Bogalusa心脏研究参与者中肠道微生物组与终身心血管疾病风险状况的相关性

摘要

简介

人类肠道中有大量的微生物，统称为微生物群。尽管肠道微生物群对人类健康的影响已经被假设了一段时间，但直到过去十年，技术的进步才使全面表征宿主微生物群落并研究其与疾病状态的关系变得可行。^1,2越来越多的证据表明肠道微生物组在能量获取中发挥着关键作用^三、糖脂代谢^4,5和全身炎症⁵，这种共生超有机体对心血管疾病（CVD）发展的潜在影响已被假设。事实上，肠道微生物群与某些心血管疾病风险因素（包括肥胖）的横截面关系^6,7，2型糖尿病^8,9和血脂异常^10,11已经记录在案。肠道微生物群也被证明是从某些海鱼以及富含磷脂酰胆碱（卵磷脂）、游离胆碱和肉碱的食品或补充剂中衍生三甲胺（TMA）代谢物的不可或缺的组成部分。^12–14TMA是三甲胺-N-氧化物（TMAO）的膳食衍生前体¹⁵，一种最近被前瞻性地与CVD联系在一起的代谢物。¹⁴这些数据表明，人类肠道微生物组在CVD发展中可能具有重要作用。然而，很少有研究系统地评估肠道菌群组成对整体CVD风险的影响。

本研究的目的是在55名博加卢萨心脏研究（BHS）参与者的子样本中，全面探讨肠道微生物组分与终身CVD风险状况之间的关系，这些参与者的传统CVD风险因素负担最高，57名参与者的终身CVD危险因素负担最低。这项研究利用了从大约33年的随访中平均9次参与者访视中仔细收集的数据，以了解从儿童到成年的心血管疾病风险。此外，分析中控制了年龄、性别、种族、体重指数（BMI）和饮食等潜在的混杂因素。

方法

结果

在平均33年的随访中，使用9项血糖、收缩压和低密度脂蛋白胆固醇值的平均值来评估终身心血管疾病风险状况。表1比较BHS微生物组学研究参与者的特征和高、低寿命CVD风险特征。与心血管疾病风险低的患者相比，心血管疾病风险高的患者更有可能是男性，平均年龄更大，BMI更高。尽管总能量、蛋白质和动物脂肪摄入量似乎更高，而膳食纤维摄入量在心血管病风险高与低的参与者中更低，各组间营养素无显著差异。正如预期的那样，与低风险组相比，高风险组儿童和成人的血糖、收缩压和低密度脂蛋白胆固醇水平较高。

α多样性估计值和终生CVD风险状况之间的关联如所示表2微生物丰富度的增加与寿命期CVD风险预测的降低一致相关。例如，观察到的OTU数量每增加一个标准差，高寿命CVD风险预测的几率就会降低38%（95%CI:1%-61%）（P=0.04）。同样，Chao 1指数和ACE每增加一个标准偏差的优势比（95%CI）分别为0.62（0.39，0.99）和0.61（0.38，0.98）（分别为P=0.04和0.05）。尽管p值略有减弱，但在调整BMI（模型2）和其他饮食因素（模型3）后，关联程度保持一致。在任何统计模型中，评估微生物类群均匀性的α多样性估计值与CVD风险均无显著相关性（均P>0.05）。

各属之间的联系和终生CVD风险预测在模型之间通常是一致的(补充表)模型1和模型2以及模型1和3的z统计量的中等成对相关系数分别为0.60（P<0.0001）和0.57（P<000001）。在对年龄、性别和种族进行调整后（模型1），八个分类群在Bonferroni多重测试校正后显著。在拟杆菌门中，普雷沃菌科的三个属与心血管疾病风险显著相关，包括异普雷沃氏菌（P=2.96×10⁻⁶),普雷沃菌7（P=7.95×10⁻⁵)和副普氏菌属（P=6.48×10⁻⁴). 在厚壁菌门中，有四个与终生CVD风险相关的分类群，包括拉氏螺科的两个属，泰泽雷拉4（P=1.51×10⁻⁴)和泰泽雷拉（P=4.39×10⁻⁴)和两个属，分别属于维氏菌科和丹参科，巨单胞菌属（P=4.18×10⁻⁵)和类杆菌属（P=1.51×10⁻⁴)分别是。此外肠杆菌属变形杆菌属也与终身CVD风险相关（P=6.41×10⁻⁸). 在对BMI进行额外调整后（模型2），所有8个分类群在名义上都保持显著性（P<0.05），包括在Bonferroni校正后仍保持显著性的5个分类群(异普雷沃氏菌，P=6.53×10⁻⁹;普雷沃菌7，P=5.58×10⁻⁷;泰泽雷拉，P=7.83×10⁻⁶;巨单胞菌属，P=3.41×10⁻⁶; 和类杆菌属，P=1.87×10⁻⁴). 在进一步调整饮食后，除了副普氏菌属和肠杆菌属不再与CVD风险相关。在模型2中Bonferroni校正后，另外五个属具有重要意义，包括厚壁菌门中的三个属(Coprococcus 2型，P=1.38×10⁻⁴;巨球藻属，P=1.38×10⁻⁴; 和瘤胃球菌，P=5.01×10⁻⁴)，一个来自真古宙门(甲烷杆菌，P=1.20×10⁻⁴)一个来自变形杆菌门(地中海螺旋体，P=3.44×10⁻⁴). 其中，有两项在BMI调整前具有名义意义(甲烷杆菌，P=5.12×10⁻³和地中海螺旋体，P=3.61×10⁻³). 在模型3中，另外三个属是显著的，包括拟杆菌属中的两个属(细菌门S24-7，P=2.77×10⁻⁶和普雷沃菌2，P=5.67×10⁻⁵)一个来自厚壁菌门(Christensenellaceae R-7组，P=P=5.69×10⁻⁴). 仅限普雷沃菌2在先前的模型中达到了名义意义。

Bonferroni对任何模型中的多重测试进行校正后，所有16个分类群的关联方向均达到显著性，如所示图1A–C在模型1中与终身心血管疾病风险状况显著相关的分类群中，异普雷沃氏菌和类杆菌属与终身CVD风险预测降低相关（分别为Z=-4.67和-3.74）副普氏菌、普氏菌7、巨单胞菌、泰泽雷拉菌、泰泽雷拉菌4、和肠杆菌属与终身CVD风险预测增加相关（Z=3.41、3.95、4.10、3.52、3.79和5.41）。在对BMI进行额外调整后，这些属的影响方向保持一致，除了巨单胞菌属和副普氏菌属，这分别与寿命期CVD风险预测降低显著相关（Z=−4.64和−2.19）。除了副普氏菌属和肠杆菌属在调整饮食后与CVD风险预测不再相关，所有剩余模型1发现的关联方向在模型3中相似。在模型2中，大球星和瘤胃球菌似乎与终身CVD风险状况降低有关（Z=分别为−3.81和−3.48），而地中海螺旋体，Coprococcus 2、和甲烷杆菌增加了终身CVD风险状况（分别为Z=3.58、3.81和3.58）。在模型3中，细菌门S24-7和普雷沃菌2（Z=4.69和4.03）在具有高终身心血管疾病风险特征的人群中得到了丰富，而克里斯滕菌科R-7（Z=−3.45）在具有高终身风险特征的人群中耗尽。

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图1

16个分类群的组合达到P<6.67×10⁻⁴在基因水平的分析中。所有16个属的关联方向均按（a）年龄、性别和种族列出；（b）年龄、性别、种族和BMI；（c）年龄、性别、种族、BMI、总能量摄入和能量调节蛋白质摄入^§，动物脂肪^§、和纤维^§调整分析。红色阴影表示高心血管疾病风险状况的几率增加，蓝色阴影表示低心血管疾病风险情况的几率降低。较深的阴影表示Bonferroni多次测试校正后的重要性。虚线圆圈表示从1到6的（绝对）Z值的刻度。Phyla显示在外部实心圆的旁边。^§使用残差法调整总能量摄入。

讨论

在当前的研究中，我们确定了行李处理系统参与者中与终生CVD风险状况相关的α多样性和单个微生物属的综合测量。我们观察到微生物丰富度（而非均匀度）与终身CVD风险之间存在一致的反向关联。虽然以前的研究已经报道了拟杆菌门的有益联系和厚壁菌门与CVD危险因素的有害联系^三,32，其他研究的结果相互矛盾。⁷在属水平上，我们确定了16个与终生CVD风险状况显著相关的分类群，包括6个在所有研究模型中表现出一致关联的分类群Alloprentella、Prevotella 2、Prevodella 7、Tyzzerella、Tyzerella 4、，和类杆菌属。值得注意的是，这些发现包括在同一门中具有相反影响的属。例如，在拟杆菌中，异普雷沃氏菌与终身CVD风险降低相关，而普雷沃菌2和普雷沃菌7在我们的研究中，与终身CVD风险增加相关。在厚壁菌中，泰泽雷拉和泰泽雷拉4在CVD高危人群中富集类杆菌属在这个组中被耗尽了。这些数据可能有助于解释评估高阶分类群关联时发现的不一致性。While期间甲烷杆菌,肠杆菌，和地中海螺旋体在模型1和模型2中，心血管疾病风险高的人群中增加了，这些相关性在调整饮食因素后完全减弱，表明饮食可能会混淆观察到的相关性。几个发现在不同的模型中似乎相对不一致，在这个小样本中应谨慎考虑。例如，两者巨单胞菌和副普氏菌属在模型1中，CVD风险高的人群中表现丰富，在模型2中表现贫乏，在模型3中表现无关联。此外，瘤胃球菌、粪球菌、，和大球星仅在模型2中实现了显著性，而拟杆菌S24-7和克里斯滕菌科R-7仅在模型3中实现了显著性。总的来说，这些数据补充了越来越多的证据，表明肠道微生物群在心血管疾病风险中起着重要作用。

在我们的分析中，阿尔法多样性（通过观察到的OTU数量、Chao 1指数和ACE来衡量微生物丰富度）与终身CVD风险一致且呈负相关。这些数据与之前研究其他CVD风险因素（如BMI）的研究一致^7,11和血脂水平。¹¹相反，终生CVD风险与α多样性指标（包括香农指数、辛普森指数和反向辛普森指数）无关，α多样性测量包括微生物类群的均匀性。类似地，以往研究检查香农指数与CVD风险因素的关系，结果通常为零。^33,34这些数据表明，在确定CVD风险方面，不同微生物类群的丰度可能比它们的相对频率更重要。

在拟杆菌门中，本研究鉴定出普氏菌科的四个属。之前的研究已经将这一群体与包括肥胖在内的心血管疾病风险因素联系起来^35,36和糖尿病^37–39，但所报告的关联方向不一致。例如，福雷特及其同事发现，与非肥胖人群相比，肥胖人群中普雷沃菌群的发病率有所下降。³⁵这与Zhang及其同事的发现形成了对比，他们报告了Prevoteleceae家族在肥胖人群中的富集程度，而非肥胖人群中则有所增加。³⁶同样，Alkanani和Larsen发现糖尿病患者与对照组相比，普雷维菌科增加^38,39Fugmann及其同事发现，与对照组相比，妊娠期糖尿病妇女中普里沃菌科的比例过高。³⁷目前的研究确定了普氏菌科中具有不同影响的属；一些患者的心血管疾病风险状况增加，另一些患者的风险状况降低。鉴于在这个系统发育家族中既有有益的属也有有害的属，我们的数据可能再次表明，过去的不一致可能是由于在更高的分类学水平上将不同的属分组而导致的。此外，我们的研究结果表明，普雷伯菌科与心血管疾病危险因素的终生负担之间的关系独立于BMI。虽然先前的研究也确定了与糖尿病的关系，但我们不知道先前的报告表明普雷伯菌科与心血管病危险因素之间的关系可能是独立的BMI。在对中心性肥胖症的测量进行调整后，这种关系是否仍然存在尚不清楚。另外一个属，未知细菌细菌门S24-7家族，也从拟杆菌门中鉴定。据作者所知，这是首次将该属与CVD风险联系起来的研究。

我们的研究结果表明，在当前的研究中，厚壁菌门的八个属与终身CVD风险有关。在Lachnospiraceae家族中，我们确定了在具有高寿命CVD风险特征的物种中富集的属，例如泰泽雷拉,泰泽雷拉4号，和Coprococcus 2型以及那些在低CVD风险组中丰富的，包括瘤胃球菌与本文报道的发现类似，Zhang及其同事从Lachnospiraceae家族中确定了某些分类群，这些分类群在2型糖尿病患者中富集，而其他分类群在正常对照中富集。⁴⁰从维氏菌科，属巨单胞菌属和大球星与终身CVD风险相关。巨单胞菌属此前有报道称与2型糖尿病呈负相关。⁴⁰在调整BMI后，我们观察到与终身CVD风险状况存在类似的负相关。这个属类杆菌属白芍科的一个属也与降低终生CVD风险有关，这与Fu及其同事报告的该科一个属与BMI呈负相关的结果相似。¹¹此外，该属克里斯滕菌科R-7来自Christensenellaceae家族，之前与CVD风险相关表型无关。需要进一步研究来证实这种关联。

我们发现了变形杆菌门的两个属，地中海螺旋体和肠杆菌，是真古宙门的一个，甲烷重整器，与当前研究中终身CVD风险增加相关。这些发现与在人类和小鼠研究中与许多心脏代谢特征相关的变形杆菌属的报道一致。^38,41例如，阿尔卡纳尼和他的同事显示，地中海螺旋体与1型糖尿病之间存在负相关³⁸，同时肠杆菌属实验表明，在小鼠模型中增加肥胖风险。⁴¹ 甲烷重整器是目前研究中评估的古生菌领域中唯一的一个属，之前也被认为影响心血管疾病风险，主要是通过其与肥胖的关联。^36,42研究人员推测，该分类单元可能通过其在增加多糖发酵导致肥胖增加中的作用而增加肥胖风险，并在动物模型中找到了支持。⁴²目前的研究发现甲烷杆菌与低风险参与者相比，具有高终身心血管疾病风险特征的参与者。虽然这些发现与BMI无关，但在分析中考虑饮食时，关联性完全减弱。这些数据表明地中海螺旋体，肠杆菌，和甲烷杆菌可能会被饮食因素搞糊涂。据作者所知，这是第一次在分析中调整饮食因素的研究。

目前的研究有几个重要优势。纵向BHS设计提供了一个独特的机会来检查微生物群与CVD风险因素的终生负担之间的关系。使用仔细收集的收缩压、低密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖测量值，从大约33年的随访中平均进行了9次研究访问，以评估CVD风险状况。此外，使用严格的方案收集粪便样本，按照人类微生物组项目规定的指南进行测序和下游分析。²¹然而，还应解决某些限制。这项研究是在一个相对较小的BHS参与者子样本中进行的。样本量小可能限制了我们检测其他重要微生物群的统计能力，并可能是阿尔法多样性测量与心血管疾病风险之间适度显著关联的原因。此外，由于粪便样本的采集发生在确定终身CVD风险状况之后，因此不可能描述所观察到的微生物群与终身CVD危险相关性之间的时间关系。鉴于这些发现的暂时性，有必要在独立样本中复制结果。此外，还需要进行前瞻性研究，以确认确认的微生物群的存在是否先于CVD风险状况的改变。最后，16S rRNA测序通常不能提供超出属水平的测序分辨率，也不能进行直接的功能分析。因此，目前的研究在识别可能影响CVD风险的特定微生物种类和生物途径方面能力有限。未来的研究，利用鸟枪基因组DNA测序，可以为这一领域提供重要信息。

总之，目前的研究确定了总体微生物群组成和六个微生物类群与终身CVD风险预测的一致关联。与那些终身负担较低的人群相比，终身负担较高的心血管疾病风险因素人群的微生物丰富度下降。已确定的属包括那些具有不同影响的属，其中一些在具有高终生CVD风险的参与者中富集，另一些则贫化，来自拟杆菌门和厚壁菌门。这些横截面数据进一步证明微生物群可能在心血管疾病风险中发挥重要作用。然而，还需要进一步研究微生物组与CVD健康的前瞻性关系。

补充材料

致谢

非标准缩略语和缩写

脚注

工具书类