CERT又是PKD激活的关键，表明SM代谢、PKD活性和分泌调节之间存在非常紧密的联系[29].

尽管本研究中的证据支持定位于高尔基体的SMS2具有显著的SMS活性（参见从头开始SM的综合介绍补充图S2和NBD-C6-神经酰胺代谢图2)我们观察到，与SMS1相比，内源性SMS2对高尔基体DAG的产生和活性的作用要小得多。这种差异可能只是由于SMS2与SMS1在高尔基体中的整体活性相比较低，导致产生的DAG数量不足，或者SMS1和SMS2具有不同的PC底物特异性，产生具有不同生物活性的不同DAG池，或者DAG池SMS1产生的DAG-结合蛋白在胞浆中更容易接近。

总之，我们已经证明SMS1和SMS2具有调节高尔基体DAG生成的能力，并且该DAG池具有生物活性。这些结果揭示了一系列重要问题，即SMS1和SMS2在响应特定刺激调节DAG产生中的功能，磷酸胆碱头群的内源性来源，以及SMS1与SMS2相比的相互调节。我们打算通过我们正在进行的研究，为找到其中一些问题的答案做出贡献。

当这份手稿正在修订时，发表了一项研究，证实SMS1或SMS2的下调能够调节DAG水平[30]. 该手稿中使用的细胞系中，SMS的下调决定了DAG总水平的差异，而HeLa细胞没有表现出这种反应，这表明不同的细胞类型对DAG代谢扰动的反应不同。

补充材料

01

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致谢

我们感谢优素福·汉农博士和利娜·奥贝德博士的热情支持和批判性讨论。我们感谢南卡罗来纳医科大学生物技术资源实验室和霍林斯癌症中心分别在DNA测序和成像分析方面提供的支持。这项工作得到了国家科学基金会/EPSCoR的部分支持，EPS-0132573拨款，霍林斯癌症中心/南卡罗来纳医科大学国防部拨款，癌症控制和相关治疗转化研究（分包合同GC-3319-05-4498CM），NIH（国家卫生研究院）国家研究资源中心授予P20 RR-017677，美国癌症协会授予IRG 97-219-08。M.Del P.是Burroughs Wellcome传染病发病机制的新研究员。

使用的缩写

bS底座细菌鞘磷脂酶
DAG公司二酰甘油
数据库管理员DAG-绑定域
DGK公司二酰甘油激酶
DiC8公司1,2-二辛酰基-锡-甘油
DMEM公司Dulbecco改良的Eagle's培养基
FBS公司胎牛血清
下一个工作日N个-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）
个人计算机磷脂酰胆碱
PKC公司蛋白激酶C
PKD公司蛋白激酶D
招标书红色荧光蛋白
可控硅阴性对照
小干扰RNA短干扰RNA
性虐待鞘磷脂
短讯服务SM合酶
SV40型猴病毒40
TGN38型反式-高尔基网络蛋白38
YFP公司黄色荧光蛋白。

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