MICOS和Ups2-Mdm35磷脂转运组织线粒体膜脂合成

线粒体PE合成可以独立于体内Ups2进行

我们的体外数据表明，Ups2–Mdm35通过IMS运输PS，以进行依赖于Psd1的PE合成。因此，我们使用[¹⁴C] 丝氨酸被并入PS。PE可以通过不同的细胞代谢途径合成(Birner等人，2001年;图2 A). 因此，我们使用了缺乏Psd2和Dpl1的酵母细胞(psd2型Δdpl1型Δ），非线粒体PE合成中的关键酶。PE的形成完全依赖于Psd1psd2型Δdpl1型无乙醇胺时的Δ细胞(Birner等人，2001年;图2 A). 我们监测了放射性标记PS到PE的Psd1依赖性脱羧反应，以及随后通过ER中的PE甲基化酶转化为PC(图2 B). Ups2损失psd2型Δdpl1型Δ细胞（图中称为ΔΔ）适度损害PE的积累，但不影响其转化为PC(图2、B和C). 这些结果与向上2Δ线粒体(Osman等人，2009年;Tamura等人，2009年)以及Ups2–Mdm35作为体内脂质转移蛋白复合物的功能。然而，这些观察结果表明，依赖于Psd1的PE合成可以独立于Ups2–Mdm35体内的PS转移。

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图2。

PE生物发生可以在没有Ups2的情况下进行。（A） PE/PC生物成因酿酒酵母.粗箭头表示B和图4 A，其中非线粒体PE/PC合成因删除DPL1型和PSD2型培养基中缺乏乙醇胺（Etn）或胆碱（Cho）。红色箭头表示脂质交换。（B） 体内PE/PC合成评估。脉冲标记后[¹⁴C] 丝氨酸，在含有未标记丝氨酸（chase）的培养基中进一步培养，提取脂质并通过TLC和放射自显影术进行分析。ΔΔ,dpl1型Δpsd2型Δ. （C） PS、PE和PC水平被量化，并显示为总脂质的一部分。误差条代表SD。n个= 3.

Psd1可以在并列膜中转换PS

体内Psd1产生的Ups2依赖性PE合成表明，PS可以通过不涉及Ups2–Mdm35跨IMS传递PS的替代途径到达内膜中的Psd1。脂转运蛋白Ups/PRELI家族的其他成员可能至少部分替代Ups2的丢失并保留PS转运。然而，psd2型Δdpl1型缺乏所有Ups样蛋白（Ups1–3）的Δ细胞不是乙醇胺营养缺陷型细胞，这表明在缺乏这些脂质转移蛋白的情况下可以发生依赖于Psd1的PE合成(图S2 A). 另一种情况是，Psd1的IMS催化域(Choi等人，2005年;Horvath等人，2012年)能够使外膜（OM）中的PS脱羧，也就是说，不依赖于PS转移到IM。为了测试这种可能性，我们在体外合成了Psd1，并将其重组为缺乏PS和PE的脂质体(图3 A). Psd1的脱羧酶活性取决于其自催化过程，而自催化过程在催化活性S463突变后被取消(Horvath等人，2012年;Onguka等人，2015年). 我们观察到重组Psd1中有相当一部分的自催化裂解，但Psd1没有^463A型表明脂质体结合的Psd1达到功能状态(图3 B). 携带Psd1或Psd1的蛋白脂质体^463A型与含有PS的脂质体孵育，并通过qMS评估PE的形成(图3 C). Psd1但不是Psd1^463A型反式促进PS脱羧和脂质体中PE的形成(图3 C). 值得注意的是，PE的合成依赖于Psd1，不涉及脂质体之间的PS转移，因为没有发生显著的自发PS转移(图3 C). 此外，未检测到脂质体融合（图S2 B）。我们的结论是，Psd1可以在并列膜中催化PS脱羧并转化为PE，这为在体内不存在Ups2-Mdm35转移PS的情况下Psd1依赖的PE合成提供了可能的理论基础。

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图3。

在反式中，Psd1能够在并列膜上将PS转化为PE。（A） 通过重组Psd1监测反式脱羧反应。（B） 重组Psd1的自催化处理。浮选后含Psd1的部分用HA特异性抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。CBB，考马斯亮蓝。（C） Psd1在并列膜上将PS脱羧为PE。S463A、Psd1^463A型绘制了相同条件下的自发PS转移图以进行比较。给定时间点产生的PE或传输的PS显示为总PS输入的百分比。误差条代表SEM。n个= 3.

MICOS协调线粒体PE代谢

这些结果表明线粒体PE合成可能受OM和IM相对位置的调节。线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）已被确定为线粒体形状和组织的主要调节器(Harner等人，2011年;Hoppins等人，2011年;von der Malsburg等人，2011年;Alkhaja等人，2012年). IM中的异寡聚MICOS复合物与线粒体嵴的维持和形成以及与OM的膜接触有关，支持跨线粒体膜的协调蛋白质移位(Friedman等人，2015;Horvath等人，2015年). 有趣的是，MICOS亚基与心磷脂合成途径表现出强烈的负遗传相互作用(Hoppins等人，2011年)让人想起PE代谢中的成分(Gohil等人，2005年). 因此，我们寻求MICOS可以确保Psd1有效合成PE的可能性。我们删除了PSD2型和DPL1（DPL1）在缺乏所有六种MICOS亚基的酵母细胞中（MICOSΔ；Friedman等人，2015年)废除非线粒体PE合成(图2 A)并使用[¹⁴C] 体内丝氨酸。MICOS的缺失显著降低了依赖于Psd1的PE合成速率，更严重地影响了PE甲基化为PC的速率(图4，A–D). 通过测定累积PE和PC相对于总PS、PC和PE的比例，发现MICOS缺乏细胞中PC合成急剧减少，而PE的相对比例增加(图4 B). 这与向上2Δ电池(图2C)尽管MICOS复合物或Ups2的丢失导致细胞内PE累积绝对量的类似减少（图S2 C）。

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图4。

MICOS协助PE的线粒体合成及其在ER中转化为PC。（A） 标记细胞中PS、PE和PC的合成[¹⁴C] 丝氨酸。ΔΔ,dpl1型Δpsd2型Δ. （B） PS、PE或PC波段中放射性的相对分布表示为图2C。错误条代表SD。n个= 3. （C和D）Psd1-PE和PC的形成依赖于[¹⁴C] PS。显示了缺乏MICOS的细胞中PE（C）和PC（D）的合成速率。通过绘制PE和PC（C）或PC（D）之和的带强度的动力学变化，并确定拟合曲线的斜率（介于t吨=15分钟t吨=90分钟）。ΔΔ的平均值设置为1。误差条代表SEM。n个= 3. *, P<0.05。（E） 非线粒体PE合成的缺失会损害MICOSΔ细胞的生长。在37°C下，在补充有乙醇胺（Etn；10 mM）的含葡萄糖SC培养基（SCD）上评估细胞生长。WT，野生型。（F） 在两个线粒体膜（mTether）之间表达人工系链可抑制缺乏MICOS和非线粒体PE合成的细胞的乙醇胺营养不良。左侧，mTether的示意图；右侧，细胞在37°C的SCD上生长。

与MICOS复合物在线粒体PE代谢中的作用一致，抑制非线粒体PE合成会损害MICOS缺陷细胞在可发酵碳源葡萄糖上的生长(图4 E). 同样，在缺乏Psd2和Dpl1的细胞中，Psd1表现出负的遗传相互作用(图4 E). 在这两种情况下，生长都是通过补充培养基中的乙醇胺来支持的，乙醇胺可以恢复非线粒体PE的合成，这表明PE生物合成不足会导致观察到的生长缺陷(图4 E). Psd1活性不受MICOS亚单位损失的影响（图S2 D），这表明PS传递到Psd1是这些细胞线粒体PE合成的速率限制。总之，我们的数据表明，MICOS复合物调节线粒体PE合成，并促进线粒体衍生PE在内质网中形成PC。因此，我们认为MICOS确保两个线粒体膜紧密并置，从而允许Psd1使OM中的PS脱羧。

为了评估MICOS是否通过外膜和内膜的系留在线粒体PE合成中发挥作用，我们生成了一个嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含IM蛋白Yme2（aa 279–308）的线粒体靶向信号和跨膜结构域，以及OM蛋白Tom70（aa 10–30）的跨膜结构区融合到GFP(图4F). 通过12 aa的连接子连接跨膜结构域。我们在缺乏Psd2和Dpl1的MICOS缺陷细胞中表达着丝粒质粒的嵌合蛋白，这些细胞的生长严格依赖于Psd1的线粒体PE合成或外源乙醇胺的补充(图4 E). 人工系链蛋白以成熟形式积聚在线粒体中，并将GFP结构域暴露在外（图S2、E和F）。栓系蛋白的表达允许MICOS缺陷细胞在没有乙醇胺的情况下生长(图4 F). 因此，在PE代谢中，人工系链至少可以部分替代MICOS，这符合Psd1在PE合成中线粒体膜紧密并置的要求。然而[¹⁴C] 丝氨酸标记实验显示，这些细胞中PE合成仅适度增加，表达系链蛋白的MICOS缺陷细胞的呼吸生长未恢复（图S2 G，未描绘），表明人工膜系链仅替代MICOS作为膜组织复合体的某些功能。

Ups2-Mdm35和SLMO2-TRIAP1复合物的克隆、表达和纯化

将编码带有N末端六组氨酸标签和Mdm35的Ups2的DNA片段克隆到pET-Duet-1载体中。编码半胱氨酸的所有四个密码子通用产品2通过PCR介导的定点突变被编码丝氨酸的密码子取代。蛋白质表达于大肠杆菌Rosetta-gami 2（DE3；Promega）或Suffle T7（新英格兰生物实验室公司）细胞。在37°C培养2 h后，将培养物转移到18°C培养1 h，并通过添加IPTG（0.2 mM）表达Ups2和Mdm35 14 h。根据Ups1–Mdm35复合物的纯化方案纯化Ups2–Mdm35复合物，并进行一些修改(Connerth等人，2012年). 简言之，细胞在缓冲液B（50 mM Tris/HCl，pH 8，250 mM NaCl，1×完全EDTA-无蛋白酶抑制剂混合物[Roche]，1 mM PMSF和20 mM咪唑）中溶解。裂解液在30000转克20分钟，并使用HisTrap和HiLoad 16/60 Superdex-75pg柱（GE Healthcare）对上清液进行柱色谱。在洗脱组分中测定NBD-PS转移活性。将含有最高PS转移活性的组分合并、浓缩、透析至缓冲液C（10 mM Tris/HCl、pH 7.4和150 mM NaCl），并储存在−80°C下。

从cDNA中扩增出编码人类SLMO2的N末端六组氨酸标签和TRIAP1的DNA片段，并克隆到pET-Duet-1载体中。如前所述，SLMO2和TRIAP1在无细胞裂解液中表达(Schwarz等人，2007年)在没有洗涤剂和还原剂的情况下。裂解液在16100转克持续20分钟，将上清液（60µl）与540µl缓冲液B和20µl 50%Ni-Sepharose HP珠浆混合（GE Healthcare）。在4°C下培养1.5 h后，用含有咪唑（40 mM）的缓冲液B清洗珠子，用含有300 mM咪唑（100µl）的缓冲溶液B洗脱结合蛋白复合物。

体内PE/PC合成的评估

酵母细胞在添加2%半乳糖的YP培养基中培养。隔夜培养物在不含肌醇的SC培养基中稀释，补充2%半乳糖（SC-gal），OD 0.4，并在30°C下培养至OD 1-2。对数生长的细胞被脉冲标记为[¹⁴C] 丝氨酸（5µCi/ml）在缺乏肌醇和丝氨酸的SC-gal培养基中在30°C下保持15分钟。收集、清洗细胞，并将其重新悬浮在含有未标记丝氨酸的培养基中。在30°C下进一步培养后，使用氯仿/甲醇（2:1[vol/vol]）对样品进行脂质提取，并通过TLC分析脂质（氯仿/醇/25%氨，65:35:5[vol/vol/vol]。对TLC板的自显影进行量化。

重组Psd1

用PCR扩增了一个编码Psd1（氨基酸位置57–500）的DNA片段，该片段包含一个N端七噻啶肽，然后是一个TEV裂解位点和C端HA-肽，并克隆到pET16b中。Psd1变异体在细菌无细胞裂解液中表达，基本上如所述(Schwarz等人，2007年)在5 mM脂质体P（69.25%1,2-二油酰基）存在下-锡-甘油-3-磷酸胆碱[DOPC]、20%四油酰基-CL、10%二油酰基-PG、0.25%NBD-PE和0.5%罗丹明-PE，在缓冲液LP（5 mM Tris-HCl，pH 8.5和10 mM醋酸钾）中重组，但不含洗涤剂和蛋白酶抑制剂。16100离心后克将含有聚集体和蛋白质脂质体的颗粒部分重新悬浮在含有40%蔗糖的缓冲液FB（5 mM Hepes-NaOH，pH 7.4和25 mM NaCl）中20 min，并转移到超离心管中。将1.5毫升30%蔗糖（FB中）、500µl 10%蔗糖（FB中）和175µl FB重叠，并以200000 g离心1.5小时。蛋白质脂质体在30/10%和10/0%界面处积累。收集顶部部分（1 ml），并通过SDS-PAGE分析对成熟Psd1进行定量。为了评估PS脱羧酶活性，在26°C的缓冲液M（20 mM Hepes-NaOH，pH 7.4，92 mM NaCl和2 mM MgCl）中，将含有Psd1（107 nM，脂质浓度设置为20µM）的蛋白质脂质体与脂质体K（180µM；40%DOPC，20%四油酰基CL，40%二油酰基PS，在缓冲液FB中重组）孵育₂). 将反应体积设置为60µl，并在每个时间点对10µl样品进行脂质提取和qMS。为了评估PS的自发转移，在相同条件下将脂质体P与脂质体K（含2.5%17:0PC，填充20%蔗糖）孵育，提取分离的脂质体P中的脂质并用qMS定量。通过17:0 PC和1,2-二醇基评估脂质体的污染和回收率-锡-甘油-3-磷酸甘油，用于标准化数值。在相同条件下，通过监测NBD荧光的失活来评估脂质体融合。

人工膜栓系蛋白的构建

通过同源重组将人工系链克隆到载体YCplac22ADH中。编码线粒体靶向序列的基因粗糙脉孢菌扩增了Atp9（氨基酸位置1-69）、Yme2跨膜序列（氨基酸位置279-308）、Tom70跨膜顺序（氨基酸位置10-30）和yeGFP蛋白，片段间同源性为20 bp。在引物中引入编码Yme2和Tom70序列之间的连接区（例如AAAENLYFQGG）的DNA。酵母细胞通过扩增片段和线性化质粒转化。从SC-TRP板上生长的细胞中分离出质粒，并通过测序进行验证。为了评估人工系绳对MICOS的功能互补性，dpl1型Δpsd2型将YCplac22ADH-mTether构建物转化的ΔMICOSΔ细胞在35°C的SCD平板上生长1d，将平板上的细胞系列稀释液新鲜地放置在SCD平板中，并在37°C孵育2d后监测细胞的生长。

统计分析

误差条表示图图例中所示的SD或SEM。Student’s对两组之间的差异进行了统计分析t吨测试。

细胞分离和线粒体分离

根据标准程序对酵母细胞中的线粒体进行细胞分离和分离(Tatsuta和Langer，2007年). 为了进一步纯化，对粗线粒体进行清洗，将其重新悬浮在缓冲液A中（0.6 M山梨醇和5 mM MES，pH 6.0），并以连续蔗糖梯度（缓冲液A内20–50%[wt/vol]）装载。蔗糖梯度-在10万离心后从梯度的下三分之一处收集纯化线粒体克1小时，并在冷SEM缓冲液中清洗（10 mM MOPS/KOH，pH 7.2，1 mM EDTA，0.25 M蔗糖）。通过SDS-PAGE和Western blotting评估细胞器的分离和线粒体的纯度。

磷脂的qMS

质谱分析基本上按照所述进行(Connerth等人，2012年;Velázquez等人，2016年). 在存在主要磷脂（PC 17:0-14:1、PE 17:0-14:、PI 17:0-14、PS 17:0-14:0、PG 17:0-14:00和PA 17:0-14:3；均来自Avanti极性脂质）和CL（CL混合物I，LM-6003；Avanti Polar Lipids）的内标物的情况下，从分离的纯线粒体或整个酵母细胞中提取脂质。根据Bligh和Dyer的要求进行提取，并进行了修改(Velázquez等人，2016年). 在以下设置下，将脂质溶解在甲醇中的10 mM醋酸铵中，并在配备纳米融合散斑装置（TriVersa NanoMate；Advion）的QTRAP 6500三重四极质谱仪（Sciex）上进行分析：CUR，20；CAD，中等；IHT，90°C；第10页；模式：高质量；步长，0.1 D；凝结时间，0 ms；扫描速度，200 D/s；暂停5毫秒；CEM，2300；同步，LC同步；和扫描模式，Profile（用于QT 6500）；样品输注量为12µl；样品后抽吸的空气体积，1µl；芯片前气隙，启用；抽吸延迟，0s；预穿孔，带芯轴；喷雾感应，启用；温度，12°C；气压，0.4 psi；电离电压，1.15 kV；极性，正极；通风顶部空间，启用；预湿，1×；交付后体积，0.5µl；触点闭合延迟，1s；音量定时延迟，0s；吸入深度，1mm；预穿孔深度，9mm；和输出触点闭合，Rel 1/2.5 s持续时间（对于NanoMate）。四极子Q1和Q3以单位分辨率运行。PC分析在正离子模式下通过扫描米/z（z）184在50 eV的碰撞能量（CE）下。PE、PI、PS、PG、PA和CDP-DAG测量在正离子模式下进行，扫描25、30、20、30、25和40 eV的CE处的中性损耗分别为141、277、185、189、115和403 D。通过扫描肿块的前驱物，在正离子模式下识别CL物种(米/z（z）465.4、467.4、491.4、493.4、495.4、505.5、519.5、521.5、523.5、535.5、547.5、549.5、551.5、573.5、575.5、577.5、579.5、601.5、605.5、607.5、631.5、715.5和771.5 D）对应的DAG-H₂O片段作为40–50 eV CE处的单电荷离子。质谱由LipidView软件1.2版（Sciex）处理，用于脂质的识别和定量。根据内标物和内源性脂质之间的反应差异，对脂质量（pmol）进行校正。CL物种同位素重叠的校正根据Scherer等人（2010年）.

体外脂质结合和转移检测

如前所述，通过脂质体浮选和脂质转移试验进行磷脂结合(Connerth等人，2012年;Miliara等人，2015年). 为了评估脂质结合，将Ups2–Mdm35复合物（5µM）与脂质体（2 mM总脂质，在1µM过滤器上挤压）在20°C的50µl缓冲液F（MES/NaOH，pH 5.5，100 mM NaCl和2 mM EDTA）中孵育10分钟。孵育后，将样品与100µl 60%蔗糖在缓冲液FB中混合，放入超离心管中，并覆盖1.35 ml缓冲液F30（F中30%蔗糖）、1 ml缓冲液F10（F中10%蔗糖）和250µl缓冲液F。在200000℃下离心试管克在1.5h内，从顶部收集四个700µl的组分，用TCA沉淀组分中的蛋白质，用Tris-Tricine SDS-PAGE分析，并用胶体考马斯亮蓝染色。在标准测定中，在25°C下，在120µl缓冲液TA（20 mM Tris/HCl，pH 7.4，100 mM NaCl和1 mM EDTA）中，在Ups2–Mdm35复合物（80 nM）、供体脂质体（12.5µM总脂质）和受体脂质体（50µM总脂质）的存在下监测脂质转移。

分离线粒体中Psd1酶活性的评估

将线粒体重新悬浮在缓冲液B（0.1 M Tris-HCl，pH 7.4，10 mM EDTA和2µM 16:0-06:0 NBD PS[Avanti Polar Lipids，Inc.]）中，使最终浓度达到5 mg/ml，并在25°C下培养。在每个时间点采集一部分样品（相当于200µg线粒体），并进行脂质提取。通过TLC（展开剂：氯仿/甲醇/H）分析脂质₂O/三乙胺30:35:7:35[体积/体积/体积]）。通过荧光成像（Typhoon Trio；GE Healthcare）检测并量化NBD信号。

冷冻和冷冻替代用于超微结构研究

酵母细胞的电子显微镜分析如前所述(Lefebvre-Legendre等人，2005年). 简而言之，将酵母细胞颗粒放置在涂有formvar的铜EM格栅（400目）表面。每个回路很快浸没在预冷的液态丙烷中，并用液氮保持在-180°C。然后将环转移到干燥丙酮中4%四氧化锇的预冷溶液中，在-82°C的1.8-ml聚丙烯小瓶中放置48小时（替代固定），逐渐加热至室温，并在干燥丙酮中洗涤三次。样品在4°C的丙酮中用1%醋酸铀酰在黑色房间中染色1小时。在用干丙酮再次冲洗后，用araldite（环氧树脂，Fluka；Sigma-Aldrich）逐步渗透环。超薄切片与柠檬酸铅进行对比。

我们感谢古德伦·齐默（Gudrun Zimmer）提供的卓越技术支持，以及菲利普·兰普（Philipp Lampe）在无细胞合成方面的支持。

这项工作得到了德国联邦科学院对T.Tatsuta和T.Langer的拨款（LA 918/14-1和TA 1132/2-1）以及欧洲研究委员会对T.Lange的拨款（第233078号公告）的支持。

作者声明没有竞争性的经济利益。