血管僵硬机制激活YAP/TAZ依赖性谷氨酸分解驱动肺动脉高压

ECM硬度依赖于YAP/TAZ来控制新陈代谢。

鉴于我们先前的研究结果，YAP和TAZ在肺血管细胞中起机械传感器的作用(1)，我们研究了它们在调节ECM硬化对代谢重编程的影响方面是否重要。在刚性基体中的PAEC中，击倒YAP/TAZ(图2A)细胞外乳酸和乳酸/丙酮酸比率降低(图2，B–D、和补充图2)反映其对糖酵解的控制。YAP/TAZ敲除还减弱了僵硬ECM对细胞内谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的影响(图2C). 在刚性基质中YAP/TAZ击倒期间，线粒体膜电位也保持不变(图2E). 相反，在软基质中生长的PAEC中，YAP（pYAP）的稳定表达(图2F)细胞外乳酸和乳酸/丙酮酸比率增加(图2，G–I); 谷氨酰胺减少，谷氨酸和天冬氨酸增加(图2H); 从而降低线粒体膜电位(图2J). 值得注意的是，PAMC中的YAP/TAZ激活了PAEC中由刚性ECM机械控制的糖酵解和谷氨酸解的相同途径(补充图2)。

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图2

ECM硬化引起的代谢转换与YAP/TAZ的机械活化相协调。

(A类)免疫印迹分析证实PAEC中2个独立的siRNA序列敲除了YAP和TAZ。(B类——E类)PAEC在软基质或硬基质中培养。在硬基质中释放的乳酸增加，但这种增加被YAP/TAZ的siRNA敲除所减弱(B类). 在刚性基质中，YAP/TAZ基因敲除也减弱了特定代谢物的变化，反映了回补(C类)和由乳酸/丙酮酸盐比率反映的糖酵解活性(D类). MitoTracker标记证实YAP/TAZ敲除逆转了刚性基质引起的线粒体膜电位的改变(E类). (F类)免疫印迹分析证实，与感染对照载体（pGFP）的细胞相比，感染含有YAP编码序列的慢病毒载体（pYAP）的PAEC中YAP的强制表达。(G公司)在软基质培养的PAEC中，与对照载体（pGFP）相比，YAP（pYAP）的强制表达增加了乳酸。(H（H）和我)在同样处理的PAEC中，YAP降低了谷氨酰胺、丙酮酸和琥珀酸，增加了谷氨酸和天冬氨酸(H（H）)乳酸/丙酮酸比率增加(我). (J型)MitoTracker标记证实，软基质中的YAP（pYAP）改变了PAEC线粒体膜电位。在所有面板中，对照组（si-NC，培养在软基质上的pGFP）的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。数据表示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）<0.001），至少进行三次独立实验。配对样本由双尾学生的t吨测试，而单因素方差分析和事后Tukey检验用于组间比较。比例尺：20μm。另请参见补充图2（在PASMC中也发现了类似的结果）。

通过对负责糖酵解和谷氨酸解的关键代谢酶（LDHA、GLS1和PC）的启动子区域的序列分析，揭示了YAP/TAZ复合物的几个假定结合位点（TEAD位点）(图3A). ChIP–定量PCR证明每个基因至少有1个位点上的YAP直接结合(图3B). 相应地，PAEC中YAP/TAZ的siRNA敲除(图3，C–E)和PASMC(补充图2)靶基因表达减少，而软基质中PAEC中强制表达YAP增加了其水平(图3，F–H). 值得注意的是，只有同时敲除YAP和TAZ，而不仅仅是YAP或TAZ，才足以降低目标基因的表达(补充图2). 总之，YAP和TAZ是ECM僵硬引发的机械触发、糖酵解和谷氨酸分解代谢重编程事件的组成部分。

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图3

YAP和TAZ控制关键代谢酶的转录。

(A类)序列分析预测了TEAD结合位点（标记为A–D）在GLS1型,LDHA公司、和个人计算机. (B类)ChIP-qPCR证实了TEAD/YAP结合位点在GLS1级,LDHA公司、和个人计算机启动子区域。CTGF公司是一个已知的YAP靶点，用作阳性对照。结果以抗YAP或抗IgG对照免疫沉淀前总输入DNA的百分比表示。(C类——E类)RT-qPCR(C类)伴有免疫印迹(D类)和密度测定(E类)揭示了在刚性基质中的PAEC中增加的GLS1、LDHA和PC表达被YAP/TAZ敲低所钝化。(F类——H（H）)RT-qPCR(F类)免疫印迹和密度测定(G公司和H（H）)显示YAP（pYAP）增加GLS1级,LDHA公司、和个人计算机软基质中PAEC的表达。在所有面板中，对照组（si-NC，培养在软基质上的pGFP）的平均表达被指定为1倍的变化，并与相关样本进行了比较。数据表示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）<0.001），至少进行三次独立实验。配对样本由双尾学生的t吨测试，而单因素方差分析和事后Tukey检验用于组间比较。另请参见补充图2（在PASMC中也发现了类似的结果）。

增加GLS1表达和谷氨酰胺分解对于在僵硬环境中维持糖酵解和细胞增殖至关重要。

为了确定GLS1对僵硬诱导的和YAP/TAZ依赖的谷氨酰胺水解是否至关重要，PAEC在软基质或硬基质中培养，并暴露于GLS1-BPTES两种亚型的已知药物抑制剂[双-2-（5-苯乙酰胺-1,3,4-噻二唑-2-基）乙基硫化物](17)，DON（6-重氮-5-氧代-我-去甲亮氨酸）(18)，C968（谷氨酰胺酶抑制剂，化合物968）(19) (图4，A–C)或siRNA（si-GLS1；图4，D–G). 如LC-MS/MS所量化的，PAEC中GLS1的抑制减弱了刚度诱导的谷氨酰胺消耗、谷氨酸生成和天冬氨酸生成过程(图4，A和E). GLS1抑制也会降低僵硬基质中的糖酵解，如细胞外乳酸和乳酸/丙酮酸比率降低所示(图4、B、C、F和G). 当PASMCs中GLS1被抑制时，观察到类似的代谢活性变化(补充图3，A–F)。

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图4

GLS1的药理或基因抑制减弱了硬基质中谷氨酸分解的上调。

(A类——C类)在PAEC中，靶向LC-MS/MS显示，GLS1的药理学抑制（BPTES或DON）减弱了硬基质中代谢物表达的改变。具体而言，与硬基质对照（si-NC-hardt）相比，GLS1的抑制增加了谷氨酰胺、丙酮酸盐和琥珀酸盐，降低了谷氨酸和天冬氨酸(A类)，并降低了细胞外乳酸(B类)以及乳酸/丙酮酸比率(C类). (D类)免疫印迹分析证实GLS1被2个独立的siRNA序列击倒。(E类——G公司)在PAEC中，GLS1敲除减弱了僵硬基质中代谢物表达的改变，增加了谷氨酰胺、丙酮酸和琥珀酸；降低谷氨酸和天冬氨酸(E类); 降低细胞外乳酸和乳酸/丙酮酸比率(F类和G公司). 在所有面板中，对照组（载体，培养在软基质上的si-NC）的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行了比较。数据表示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）<0.001），至少进行三次独立实验。单因素方差分析和事后Tukey检验用于组比较。

识别GLS1调控的下游分子过程、表达阵列分析和途径富集(20)在硬基质上暴露于si-GLS1的PAEC中，发现了多条通路的系统性重新编程，显著下调了控制增殖能力的细胞周期基因和控制细胞迁移的细胞外基质组织相关因子(图5A,补充图4，A和B、和补充表1). 根据细胞计数评估(图5、B、C、F和G)，BrdU脉冲(图5、D和H)，caspase-3/7活性(补充图4C)和增殖细胞核抗原（PCNA）/裂解caspase-3双重染色(补充图4、D和E)GLS1抑制对软基质中的细胞凋亡和增殖几乎没有影响，但对硬基质中的增殖有抑制作用。此外，与影响基质组织的转录组结果相对应(图5A和补充图4A)，GLS1抑制，通过siRNA实现(图5E)或药理学手段(图5I)，抑制细胞迁移。在PASMC中观察到类似的效果(补充图3、G和H)。

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图5

抑制GLS1可减少谷氨酰胺水解，以维持细胞在刚性基质中的增殖。

(A类)软基质或硬基质培养PAEC的转录组学分析（heatmap）(n个=3/组）显示与ECM组织和增殖（细胞周期）相关的基因发生程序性改变。值得注意的是，这些变化被GLS1敲除刚性基质而减弱(B类——D类)GLS1基因敲除抑制PAEC在Stift细胞上的增殖(C类)，但不柔软(B类)，矩阵，如细胞计数所示(B类和C类)和BrdU脉冲实验(D类). (E类)通过划痕试验评估，GLS1敲低也抑制了PAEC的迁移。(F类——我)类似地，GLS的药物抑制抑制了PAEC在僵硬组织中的增殖(G公司)，但不柔软(F类)，矩阵(F类——H（H）)并抑制PAEC迁移(我). 在所有面板中，对照组（si-NC或培养在软基质上的载体）的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行了比较。数据表示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）<0.001），至少进行三次独立实验。配对样本由双尾学生的t吨检验，而单因素方差分析和事后Tukey检验用于组比较。比例尺：200μm。另请参见补充图3和4。

为了研究谷氨酸和天冬氨酸的补体生成是否对GLS1维持增殖的作用至关重要，在缺乏GLS1或YAP/TAZ的细胞中补充谷氨酸或天冬氨酸酯。与我们的结果一致(图5)和之前的观察(21)根据细胞计数评估，GLS1或YAP/TAZ的siRNA敲低降低了PAEC或PASMC的增殖(图6，A–C、和补充图5)增殖标记PCNA的定量(图6、D和E). 重要的是，在GLS1或YAP/TAZ减少的细胞中(图6，A–E、和补充图5)谷氨酸至少部分恢复了细胞增殖，而补充天冬氨酸则更完全地恢复了细胞的增殖。补充天冬氨酸类似地逆转了GLS1或YAP/TAZ缺陷的PAEC在硬基质上减少的细胞迁移(图6F). 总的来说，这些结果表明GLS1及其通过谷氨酰胺水解控制谷氨酸和天冬氨酸的生成对于代谢重编程以及随后的血管细胞增殖和迁移（针对僵硬基质暴露）至关重要。

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图6

天冬氨酸和谷氨酸的产生对于YAP/TAZ依赖的谷氨酸水解控制硬基质上的增殖至关重要。

(A类)所示为PAEC的代表性显微照片，培养在坚硬的基质上，并暴露在指定的条件下。细胞计数(B类和C类)PCNA荧光标记的定量(D类和E类)发现GLS1或YAP/TAZ的siRNA敲低降低了细胞增殖。即使GLS1或YAP/TAZ被击倒，谷氨酸和天门冬氨酸的补充在更大程度上也能维持PAEC的增殖。(F类)同样，划痕试验表明，即使在GLS1或YAP/TAZ敲除期间，在硬基质中补充天冬氨酸PAEC也会增加细胞迁移。在所有面板中，对照组（si-NC）的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。数据表示为平均值±SD(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）<0.001），至少进行三次独立实验。P（P）这些值是通过事后Tukey检验从单因素方差分析得出的。比例尺：200μm。另请参见补充图5。

YAP/TAZ–GLS1轴激活暴露于啮齿类动物和人类体内PH血管硬化的PAEC和PASMC的糖酵解和谷氨酰胺解。

在炎症性PAH（野百合碱诱导）的大鼠模型中，我们最近将肺动脉硬化描述为一种早期病理事件，并伴有病变肺动脉中YAP/TAZ表达的增加(1). 在这个野百合碱大鼠模型中(图7和补充图6–8)，我们研究了谷氨酸解是否被激活，并与肺动脉僵硬度、YAP激活和PAH相关。正如我们之前报告的那样(1)苦味酸红染色显示野百合碱暴露大鼠病变肺小动脉中胶原纤维沉积增加(补充图6)并与肺小动脉僵硬度增加相关，如原子力显微镜所示(图7B). 这些变化伴随着PAH的血流动力学表现(补充图7A)。

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图7

野百合碱暴露的PAH大鼠小动脉周围纤维胶原与小动脉僵硬度增加、GLS1、谷氨酸解和天冬氨酸相关。

给大鼠60 mg/kg的溶媒(n个=6）或野百合碱(n个=6）诱导PAH。(A类)3周后，CD31⁺从全肺分离内皮细胞，通过LC-MS/MS、免疫印迹和RT-qPCR进行分析。原子力显微镜。(B类)AFM显示PH肺的肺小动脉硬度增加（直径<100μm，每只大鼠5-9条血管）(n个=4只大鼠）与未治疗组(n个=4只大鼠）；水平线表示中线；符号表示单个肺小动脉的测量值。P（P）值由Mann-Whitney计算U型测试。(C类——E类)多环芳烃CD31⁺细胞谷氨酰胺含量下降(C类)天门冬氨酸逆向增加(D类). 这与乳酸/丙酮酸比率增加有关(E类). (F类)多环芳烃CD31的RT-qPCR⁺细胞显示增加甘氨酸表达式。(G公司和H（H）)免疫印迹分析(G公司)和密度测定(H（H）)CD31中GLS1、LDHA和PC增加⁺多环芳烃大鼠肺细胞(n个=每组3只大鼠）。(我和J型)共免疫荧光显微镜显示YAP1/GLS1增加(我)和YAP1/PCNA(J型)病变肺小动脉中的双阳性细胞。在所有面板中，对照组的平均表达被分配为1的倍数变化，并与相关样本进行比较。数据表示为平均值±标准差(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）< 0.001). 在所有面板中，除了B类,P（P）值来自双尾学生t吨测试。比例尺：50μm。另请参见补充图6–8。

来自这些大鼠的CD31⁺暴露于载体或野百合碱3周后，从肺部分离出内皮细胞(图7A)，代谢物通过LC-MS/MS定量(图7，C–E、和补充图6，C–F). 与我们对生长在坚硬基质上的培养PAEC的无修复观察结果一致(图1)，谷氨酰胺降低(图7C)，天冬氨酸增加(图7D)在PAH CD31中⁺细胞。值得注意的是，在这些细胞中未观察到谷氨酸浓度的显著变化(补充图6C)这可能表明体内肺细胞中谷氨酸的周转增加。琥珀酸盐减少(补充图6F)也观察到，表明TCA循环活性降低，乳酸/丙酮酸比率糖酵解增加(图7E)当时在场。与此类代谢物变化一致，CD31中GLS1表达显著增加⁺观察到细胞(图7F). 免疫印迹还显示，在两个CD31的蛋白水平上，GLS1、LDHA和PC表达相应增加⁺(图7、G和H)和CD31^——野百合碱大鼠肺细胞(补充图6、H和I). 原位共聚焦免疫荧光显微镜显示GLS1增加(图7I和补充图6G)PC和LDHA染色(补充图6、J和K)在两个CD31中⁺（内皮细胞）和α-SMA⁺病变肺小动脉的（平滑肌）隔室。值得注意的是，GLS1上调(图7I)、LDHA(补充图6J)、和PC(补充图6K)所有这些都与YAP核定位的增加和由此引起的PCNA的上调有关⁺或Ki-67⁺病变肺小动脉中的增殖细胞(图7J和补充图7，A和B)。

为了确定疾病进展过程中这些事件的精确动力学，我们在野百合碱诱导的大鼠PH的不同阶段进行了原位共聚焦免疫荧光显微镜检查(补充图7). 与以往PH中内皮细胞凋亡的理论一致(22)，我们发现早期但暂时的内皮细胞凋亡诱导，这反映在切割的caspase-3原位染色和caspase-3/7活性（野百合碱注射后0-3天）(补充图7，C–E). 随后细胞凋亡减少，平滑肌和内皮细胞增殖增加(补充图7，A和B)与血管GLS1表达的剪接亚型（KGA和GAC）增加相关(补充图8，A–C). 综上所述，这些结果与我们的体外研究结果一致，表明在血管损伤后，在内皮细胞凋亡的早期阶段，肺血管僵硬和谷氨酰胺分解的发展与体内病变内皮细胞和平滑肌细胞增殖的增加遵循相同的动力学。

因此，我们想确定谷氨酰胺水解重编程是否是人类PAH中维持肺血管细胞增殖的一个活跃过程。我们研究了一组PAH患者(n个=13）源于从特发性和遗传性病因到硬皮病的病因(补充表2)与非PAH受试者相比(n个=6）死于外伤或无关原因(1). PAH患者动脉周围胶原重构增加(图8A)，GLS1同时上调(图8、B和C)PC和LDHA(补充图9，A和B)在CD31中观察到⁺（内皮细胞）和α-SMA⁺（平滑肌）细胞(图8B). 与PAH大鼠一样(补充图8)GLS1的两种亚型（KGA和GAC）均增加(补充图9、C和D). GLS1与YAP核定位同时增加(图8C)和YAP核定位与PCNA增加相关⁺或Ki-67⁺增殖血管细胞(图8D和补充图9E). 在丛状病变中也有类似的观察结果(补充图10、A和B)-持续观察到活跃增殖和静止凋亡的晚期血管病变(补充图10C). 重要的是，这些代谢酶的变化与循环血浆中的代谢物谱相关，这是通过LC-MS/MS在PH患者的主肺动脉样本中进行评估的（平均肺动脉压[mPAP]≥25 mmHg；患者人口统计信息补充表3). 在肺动脉压特别高（平均肺动脉压>45 mmHg）的受试者中，乳酸/丙酮酸比率升高，反映出糖酵解增加，而谷氨酰胺/谷氨酸比率降低，天门冬氨酸增加，表明谷氨酰胺水解和回补上调，与非PH患者相比（mPAP<25 mmHg；图8，E–G). 总之，这些结果支持了血管硬化激活YAP/TAZ的概念，以便在啮齿动物和人类体内的疾病实例中诱导PAH中的谷氨酸分解代谢开关和血管增殖。

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图8

在多种形式的人类PAH中，小动脉周围原纤维胶原与GLS1、谷氨酸分解和天冬氨酸增加相关。

(A类)人多环芳烃的苦味酸红染色(n个=13）与非PAH肺(n个=6），小于-100-μm血管（每个患者5条血管）的量化证实了PAH中胶原沉积和胶原纤维聚集增加。(B类)人体PAH组织中(n个=13），共免疫荧光显微镜和定量分析也证实了α-SMA中GLS1的增加⁺和vWF⁺病变肺小动脉中的细胞与对照组的比较(n个= 6). (C类和D类)协同免疫荧光显微镜显示YAP1/GLS1增加(C类)和YAP1/PCNA(D类)病变肺小动脉（PAH，n个=6，与无PAH相比，n个= 6). (E类——G公司)相关的是，靶向LC-MS/MS显示血浆中乳酸/丙酮酸比率越来越高(E类)谷氨酰胺/谷氨酸比率较低(F类)以及增加天冬氨酸水平(G公司)在所有受试者中，对照组的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。数据表示为平均值±SD(^#P（P）< 0.001). 在A类——D类,P（P）值来自双尾学生t吨测试。在E类——G公司,P（P）这些值是通过事后Tukey检验从单因素方差分析得出的。比例尺：50μm。另请参见补充图9和10。

YAP/TAZ–GLS轴诱导SIV-PAH灵长类动物和HIV-诱导PAH患者的糖酵解和谷氨酰胺分解。

由于多环芳烃的啮齿动物模型不能复制人类疾病的所有方面，我们想确定在不使用直接低氧刺激的情况下，同样的分子轴在更相关的模型生物中是否活跃。此前，在感染SIV的恒河猴中描述了一种非人灵长类动物HIV诱导的PAH模型(23). 重要的是，这种模型复制了PAH的血流动力学和组织学表现。它还显示出不完全外显率，50%至60%的感染猕猴发展为PAH，因此与人类感染HIV的PAH不完全外现率一致(24). 重要的是，与野百合碱暴露大鼠相似(图7)，在一组已证实血液动力学的感染SIV的猕猴中(图9A)和组织学(补充图11A)多环芳烃、苦味酸红染色显示动脉周围原纤维胶原增加(图9B)与非PAH、SIV感染动物相比。SIV-PAH猕猴患病的肺小动脉中GLS1亚型的表达也增加(图9C和补充图11，B–D)PC和LDHA(补充图11、F和G)与YAP核定位增加相关(图9C和补充图11、F和G)，增殖PCNA⁺或Ki-67⁺单元格(图9D和补充图11E)和非凋亡、裂解的caspase-3阴性细胞(补充图11E)。

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图9

在SIV诱导的PAH的灵长类动物中，小动脉周围原纤维胶原沉积与GLS1、谷氨酸分解和天冬氨酸生成增加相关。

(A类——D类)恒河猴感染SIV，并在感染后6个月和10-12个月的过程中与感染前（BI）进行比较。(A类)在22只感染SIV的猕猴中，有13只通过RVSP和组织学重塑评估PAH（参见补充图11A). (B类)Picrosius红染色显示SIV-PAH中小动脉周围纤维胶原沉积增加。(C类和D类)共免疫荧光显微镜显示YAP1/GLS1增加(C类)和YAP1/PCNA(D类)病变肺小动脉中的双阳性细胞。在所有面板中，对照组的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。P（P）这些值是根据单因素方差分析和事后Tukey检验得出的A类，而双尾学生t吨测试用于其他比较(^#P（P）< 0.001). 比例尺：50μm。另请参见补充图11。

最后，根据SIV-PAH猕猴的这些发现，我们想确定患有HIV-PAH的人是否也表现出肺血管僵硬度增加的迹象，以及由此引起的血管糖酵解和谷氨酰胺分解的改变。我们研究了42名接受肺动脉插管的HIV感染者，其中11人被诊断为PAH(补充表4). 对HIV-PAH受试者有创血流动力学数据的分析显示肺动脉顺应性显著降低(图10A)与HIV感染、非PAH患者相比，肺动脉僵硬度增加。重要的是，通过对患有和不患有PAH的HIV感染者的单独队列的外周静脉血浆代谢物进行量化(补充表5)，观察到乳酸盐/丙酮酸盐比率增加(图10B)，表明糖酵解活性增加，而谷氨酰胺/谷氨酸比率降低和天冬氨酸增加与HIV-PAH中谷氨酰胺水解和再补体的上调一致(图10、C和D). 因此，与啮齿动物和其他人类PAH病例的分子发现相一致，HIV-PAH中YAP/TAZ–GLS激活的这些观察结果与肺血管僵硬和代谢失调之间的紧密联系有关。

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图10

在HIV诱导的PAH患者中，肺动脉顺应性与谷氨酸分解和天冬氨酸生成增加呈负相关。

(A类)通过有创性肺动脉插管，在一组记录在案的HIV-PAH患者中观察到肺动脉顺应性降低(n个=11）与单独感染艾滋病毒的患者相比(n个= 31). (B类——D类)相关的是，血浆中的靶向LC-MS/MS显示乳酸盐/丙酮酸盐比率增加(B类)，谷氨酰胺/谷氨酸比率降低(C类)，天冬氨酸增加(D类)在一个独立的HIV-PAH患者队列中(n个=9）与单独感染艾滋病毒的患者相比(n个= 7). 在所有面板中，对照组的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。P（P）值来自双尾学生的t吨测试。

肺血管僵硬度的调节和YAP/TAZ依赖的机械传导调节体内谷氨酸分解和PH表现。

为了确定动脉周围ECM重塑和YAP/TAZ是否在体内调节血管细胞代谢，我们测试了野百合碱大鼠模型中YAP/TAZ-依赖性机械传导的改变是否直接控制谷氨酸分解和PH的发展。首先，使用赖氨酰氧化酶（Lox）的已知药物抑制剂（β-氨基丙腈，BAPN），该酶负责胶原交联和随后的基质硬化，我们确定抑制ECM硬化是否可以阻止野百合碱暴露大鼠的代谢变化和下游PH表现(图11A). 根据原子力显微镜的评估，BAPN治疗降低了肺Lox活性并导致动脉周围ECM硬化(图11、C和D). 与以前的报告一致(25)BAPN治疗后，观察到全身平均动脉压降低的趋势(补充图12E)但对左心室心功能或心率无不良影响(补充图12，A–D). 与我们的体外结果一致，BAPN减少ECM僵硬导致YAP和GLS1表达降低(图12A)，YAP依赖性基因表达(图11E)以及下游GLS活性，如直接酶活性测量所反映(图11F). 原位小动脉染色显示，这种代谢作用进一步降低了血管内皮和平滑肌的增殖(图12A)通过血管重塑和肌肉化测量，改善了PH的血流动力学和组织学表现(图12A)和右心室收缩压（RVSP）(图12B)。

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图11

在体内操纵血管机械传导控制谷氨酸分解。

(A类和B类)野百合碱暴露后，每天给大鼠注射BAPN(n个=8）与车辆(A类；n个=7）或每天腹腔注射单独的维他泊芬(n个=6）与单独的车辆(B类；n个= 6). (C类)BAPN和维替泊芬均降低野百合碱暴露大鼠肺部Lox活性。(D类)原子力显微镜显示经BAPN和椎体蛋白治疗的大鼠肺小动脉（直径<100μm）硬度降低。水平线表示中线；符号表示单个肺动脉测量值。(E类和F类)多环芳烃CD31的RT-qPCR⁺细胞显示2个YAP依赖性靶基因减少，Ctgf公司和气缸61，以及甘氨酸表达式(E类)和GLS活动(F类)在BAPN和维替泊芬治疗的大鼠中。黑色字体在与共用车辆控制进行比较时报告P值；当与单独的车辆控制装置进行比较时，红色或蓝色字体会报告P值。在所有面板中，对照组的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。P（P）数值来自单向方差分析和事后Tukey检验(*P（P）< 0.05,^#P（P）< 0.001). 另请参见补充图12。

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图12

在体内操纵血管机械传导控制肺血管增殖和肺动脉高压。

野百合碱暴露后，每天给大鼠注射BAPN(n个=8）与车辆(A类；n个=7）或每天单独静脉注射维替泊芬(n个=6）与单独车辆(B类；n个= 6). (A类)H&E染色和共免疫荧光显微镜显示血管厚度和肌肉化减少，YAP1减少⁺与溶媒对照组相比，BAPN和verteporfin治疗组大鼠的细胞、GLS1血管强度、CD31/PCNA和α-SMA/PCNA双阳性细胞。(B类和C类)根据RVSP的量化结果，维替泊芬降低了PAH的严重程度(B类)和右心室肥厚（Fulton指数，RV/LV+S）(C类). BAPN治疗也观察到类似的趋势。在所有面板中，对照组的平均表达被指定为1倍变化，并与相关样本进行比较。P（P）数值来自单向方差分析和事后Tukey检验(*P（P）< 0.05,^§P（P）<0.01，^#P（P）< 0.001). 比例尺：50μm。另请参见补充图12。

在一项平行实验中，已知的YAP药物抑制剂维替泊芬(26)以前用于研究体内肿瘤发生中的YAP活性(27)，用于询问注射野百合碱的大鼠中YAP是否对激活血管谷氨酰胺分解和PH也至关重要(图11B). 正如预期的那样，维替泊芬降低了YAP依赖性基因的表达(图11E)对左心室心功能、心率或全身血压无不良影响(补充图12). 因此，维替泊芬以与BAPN相似的方式改善了下游代谢（GLS1表达和GLS活性；图11，E和F)，增殖的(图12A)PH的终末期表现，包括血管重塑/肌肉化、RVSP和右心室重塑的减少（Fulton指数）(图12，A–C). 值得注意的是，维替泊芬还降低了肺小动脉僵硬度(图11D)与我们之前的报告一致，即ECM重塑的YAP依赖性控制(1). 因此，这些数据在体内提供了致病证据，证明ECM硬化依赖于YAP/TAZ特异性机械转导，以诱导肺血管戊二氨解和再生、增殖和PH。

用于依赖于基质硬度的研究的细胞培养试剂。

在基线检查时，培养细胞在37°C的胶原涂层塑料（50μg/ml）中在5%的加湿CO中生长₂大气。在培养井中制备的胶原包被的水凝胶（Matrigen）由包被胶原的丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物产生。使用我们之前描述的标准细胞培养技术，在水凝胶上培养、传代和收获细胞(1). 根据制造商的描述，水凝胶的杨氏（弹性）模量是根据公布的方案确定的(50)，对丙烯酰胺混合物的泊松比假设进行了修改。具体而言，水凝胶在室温下（>24小时）在PBS中完全平衡。将直径小于1 mm的球体（玻璃或碳化物钢）放置在水凝胶表面，并测量压痕深度。为了通过测量该深度来确定杨氏（弹性）模量，应用了赫兹理论并对浮力进行了调整。

靶向LC-MS/MS。

代谢物提取基本上按照描述进行，但进行了微小修改(51). 简言之，代谢物是从培养细胞和CD31中提取的⁺细胞置于干冰上，使用在–80°C下预冷的80%甲醇水溶液。代谢物是在20000下通过离心分离从血浆中提取的克在4°C下保持10分钟。上清液用4体积的100%甲醇在-80°C下预冷4小时，在-80℃下提取。内部标准[¹³C类₄]-2-酮戊二酸盐([¹³C类₄]-2OG）（剑桥同位素实验室）。细胞和血浆提取液中的不溶物质通过20000离心去除克在4°C下保持15分钟。如前所述，通过靶向LC-MS/MS分析上清液(52). 使用ZIC-HILIC固定相（150 mm×2.1 mm×3.5 mm；默克）分离代谢物。使用谷氨酰胺标准溶液优化MS参数。监测的质量转变为87到87（丙酮酸）、115到73+99（琥珀酸）、132到88（天冬氨酸）、145到101（2OG）、145-127（谷氨酰胺）、146-128（谷氨酸）和149-105([¹³C类₄]-2OG）。通过对纯标准品和基质加标标准品的分析，确认了质量转变和保留时间窗口。峰面积由Xcalibur Software（Thermo Fisher Scientific）量化并手动审查。

胞外通量分析。

PAEC（每孔30000个细胞）或PASMC（每孔50000个细胞。在过夜培养以允许附着后，在分析培养基（不含酚红或丙酮酸的DMEM，含有0.5%透析FBS和0.1 mg/ml尿苷，pH 7.4；Seahorse Biosciences）中清洗细胞2次，并在500μl新鲜分析培养基中培养。在XF24或XFe24分析仪（Seahorse Biosciences）上测量耗氧率和细胞外酸化率（糖酵解的替代标记）。根据制造商的方案进行线粒体和糖酵解应激试验。耗氧率和细胞外酸化率归一化为分析完成后测量的细胞计数。

抑制PH大鼠的Lox或YAP。

为了诱导PH，雄性Sprague-Dawley大鼠（10-14周龄）经腹腔注射60 mg/kg野百合碱（Sigma-Aldrich）。1天后，与溶媒对照组相比，大鼠每天腹腔注射25 mg/kg维替泊芬（活性生物化学有限公司）。在平行但单独的大鼠队列中，注射野百合碱后1天，在饮用水中与单独饮用水中施用β-氨基丙腈（BAPN；100 mg/kg/d；Sigma-Aldrich）。在所有队列中，注射野百合碱后第21天（最后一次注射BAPN、维替泊芬或溶媒对照药后1天），在所有队列进行右心导管插入术，然后采集肺组织和CD31⁺如我们所述，用于RNA或蛋白质提取、石蜡包埋或OCT冷冻保存的细胞（Sigma-Aldrich）(1)。

对PH大鼠GLS1的抑制作用。

为了诱导PH，雄性Sprague-Dawley大鼠（10-14周龄）腹腔注射60 mg/kg野百合碱（Sigma-Aldrich）。2天后，与溶媒对照组相比，每天进行连续腹腔注射C968（10 mg/kg；Sigma-Aldrich），在野百合碱注射后7天，每天进行持续腹腔注射CB-839（10 mg/kg/kg；Selleck Chemicals）。在所有队列中，注射野百合碱后第21天，进行右心导管插入术，然后采集肺组织和CD31⁺如我们所述，用于RNA或蛋白质提取、石蜡包埋或OCT冷冻保存的细胞（Sigma-Aldrich）(1)。

人类受试者。

所有研究程序均获得知情同意。对于福尔马林固定石蜡包埋的肺样本，从未使用或废弃的手术样本中采集人体PH样本(补充表2)，其中一些我们之前已经描述过(53); 描述了来自新英格兰器官库的非疾病人类肺样本(53). 对于中所述的血浆采集和分析图8，E–G在美国马萨诸塞州波士顿Brigham and Women’s Hospital进行右心导管插入术，选择了名具有临床意义的呼吸困难患者(补充表3; 参考文献中描述了其中一些人。31). 受试者根据是否存在临床PH值进行分层，定义为平均肺动脉压（mPAP）升高≥25 mmHg。为了测量肺动脉顺应性，42名HIV感染者在匹兹堡大学接受了肺动脉插管。11名患者被诊断为PAH（mPAP≥25 mmHg）(补充表4). 如前所述，根据这些有创血液动力学测量值，通过中风量/脉压计算肺动脉顺应性(54). 最后，对外周血浆进行循环代谢物分析的人类受试者(图10和补充表5)，在UCSF招募了一个单独的HIV感染者队列，其中包括有记录的PAH（通过有创性肺动脉插管进行评估，mPAP≥25 mmHg）或无PAH（通过有创性肺动脉插管评估，mPAP<25 mmHg，或通过无创性超声心动图评估肺动脉收缩压<40 mmHg）。

人体血浆采样。

如我们所述，为了从主肺动脉采集受试者的血液，按照标准方案，在透视引导下通过右颈内静脉途径进行临床指示的右心导管插入术(53). 经透视和血流动力学波形证实，导管被放置在主肺动脉中。从远端端口抽取血液，并用K收集在真空管中⁺-EDTA公司。血液离心后提取血浆，然后在-80°C下保存。正如我们所描述的那样，使用类似的方法收集HIV阳性受试者的静脉外周血浆(55)。

统计。

细胞培养实验至少进行了3次，每个重复至少进行了三次。计算每组动物的数量，以测量实验组和对照组的平均值（80%的幂和10%的SD）之间至少20%的差异。本研究的独特患者样本数量主要由临床可用性决定。以盲法对啮齿动物和人类组织以及小鼠和大鼠的肺血管血流动力学进行原位表达/组织学分析。使用培养细胞进行的体外实验或转录物/miR表达的原位定量表示平均值±SD。使用啮齿动物或人类试剂进行的生理实验的定量表示平均数±SEM。免疫印迹图像是重复至少3次的实验的代表。显微照片是每个相关队列中实验的代表。数据分布的正态性通过Shapiro-Wilk检验确定。配对样本由双尾学生的t吨测试正态分布数据，而Mann-WhitneyU型非正态分布数据采用非参数检验。为了进行组间比较，进行了单因素方差分析和事后Tukey检验。A类P（P）值小于0.05被认为是显著的。

研究批准。

所有动物实验均由哈佛比较医学中心和匹兹堡大学批准。所有涉及人体组织和血浆的使用以及有创和无创血液动力学研究的实验程序都包括相关的书面知情同意书，并得到了Partners Healthcare、Boston Children’s Hospital、UCSF、UCLA和匹兹堡大学的机构审查委员会的批准，以及新英格兰风琴银行。本研究的伦理批准和知情同意符合《赫尔辛基宣言》的标准。

我们感谢L.Fredenburgh的技术建议，感谢M.Jain和J.Snow的批判性手稿建议。作者承认IRCAN的分子和细胞核心成像（PICMI）设施（由le Cancéropole PACA、la Région PACA、le Conseil Départmentale 06、l'INSERM、ARC、IBiSA和Conseil D-partmental 06 de la R egon PACA支持）。这项工作得到了NIH拨款HL096834和HL124021（给S.Y.Chan）的支持；美国心脏协会（10月后奖）、法国国家癌症控制基金会和贝当古-舒勒基金会（致T.贝特罗）；法国国家研究机构（ANR-11-LABX-0028-01）和癌症研究协会（ARC）授予PJA20131200325（给C.Gaggioli和T.Bertero）；NIH授予P01-HL103455（给A.Morris和M.A.Simon）、R56-HL126525（给K.A.Norris）和R01-HL090339（给A.莫里斯）；Gilead Sciences，Inc.（给A.Morris）的拨款；NIH向J.Loscalzo授予HL61795、HL48743、HL108630和GM107618；NIH拨款HL007633和HL128802（给W.M.Oldham）；NIH授予HL121174（给J.Fessel）。