Dlx-2 and glutaminase upregulate epithelial-mesenchymal transition and glycolytic switch

Su Yeon Lee; Hyun Min Jeon; Min Kyung Ju; Eui Kyong Jeong; Cho Hee Kim; Hye Gyeong Park; Song Iy Han; Ho Sung Kang

doi:10.18632/oncotarget.6879

Oncotarget公司。2016年2月16日；7(7): 7925–7939.

2016年1月11日在线发布。数字对象标识：10.18632/目标6879

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PMID：26771232

Dlx-2和谷氨酰胺酶上调上皮-间质转化和糖酵解开关

李素妍,¹ Hyun Min Jeon先生,¹ Min Kyung Ju女士,¹ 尤金贞（Eui Kyong Jeong）,¹ 金卓熙,^1,^* 惠庆园,² 宋爱翰,^三和何松康¹

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摘要

大多数癌细胞依靠葡萄糖和谷氨酰胺（Gln）代谢增强来生长和生存。致癌代谢为核苷酸、脂质和氨基酸提供生物合成前体；然而，其在肿瘤进展中的具体作用尚不清楚。我们之前的研究表明，参与胚胎和肿瘤发育的同源域转录因子无远端同源盒-2（Dlx-2）通过诱导蜗牛表达诱导糖酵解转换和上皮-间充质转化（EMT）。在这里，我们发现Dlx-2还诱导关键的谷氨酰胺代谢酶谷氨酰胺酶（GLS1）的表达，该酶将谷氨酰胺转化为谷氨酸。TGF-β和Wnt以Dlx-2依赖方式诱导GLS1表达。GLS1 shRNA（shGLS1）被抑制体内肿瘤转移和生长。shGLS1、Gln剥夺和Gln代谢抑制剂（DON、968和BPTES）对Gln代谢的抑制阻止了Dlx-2-、TGF-β-、Wnt-和Snail诱导的EMT和糖酵解转换。最后，shDlx-2和Gln代谢抑制通过p53依赖性上调蜗牛靶向microRNA降低蜗牛mRNA水平。这些结果表明，Dlx-2/GLS1/Gln代谢轴是TGF-β/Wnt诱导的蜗牛依赖性EMT、转移和糖酵解转换的重要调节因子。

关键词：Dlx-2、GLS1、蜗牛、上皮-间质转化、糖酵解开关

简介

与正常细胞相比，癌细胞的代谢变化支持更高的细胞增殖和生长速率[1–8]. 大多数癌细胞依赖糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化来生成ATP，即使在有氧的情况下也是如此；因此，它们表现出葡萄糖（Glc）摄取和乳酸（Lac）生成增加[1–三]. 这种现象被称为“Warburg效应”或糖酵解开关，被认为可以增加癌细胞增殖所需核苷酸、脂质和氨基酸的生物合成前体的可用性。谷氨酰胺（Gln）代谢在许多癌症中也得到增强[1,2,4–8]. 甘氨酸代谢补充了TCA循环中间产物（回补），这些中间产物从线粒体中移除，参与脂质、核酸和蛋白质的生物合成反应（回补[9–11]. 因此，甘氨酸补体对维持癌细胞的生长和发育至关重要。谷氨酰胺酶（GLS）将谷氨酸转化为谷氨酸，是谷氨酸回复的第一种酶[10,11]. 哺乳动物细胞中存在两种GLS：肾型GLS1和肝型GLS2。GLS1在癌症的发展和进展中很重要[12–17]与正常组织相比，在许多肿瘤中，包括乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌（HCC）组织中，其水平升高[17,18]. GLS1 shRNA（shGLS1）和GLS特异性抑制剂双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,3,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）和968可减少异种移植模型中几种癌症的生长[10,14,17].

上皮-间充质转化（EMT）对于转移的启动至关重要，而转移是癌症患者最常见的死亡原因[19–23]. EMT涉及深刻的表型变化，包括上皮蛋白（如E-cadherin）水平降低后上皮细胞极性的丧失，以及间充质蛋白（如vimentin）水平的增加，后者上调间充质迁移和侵袭[19,22]. EMT有助于化疗耐药和肿瘤干细胞样表型。蜗牛是EMT中的主要转录因子，在乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌中，通过多种致癌信号通路，包括转化生长因子（TGF）-β和Wnt，触发转移[24–28]. 最近研究表明，蜗牛可以诱导糖酵解转换，抑制线粒体呼吸和细胞色素c氧化酶活性[29]，并抑制果糖-1,6-二磷酸酶的表达[30]. 因此，Glc代谢可能调节EMT的诱导。

最近，我们发现了一种与胚胎相关的同源域转录因子，即无远端同源盒-2（Dlx-2）[31,32]和肿瘤发展[33–36]，通过增加蜗牛表达诱导EMT和糖酵解开关[37]. 由于Dlx-2通过蜗牛诱导诱导糖酵解转换，我们推测Dlx-2可能激活其他致癌代谢途径。我们检测了Dlx-2对GLS1表达和Gln代谢的影响。我们还研究了GLS1击倒对体内肿瘤转移和生长。为了确定GLS1和Gln代谢是否影响TGF-β/Wnt/Dlx-2/蜗牛诱导的EMT和糖酵解开关，我们检测了蜗牛靶向微RNA（miRNAs）的p53依赖性调节和蜗牛mRNA的稳定性。最后，我们测量了人类癌症组织中Dlx-2、GLS1、蜗牛和蜗牛靶向miRNA的水平。这些实验阐明了Dlx-2/GLS1轴在TGF-β/Wnt诱导的蜗牛依赖性EMT、转移和糖酵解转换中的作用。

结果

GLS1由Dlx-2诱导

因为Dlx-2通过诱导蜗牛表达诱导糖酵解转换[37]，我们假设Dlx-2可能激活其他致癌代谢途径。

MCF-7细胞是非侵袭性管腔A型乳腺癌细胞[38]. Dlx-2和蜗牛在MCF-7细胞中诱导EMT和糖酵解开关[29,30,37]. MCF-7细胞中Dlx-2mRNA水平低于HCT116、HepG2和HeLa细胞；MCF-7、MDA-MB231和A549细胞具有相似的Dlx-2 mRNA水平。在正常条件下，不同细胞系中的Dlx-2 mRNA水平与HCT116细胞（用作参考细胞系）中的水平相比如下：MCF-7中的0.446倍，MDA-MB231中的0.351倍，A549中的0.322倍，HepG2中的1.389倍，HeLa中的1.144倍。

我们使用cDNA微阵列技术（安捷伦人类基因组8x60K阵列，安捷伦技术，CA）和MCF-7细胞检测了Dlx-2的潜在代谢相关靶基因。在该芯片上检测的约42400个基因中，Dlx-2上调了几种代谢酶，包括GLS1、PFKFB2、H6PD和ACACB。这些酶分别参与Gln代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和脂肪酸/胆固醇合成，表明Dlx-2可能激活几种致癌代谢途径（微阵列数据集可在GSE61009中获得）。Dlx-2导致GLS1上调2倍（图（图1A），1安培)，而不影响其他Gln代谢酶的表达，包括GLS2、GLUD1、GOT1/2和ME1（数据未显示）。

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图1

TGF-β和Wnt3a通过激活Dlx-2诱导GLS1表达

A至C。用Dlx-2转染MCF-7细胞。通过微阵列分析检测细胞基因转录的变化（A）。图中显示了与Mock相比，表达中的折叠增加。使用指定的引物和抗体，通过实时qrtPCR（B）和免疫印迹（C）分析细胞**第页<0.01与模拟。D。用实时qrtPCR检测转染Dlx-2和shSnail的MCF-7细胞GLS1的表达**第页<0.01与模拟。E。人体示意图GLS1级启动子区域如左图所示，预测的4个Dlx-2结合位点用黑框表示，编号为D1、D2、D3和D4。使用分别包含GLS1启动子中D1/D2、D3或D4结合位点的引物#1、#2或#3扩增富含ChIP的DNA。用Dlx-2转染MCF-7细胞，并使用ChIP分析进行分析（右侧面板）。F、 G。通过实时定量PCR（F）和免疫印迹（G）检测转染shDlx-2或shSnail后再经TGF-β处理的MCF-7细胞GLS1的表达**第页<0.01与未治疗相比，^##第页与shCon相比<0.01。H。用TGF-β处理MCF-7细胞并用ChIP分析。一、 J。用Smad 2/3/4的shRNA转染MCF-7细胞，然后用TGF-β处理。然后通过实时qrtPCR（I）和免疫印迹（J）分析细胞GLS1的表达**第页<0.01与未治疗相比，^##第页与shCon相比<0.01。K、 L。用实时定量PCR（K）和免疫印迹（L）分析shDlx-2或shSnail转染MCF-7细胞并经Wnt3a-CM处理后GLS1的表达**第页<0.01与未治疗相比，^##第页与shCon相比<0.01。M。使用Wnt3a CM处理MCF-7细胞，并使用ChIP分析进行分析。N、 O。用β-连环蛋白、TCF4和Axin1/2的shRNA转染MCF-7细胞，然后用Wnt3a CM处理。然后通过实时qrtPCR（N）和免疫印迹（O）分析细胞的GLS1表达**第页<0.01与未治疗相比，^##第页与shCon相比<0.01。所有误差条代表SE。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。

除了Glc代谢外，大多数癌细胞还依赖增强的Gln代谢来促进生长和生存[2,4–8]. GLS1，将谷氨酸转化为谷氨酸[10,11]是参与Gln修复的第一种酶。由于其对Gln修复的重要性，我们关注Dlx-2诱导的GLS1 mRNA水平的变化，尽管它们在微阵列数据中只增加了2倍。

实时定量逆转录聚合酶链式反应（实时qrtPCR，图图1B）1B年)和免疫印迹（图（图1C）1摄氏度)确认微阵列数据；Dlx-2过度表达增加了GLS1 mRNA和蛋白质水平。因为蜗牛作用于Dlx-2下游，我们研究了shSnail对Dlx-2-诱导的GLS1表达的影响。shSnail没有抑制Dlx-2诱导的GLS1表达（图（图1D），一维)表明Dlx-2独立于蜗牛诱导GLS1表达。此外，蜗牛过表达对GLS1表达没有影响（数据未显示）。

我们使用ChIP分析进一步研究了Dlx-2水平对GLS1表达的影响。Dlx-2同源结构域结合含有TAAT核心基序的DNA元件[31,32]. 在GLS1启动子中发现了四个推测的Dlx-2结合位点（图（图1E）。1E级). ChIP分析显示Dlx-2与GLS1启动子结合（图（图1E），1E级)提示Dlx-2可能直接诱导GLS1表达。

因为Dlx-2是由TGF-β和Wnt诱导的[34,37]，我们进一步研究TGF-β和Wnt3a是否诱导GLS1表达。TGF-β和Wnt3a诱导GLS1表达（图1层至1层). shDlx-2（而不是shSnail）降低了TGF-β和Wnt3a诱导的GLS1表达（图1F、1G、1K和1L)表明TGF-β和Wnt3a以Dlx-2依赖和蜗牛依赖的方式诱导GLS1表达。ChIP分析表明TGF-β和Wnt3a增加了GLS1启动子处的Dlx-2结合（图1H和1M). TGF-β诱导的GLS1表达也被TGF-α信号通路Smad组分的敲除所阻止（图1I和1J). shβ-catenin、shTCF4和shAxin1/2也抑制Wnt3a诱导的GLS1表达（图1N和1O).

shGLS1抑制体内肿瘤生长和转移

因为shGLS1和GLS抑制剂会减少几种类型的癌细胞异种移植的生长[10,14,17]，我们检查了体内shGLS1对肿瘤生长和转移的影响。将稳定转染shCon或shGLS1的HCT116细胞皮下注射到裸鼠背部，然后监测肿瘤生长。在整个实验过程中，与shCon相比，shGLS1降低了肿瘤生长（图2A–2D). 注射后28天，相对于shCon，shGLS1使肿瘤体积减少了30%，重量减少了64%（图2A–2摄氏度).

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图2

shGLS1抑制肿瘤生长和转移

资产负债表。将稳定转染shCon或shGLS1的HCT116细胞皮下注射到裸鼠背部(n个= 4-5). 显示了代表性小鼠的肿瘤生长曲线（A）和照片、肿瘤（B）、肿瘤重量（C）和H&E染色（D）*第页< 0.05; **第页与shCon相比<0.01。E-G.公司。1 × 10⁶将稳定转染shCon或shGLS1的HCT116细胞注入裸鼠尾静脉(n个= 3-5). 代表性肺部的照片（E）和肺切片的H&E染色如图（F）所示。转移结节数（G）**第页与shCon相比<0.01。所有误差条代表SE。所有比例尺代表100μm。

转移是癌症患者最常见的死亡原因[20,21,23]. 因此，我们研究了shGLS1对肺转移的影响体内将稳定转染shCon或shGLS1的HCT116细胞注射到裸鼠的侧尾静脉。注射后48天，取肺评估肿瘤转移情况。shGLS1减少了转移性结节的数量（图2E–2G)以及微转移病灶的数量（图（图2F）。2楼). 注射shCon细胞平均每个肺产生55个转移性结节，注射shGLS1细胞平均每肺产生10个结节（图（图2G）。2G（2G）). 这些结果表明，GLS1水平在体内肿瘤转移和肿瘤生长。

抑制谷氨酰胺代谢可预防EMT

EMT与肿瘤转移密切相关[19–22]. 因此，我们检测了GLS1敲低对MCF-7细胞EMT的影响。shGLS1阻止了Dlx-2诱导的EMT和E-cadherin下调（图3A至3C). 此外，shGLS1阻止TGF-β-和Wnt3a诱导的EMT和E-cadherin下调（图3D–3I). 相反，shGLS2没有抑制Dlx-2-、TGF-β-或Wnt3a诱导的EMT（数据未显示）。

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图3

抑制谷氨酰胺代谢可预防EMT

A至C。用Dlx-2和shGLS1联合转染MCF-7细胞。用相控显微镜（A）分析细胞形态。还使用指示的引物和抗体通过实时qrtPCR（B）和免疫印迹（C）分析细胞**第页<0.01与模拟，^##第页与shCon相比<0.01。D-I型。用shGLS1转染MCF-7细胞，然后用TGF-β（D-F）或Wnt3a-CM（G-I）处理。通过相控显微镜分析细胞形态（D，G），并使用指示的引物和抗体通过实时qrtPCR（E，H）和免疫印迹（F，I）分析细胞**第页<0.01与未治疗相比，^#第页< 0.05;^##第页与shCon相比<0.01。J-L.公司。MCF-7细胞与蜗牛和2种不同的shGLS1构建物（#1和#2）联合转染。用相差显微镜（J）分析细胞形态。使用指定的引物和抗体，通过实时qrtPCR（K）和免疫印迹（L）对细胞进行分析**第页<0.01与模拟，^#第页< 0.05;^##第页与shCon相比<0.01。M、。用shDlx-2转染MCF-7细胞，然后在有无α-KG的情况下用TGF-β处理，并用相控显微镜（M）分析细胞形态。细胞还通过实时qrtPCR分析E-cadherin、GLS1和蜗牛表达（N）**第页<0.01与未治疗相比，^##第页与shCon相比<0.01，^§第页< 0.05;^§§第页在没有α-KG的情况下，与shDlx-2相比<0.01。所有误差条代表SE。所有比例尺代表100μm。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。

然后我们检测了shGLS1对蜗牛过度表达细胞的影响。我们使用了2种不同的GLS1 shRNAs（shGLS1#1和#2），这两种基因都有效降低了GLS1水平。shGLS1s均能阻止蜗牛过度表达的MCF-7细胞中蜗牛诱导的EMT和E-cadherin下调（图3J–3升). 因此，尽管GLS1水平没有因蜗牛过度表达而改变，但蜗牛诱导的EMT被shGLS1抑制。

我们还研究了谷氨酰胺剥夺对EMT的影响。Gln剥夺抑制了Dlx-2诱导的EMT、E-钙粘蛋白下调和波形蛋白上调(补充图1A-C). 此外，Gln剥夺抑制TGF-β诱导的EMT和E-钙粘蛋白下调(补充图1D和1E). Gln剥夺也抑制蜗牛诱导的EMT、E-cadherin下调和vimentin上调(补充图1F-H). 此外，Gln类似物6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸（DON）和两种GLS选择性抑制剂化合物968和BPTES[16]，抑制TGF-β诱导的EMT和E-钙粘蛋白下调(补充图1I-N).

谷氨酸脱氢酶（GLUD1）将谷氨酸转化为谷氨酸，然后转化为α-酮戊二酸（α-KG）[11]. 因此，我们研究了α-KG对Gln代谢抑制后EMT降低的影响。我们使用细胞可渗透的α-KG前体-α-酮戊二酸二甲酯来恢复Gln代谢抑制细胞中的α-KG水平。将细胞暴露于α-KG可阻止Gln剥夺和DON应用后EMT的抑制(补充图1D、1E、1I和1J). 此外，α-KG阻止shDlx-2介导的TGF-β诱导的EMT抑制（图3M和3N)支持Dlx-2通过诱导GLS1表达和Gln代谢诱导EMT。

Gln代谢抑制对HCT116和MDCK细胞EMT的影响相似。shGLS1阻止Dlx-2-、Wnt3a-和蜗牛诱导的HCT116细胞EMT和E-cadherin下调(补充图2A-F). shGLS1还抑制TGF-β和蜗牛诱导的MDCK细胞EMT(补充图2G-J). 因此，抑制Gln代谢不仅可以降低MCF-7细胞的EMT，还可以降低HCT116和MDCK细胞中的EMT。

谷氨酰胺代谢抑制和shDlx-2降低蜗牛mRNA水平

由于Gln代谢抑制可阻止Dlx-2-、TGF-β-、Wnt3a-和蜗牛诱导的EMT，我们研究了Gln代谢对蜗牛表达的影响。shGLS1或Gln剥夺降低了Dlx-2过度表达细胞中蜗牛的表达（图（图3B3B公司和补充图1B). 此外，通过shGLS1、Gln剥夺、DON、968或BPTES抑制Gln代谢也可以阻止TGF-β诱导的蜗牛表达（图3E和3F、和补充图1E、1J、1L和1N). α-KG阻止了Gln代谢抑制（Gln剥夺或DON）后TGF-β诱导的蜗牛表达降低(补充图1E和1J).

shGLS1或Gln剥夺也降低了蜗牛过度表达细胞中蜗牛的表达（图3K和3L、和补充图1G). 在Dlx-2过度表达细胞和TGF-β处理细胞中，由于Gln代谢抑制（shGLS1、Gln剥夺或DON），Dlx-2的表达也降低（图3B、3E和3F、和补充图1B、1E和1J). 此外，shDlx-2抑制TGF-β介导的蜗牛mRNA水平的增加；α-KG阻止shDlx-2对TGF-β诱导的蜗牛mRNA表达的抑制作用（图（图3N3牛).

Gln代谢抑制对HCT116和MDCK细胞中蜗牛表达的影响相似。shGLS1阻止Dlx-2和蜗牛诱导的蜗牛在HCT116细胞中的表达(补充图2B和2F). shGLS1还抑制TGF-β和蜗牛诱导的MDCK细胞蜗牛表达(补充图2H和2J). 因此，除了MCF-7细胞外，Gln代谢抑制还降低了HCT116和MDCK细胞中蜗牛的表达。

虽然Dlx-2和蜗牛的联合转染并不影响蜗牛的表达，但shDlx-1和蜗牛联合转染显著降低了蜗牛的水平(补充图3A)，表明Dlx-2是维持蜗牛mRNA水平所必需的。因此，Gln代谢抑制和shDlx-2一起可能会影响蜗牛mRNA的稳定性。我们通过在存在或不存在Gln的情况下用放线菌素D处理蜗牛转染细胞来检测这种可能性。正如预期的那样，与正常生长介质相比，剥夺谷氨酰胺会显著降低蜗牛mRNA的稳定性(补充图3B). 蜗牛mRNA有半衰期（t_1/2)9.99小时，在完全培养基中_1/2在无谷氨酰胺培养基中培养3.57小时；Gln的缺失加速了蜗牛mRNA的衰退。因此，除了诱导蜗牛基因转录外，Dlx-2还通过刺激Gln代谢上调蜗牛水平，从而提高蜗牛mRNA的稳定性。

Gln代谢抑制和shDlx-2通过p53调节增加蜗牛靶向miRNAs的表达

蜗牛mRNA水平被许多miRNAs抑制，包括miR-23b、miR-29b、miR-30、miR-34、miR-125b、miR148a、miR-153、miR-200、miR-203、miR let-7、miR7、miR-9、miR-128-2、miR-145和miR-204（39；补充参考1-17). 我们检测了Gln代谢抑制是否影响这些蜗牛靶向miRNAs的表达。shGLS1、DON和Gln剥夺增加了miR-23b、miR-29b、miR30、miR-34、miR-125b、miR148a、miR-153、miR-200和miR-203的表达，但不影响miR let-7、miR7、miR-9、miR-128-2、miR-145和miR-204的表达（表（表1）。1). 在Dlx-2敲低细胞中获得了类似的结果（表（表1）。1). α-KG抑制shGLS1、Gln剥夺和shDlx-2对蜗牛靶向miRNAs表达的影响（表（表11).

表1

Gln代谢抑制和shDlx-2对钉螺靶向miRNA的p53依赖性调节

基因	shGLS1型	shGLS1型		shGLS1型		大学教师		甘氨酸（−）	甘氨酸（−）		甘氨酸（−）		shDlx-2型	shDlx-2型		shDlx-2型
基因	3天	α-KG（−）	α-KG（+）	shCon公司	shp53基因	shCon公司	shp53基因	3天	α-KG（−）	α-KG（+）	shCon公司	shp53基因	3天	α-KG（−）	α-千克（+）	shCon公司	shp53基因
miR-23b	2.813^aa公司	2.886^aa公司	1.095^{英国广播公司}	2.923^aa公司	1.084^{英国广播公司}	2.464^aa公司	1.068^{英国广播公司}	2.525^aa公司	2.491^aa公司	0.996^b条	2.508^aa公司	1.093^{英国广播公司}	1.871^aa公司	1.872^aa公司	1.013^{英国广播公司}	1.890^aa公司	1.088^{英国广播公司}
miR-29b型	1.551^aa公司	1.576^aa公司	1.046^b条	1.571^aa公司	1.054^{英国广播公司}	2.037^一	1.055^b条	2.021^aa公司	2.071^aa公司	0.997^b条	1.828^一	1.046^b条	1.562^aa公司	1.610^aa公司	0.981^{英国广播公司}	1.541^aa公司	1.040^{英国广播公司}
miR-30型	2.505^aa公司	2.532^aa公司	0.877^{英国广播公司}	2.548^aa公司	1.018^{英国广播公司}	2.382^一	1.127^b条	2.465^aa公司	2.493^aa公司	0.954^{英国广播公司}	2.414^aa公司	1.058^{英国广播公司}	1.848^aa公司	1.823^aa公司	1.003^b条	1.859^aa公司	1.063^{英国广播公司}
miR-34型	2.156^aa公司	2.135^aa公司	1.004^{英国广播公司}	2.175^aa公司	1.020^{英国广播公司}	2.623^一	1.071^b条	2.464^aa公司	2.448^aa公司	0.937^b条	2.365^aa公司	1.039^{英国广播公司}	1.951^aa公司	1.835^一	0.914^{英国广播公司}	1.918^aa公司	1.003^{英国广播公司}
miR-125b型	3.544^aa公司	3.570^一	1.024^b条	3.656^aa公司	1.081^{英国广播公司}	3.185^一	1.045^b条	3.215^aa公司	3.078^aa公司	1.051^{英国广播公司}	3.324^aa公司	1.053^{英国广播公司}	2.983^aa公司	3.045^aa公司	1.052^{英国广播公司}	2.880^aa公司	1.101^{英国广播公司}
miR-148a型	3.139^aa公司	3.267^aa公司	0.917^b条	3.048^aa公司	1.043^{英国广播公司}	2.874^一	1.073^b条	3.003^aa公司	3.052^aa公司	1.023^{英国广播公司}	2.919^aa公司	1.062^{英国广播公司}	2.356^aa公司	2.438^aa公司	1.018^{英国广播公司}	2.239^aa公司	1.007^{英国广播公司}
miR-153型	3.124^aa公司	3.130^aa公司	1.150^{英国广播公司}	3.218^aa公司	1.080^{英国广播公司}	2.458^一	1.092^b条	2.577^aa公司	2.501^aa公司	1.178^b条	2.770^aa公司	1.108^{英国广播公司}	2.472^aa公司	2.599^aa公司	0.981^{英国广播公司}	2.344^aa公司	1.043^{英国广播公司}
miR-200基因	2.616^aa公司	2.700^aa公司	0.930^{英国广播公司}	2.618^aa公司	1.067^{英国广播公司}	2.261^一	1.070^b条	2.472^aa公司	2.471^aa公司	1.032^{英国广播公司}	2.480^aa公司	1.082^{英国广播公司}	2.183^aa公司	2.318^aa公司	0.993^{英国广播公司}	2.123^aa公司	1.074^{英国广播公司}
miR-203基因	2.257^aa公司	2.363^aa公司	1.167^{英国广播公司}	2.289^aa公司	1.073^{英国广播公司}	2.196^一	1.083^b条	2.376^aa公司	2.312^aa公司	1.078^{英国广播公司}	2.380^aa公司	1.037^{英国广播公司}	2.271^aa公司	2.306^aa公司	1.038^{英国广播公司}	2.223^aa公司	1.044^{英国广播公司}
miR let-7	1.001							1.075	1.016	1.107			0.964
miR-7型	1.230							1.264	1.306	1.386			1.206
miR-9型	0.917							0.899	0.846	0.866			1.064
miR-128-2型	1.275							1.119	1.022	0.981			1.061
miR-145型	0.763							1.051	1.106	0.929			1.066
miR-204型	1.102							1.123	1.069	1.103			1.020

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GLS1，谷氨酰胺酶；DON，6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸；谷氨酰胺；Dlx-2，无远端（Dlx）同源盒2；α-KG，二甲基-α-酮戊二酸；miR，microRNA。

用shGLS1转染MCF-7细胞，在完全培养基或无Gln-培养基中培养，或用shDlx-2转染，然后用α-KG处理或与shp53共转染。用shp53转染MCF-7细胞，然后用DON处理；实时定量PCR分析细胞。

^一第页< 0.05

^aa公司第页与对照组（未经治疗和shCon）相比<0.01。

^b条第页< 0.05

^{英国广播公司}第页与shGLS1、DON、无Gln-培养基或shDlx-2相比，<0.01。

我们还发现TGF-β降低了蜗牛靶向miRNAs的表达(补充图4A). 这些结果表明，除了直接增加蜗牛基因的表达外，TGF-β还通过减少蜗牛靶向miRNAs的表达来上调蜗牛的水平。谷氨酰胺剥夺抑制TGF-β对钉螺靶向miRNA水平的抑制作用(补充图4A). 此外，Dlx-2过表达降低了蜗牛靶向miRNAs的表达(补充图4B). 因此，Dlx-2通过抑制蜗牛靶向miRNA的表达来增加蜗牛的水平；此外，Dlx-2可能通过调节Gln代谢下调蜗牛靶向miRNAs。

肿瘤细胞对Glc和Gln的摄取增强，对营养应激特别敏感。抑癌基因p53对肿瘤细胞的功能进行重新编程以应对营养应激，是低营养水平的主要传感器[40]. 因此，我们研究了p53是否参与蜗牛靶向miRNAs的表达。Gln代谢抑制（shGLS1、DON或Gln剥夺）和shDlx-2增加了p53的表达（图4A–4D)而α-KG抑制shGLS1-和shDlx-2诱导的p53表达（图图4A和4B). TGF-β通过抑制p53的转录和翻译降低p53[41]. 我们发现shDlx-2阻止了TGF-β介导的p53水平下降，但shSnail没有（图4E和4F). 这表明TGF-β通过Dlx-2降低p53。TGF-β也能阻止shDlx-2介导的p53水平升高（图4E和4F).

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图4

shDlx-2或Gln代谢抑制增加p53的表达

A、 B。用实时定量PCR（A）和免疫印迹（B）检测shDlx-2或shGLS1转染的MCF-7细胞经α-KG处理后p53的表达**第页与shCon相比<0.01，^##第页与未经治疗相比，<0.01。C、 D。通过实时qrtPCR（C）和免疫印迹（D）分析用DON处理或在无Gln培养基中培养的MCF-7细胞的p53表达**第页与对照组相比<0.01。E、 F、。通过实时定量PCR（E）和免疫印迹（F）检测转染shDlx-2或shSnail后再经TGF-β处理的MCF-7细胞p53的表达**第页与shCon相比<0.01，^##第页与未经治疗相比，<0.01。G.公司。用相控显微镜分析shDlx-2或shGLS1和shp53共转染MCF-7细胞，然后用TGF-β处理后的细胞形态（左）和圆度（右）。显示沿单元格边缘绘制的边界（白色），以量化圆形。结果（每组54-158个细胞）显示为平均值±SE**第页<0.01与未治疗相比，^##第页<0.01，与含有TGF-β的shCon相比，^§§第页与shDlx-2或带有TGF-β的shGLS1相比，<0.01。H。转染shp53基因的MCF-7细胞，然后在含有TGF-β的完全或无Gln-培养基中培养，用相控显微镜分析细胞形态（左）和圆形（右）。显示沿单元格边缘绘制的边界（白色），以量化圆形。结果（每组26-134个细胞）显示为平均值±SE**第页与未治疗组相比<0.01，^##第页与含有TGF-β的完整培养基相比，<0.01，^§§第页在含有TGF-β的无Gln-培养基中，与shCon相比<0.01。所有误差条代表SE。所有比例尺代表100μm。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。

此外，shp53抑制了由Gln代谢抑制（shGLS1、DON和Gln剥夺）和shDlx-2（表（表1）。1). 因此，在Gln代谢抑制期间，p53诱导除miR-34和miR-200外的其他miRNA的表达。

然后，我们检测了p53在shDlx-2-和Gln代谢抑制介导的TGF-β诱导的EMT抑制中的作用。shp53促进TGF-β诱导的EMT（图4G和4H). shp53阻止shDlx-2和shGLS1介导的TGF-β诱导的EMT抑制（图（图4G）。4G网络). shp53还阻止了Gln缺失介导的对MCF-7细胞中TGF-β诱导的EMT的抑制（图（图4H），4小时)表明TGF-β以p53依赖的方式诱导EMT。总之，在TGF-β诱导的EMT期间，Dlx-2和Gln代谢可能以p53依赖的方式下调蜗牛靶向miRNAs。

抑制Gln代谢可防止Dlx-2/TGF-β/Wnt3a/蜗牛诱导的糖酵解转换和线粒体抑制

此前，我们发现蜗牛可以诱导糖酵解转换和线粒体阻遏[29]. Dlx-2诱导的糖酵解转换和线粒体抑制（图（图5A5A级和补充图5A). 接下来，我们研究了Gln代谢是否影响Dlx-2诱导的糖酵解开关和线粒体阻遏。shGLS1和Gln剥夺抑制了Dlx-2诱导的Glc消耗和Lac产生（图（图5A5A级和补充图5A). 此外，shGLS1和Gln剥夺阻止了Dlx-2诱导的氧（O）抑制₂)消耗量（图（图5A5A级和补充图5A). 这些细胞的ATP水平与对照细胞相似（数据未显示）。通过测量O₂我们估计了糖酵解和有氧呼吸对总ATP生成的相对贡献。shGLS1和Gln剥夺阻止了Dlx-2介导的糖酵解与有氧呼吸产生的ATP比率的增加（图（图5A5A级和补充图5A). 这表明Gln代谢抑制抑制了Dlx-2诱导的糖酵解开关和线粒体抑制。

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图5

Gln代谢与TGF-β-、Wnt3a-和Dlx-2/蜗牛诱导的糖酵解转换和线粒体抑制有关

答：。用Dlx-2和shGLS1联合转染MCF-7细胞。对细胞进行Glc消耗、Lac生成、线粒体呼吸和ATP来源分析**第页<0.01与模拟，^##第页与shCon相比<0.01。B、 C、。用shGLS1转染MCF-7细胞，然后用TGF-β（B）或Wnt3a-CM（C）处理。对细胞进行Glc消耗、Lac生成、线粒体呼吸和ATP来源分析**第页<0.01与未治疗相比，^##第页与shCon相比<0.01。D。将蜗牛和shGLS1联合转染MCF-7细胞。分析细胞的Glc消耗、Lac生成、线粒体呼吸和ATP来源**第页与Mock相比<0.01，^##第页与shCon相比<0.01。有氧呼吸（黑条）和糖酵解（灰条）产生的ATP量通过测量细胞中的耗氧量和Lac生成量来计算（A-D中的右侧面板）。所有误差线代表SE。

然后我们检查了Gln代谢是否与TGF-β/Wnt诱导的糖酵解开关和线粒体阻遏有关。TGF-β和Wnt诱导的糖酵解转换和线粒体抑制（图5B和5C). shGLS1抑制TGF-β-和Wnt诱导的Glc消耗和Lac生成（图5B和5C). 此外，shGLS1阻止TGF-β-和Wnt诱导的O₂消耗量（图5B和5C). 所有细胞中的总ATP浓度保持不变（数据未显示）。shGLS1抑制了TGF-β和Wnt介导的糖酵解与有氧呼吸产生的ATP比率的增加（图5B和5C). 这表明shGLS1抑制TGF-β/Wnt诱导的糖酵解开关和线粒体抑制。因此，Gln代谢似乎与Dlx-2-、TGF-β-和Wnt诱导的糖酵解转换和线粒体抑制有关。

最后，我们检查了谷氨酰胺代谢是否影响蜗牛诱导的糖酵解开关和线粒体阻遏（图（图5D第五天和补充图5B). 与它们对EMT的抑制作用类似，shGLS1和Gln剥夺阻止了蜗牛过度表达细胞中蜗牛诱导的糖酵解转换（图（图5D第五天和补充图5B). shGLS1和Gln剥夺也能阻止蜗牛诱导的O抑制₂消耗量（图（图5D第五天和补充图5B). 因此，谷氨酰胺代谢抑制抑制了蜗牛诱导的糖酵解开关和线粒体抑制。

人类肿瘤中Dlx-2、GLS1、蜗牛、p53和蜗牛靶向miRNA的表达

为了检测Dlx-2/GLS1/p53/miRNA/Snail级联的生理相关性，我们分析了它们在人类肿瘤样本中的水平。使用从乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和相应正常组织的配对活检中提取的RNA，通过实时qrtPCR检测Dlx-2、GLS1、蜗牛、p53和蜗牛靶向miRNA的表达。与匹配的非肿瘤组织相比，乳腺癌组织中Dlx-2和蜗牛的表达更高（图（图6A）。6A级). 乳腺癌组织中GLS1表达也较高，而p53表达较低（图（图6A）。6A级). 此外，与匹配的正常组织相比，无论癌症分期如何，结肠癌和卵巢癌组织中Dlx-2、GLS1和Snail的表达较高，p53的表达较低（图6B–6D). 乳腺癌和结肠癌中大多数蜗牛靶向miRNAs（miR-23b、miR-29b、miR30、miR-125b、miR153和miR-200）的表达低于匹配的正常组织；然而，miR-34、miR-148a和miR-203的表达与化生乳腺癌的对照组织相似（图（图6E）。第六版). 我们还使用免疫印迹法检测了Dlx-2、GLS1和蜗牛蛋白的表达。这三种蛋白在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌组织中的表达均高于匹配的非肿瘤组织（图6A–6D). 这些结果支持Dlx-2、GLS1和p53在肿瘤发展中的重要作用。

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图6

人类肿瘤中Dlx-2、GLS1、p53、蜗牛和蜗牛靶向miRNA的表达

A至C。实时qrtPCR数据显示Dlx-2、GLS1、p53和蜗牛mRNA的表达，以及乳腺癌（A）、结肠癌（B）和卵巢癌（C）所示肿瘤类型和组织学分期（TNM分类）的正常（N）和肿瘤（T）组织中Dlx-2、蜗牛和GLS1蛋白的免疫印迹。D。Ponceau S染色膜显示装载了相同数量的蛋白质。E。所示肿瘤类型中正常（N）和肿瘤（T）组织中蜗牛靶向miRNA的实时qrtPCR数据。将miRNAs的相对水平归一化为相应的正常组织*第页< 0.05; **第页与匹配的正常（N）组织相比，<0.01。所有误差线代表SE。F、。示意图显示了Dlx-2/GLS1驱动的Gln代谢的一种新功能，该功能有助于蜗牛依赖性EMT和糖酵解转换。对于所有免疫印迹图像，显示裁剪的印迹。

讨论

Dlx-2是一种参与胚胎发育、组织内稳态和细胞周期的转录因子[31,32]，在致癌过程中起重要作用；在多种人类癌症类型中，Dlx-2的表达与更晚期的癌症分期和不良预后呈正相关[33–36]. 在本研究中，我们发现Dlx-2诱导EMT并调节GLS1的表达和Gln的代谢，从而增加肿瘤转移。Dlx-2靶基因GLS1（图（图1）1)在Gln代谢中很重要。GLS1是许多癌症的关键酶[12–17]. 与匹配的正常组织相比，乳腺癌、前列腺癌和肝癌组织中GLS1水平升高，并且与恶性程度和肿瘤分级呈正相关[17,18]（图（图6）。6). c-Myc介导的miR-23a/b抑制增加GLS1水平[12,13]. 此外，NF-κB成员p65亚单位抑制miR-23a的表达并直接抑制GLS1的表达[42]. 向等（2015）表明GLS1级与周围非肿瘤组织相比，原发性人类肝癌中的mRNA上调，而MYC公司肿瘤中的mRNA水平也升高，它们与GLS1级mRNA水平[17]. 这表明MYC以外的因素可能参与了GLS1级肝癌mRNA水平。这里，GLS1由Dlx-2诱导（图（图1）。1). 我们发现，TGF-β和Wnt也以依赖于Dlx-2的方式上调GLS1的表达，但依赖于蜗牛（图（图1）。1). 此外，Dlx-2与GLS1启动子结合（图（图1E），1E级)表明Dlx-2诱导GLS1表达。Dlx-2诱导的GLS1激活是否需要Dlx-2结合，尚需通过转录报告分析结合定点突变来阐明。

我们发现shGLS1抑制肿瘤生长和转移体内（图（图2）。2). shGLS1和GLS特异性抑制剂BPTES和968可减少几种类型的癌细胞异种移植的生长[10,14,17]. 然而，shGLS1和GLS1抑制剂对转移的影响尚未见报道。我们的结果表明，Dlx-2-GLS1/Gln代谢级联在肿瘤转移和肿瘤生长中具有重要作用。

因为EMT是转移起始的重要过程[19–23]，我们研究了GLS1/Gln代谢抑制对EMT的影响。shGLS1、Gln剥夺和Gln代谢抑制剂（DON，968，BPTES）对Gln代谢的抑制阻止了Dlx-2-、TGF-β-和Wnt诱导的EMT，表明GLS1/Gln代谢可能参与Dlx-2/TGF-（图3，三、和补充图1和2). Dlx-2-GLS1-Gln代谢轴被认为是TGF-β和Wnt诱导EMT的重要调节因子。有趣的是，shGLS1也抑制了蜗牛诱导的EMT，尽管GLS1的表达不是由蜗牛诱导（图3J–3升). 因此，Dlx-2-GLS1-Gln轴可能为蜗牛诱导的EMT提供代谢支持，而不是作为上游途径。

Gln代谢抑制与shGLS1或Gln剥夺一起阻止了Dlx-2-、TGF-β-、Wnt-和蜗牛诱导的糖酵解转换，表明Gln代谢与糖酵化转换密切相关（图（图5，5、和补充图5). 最近，研究表明，癌细胞长期暴露于酸性pH（由糖酵解引起）下可上调谷氨酰胺代谢，以确保细胞内pH的稳态[43]. 因此，Gln和Glc在癌细胞中的代谢相互影响。

Gln代谢抑制降低了蜗牛mRNA的稳定性（图（图3，三、和补充图3B). 此外，shDlx-2、shGLS1、Gln剥夺和DON增加了几种蜗牛靶向miRNA的表达（表（表1）。1). 因此，Dlx-2/GLS1/Gln代谢途径似乎通过调节蜗牛靶向miRNA来增加蜗牛mRNA的稳定性（图（图6F6英尺).

我们进一步表明，Gln代谢抑制增加了p53蛋白和mRNA的水平（图4A–4D). 最近，研究表明，谷氨酰胺剥夺通过B55α诱导p53[44]. 这里，shDlx-2，而不是shSnail，增加了p53的表达（图4A、4B、4E和4F). 此外，α-KG抑制shDlx-2-和shGLS1诱导的p53表达（图4A和4B)表明p53被Dlx-2驱动的Gln代谢下调。p53上调了蜗牛靶向miRNA的表达（表（表1）。1). 我们的结果表明，蜗牛mRNA的稳定性与p53水平有关。总之，Gln代谢抑制通过p53增加蜗牛靶向miRNA的表达，从而阻止TGF-β诱导的EMT和糖酵解转换，最终降低蜗牛的稳定性（图（图6F第6页).

p53是最强的抑癌基因，几乎所有人类癌症都涉及p53功能的丧失[45]. Dlx-2诱导的Gln代谢可能有助于肿瘤发展过程中p53的减少。Gln剥夺通过ROS依赖性B55α激活诱导p53[44]. 因此，谷氨酰胺代谢抑制可能会重新激活p53。此外，TGF-β诱导的EMT在shp53处理的MCF-7细胞中比shCon处理的MCF-7细胞中更显著（图4G和4H). p53激活miR-200和miR-34家族成员的转录[39,46,47]. 此外，p53功能丧失和p53突变通过降低结肠癌、乳腺癌和肺癌细胞中miRNA-34的水平促进癌细胞EMT，从而抑制蜗牛蛋白的表达和活性[39].

我们发现Gln代谢抑制也能阻止Wnt3a诱导的EMT和糖酵解转换（图3G–3I和和5C，5摄氏度、和补充图2C和2D). TGF-β通过激活Dlx-2诱导蜗牛mRNA水平。然而，Wnt以与Dlx-2无关的方式增加了蜗牛水平。虽然TGF-β和Wnt3a诱导蜗牛表达的机制不同，但Gln代谢抑制对Wnt3a诱导的EMT和糖酵解转换的影响相似。Wnt信号通过激活Axin2通路诱导EMT，从而稳定蜗牛。Axin2通过充当GSK3β核输出的伴侣而刺激EMT，GSK3是负责蜗牛蛋白质周转的主要激酶[48]. miR-34直接抑制Axin2和其他Wnt信号分子，包括β-catenin和LEF1，以及蜗牛，最终抑制EMT[39,49]. 因此，Gln代谢抑制似乎通过miR-34的p53依赖性表达阻止Wnt3a诱导的EMT和糖酵解转换。

我们进一步表明，Dlx-2过度表达细胞和TGF-β处理细胞中的Gln代谢抑制（shGLS1、Gln剥夺或DON）也降低了Dlx-2水平（图3B、3E和3F、和补充图1B、1E、1J、2B和2H). 我们使用靶预测程序miRanda鉴定了可能与Dlx-2的3′-UTR结合的蜗牛靶向miRNAs。一些miRNAs，包括miR-23b和miR-203，被预测与Dlx-2 3′-UTR结合（数据未显示）。

我们的结果表明，Dlx-2/GLS1/Gln代谢轴参与TGF-β/Wnt/Snail诱导的EMT和糖酵解转换。Dlx-2通过激活GLS1/Gln代谢增加了蜗牛mRNA的稳定性，GLS1/Glin代谢抑制了蜗牛靶向miRNA的p53依赖性上调（图（图6F）。第6页). Dlx-2诱导蜗牛基因表达[37]. 因此，Dlx-2可能通过两种机制诱导蜗牛mRNA表达；（i）在早期激活蜗牛mRNA转录，以及（ii）在晚期增加蜗牛mRNA的稳定性。

Gln剥夺通过p53依赖性上调蜗牛靶向miRNAs来降低蜗牛mRNA水平，从而阻止Dlx-2-、TGF-β-、Wnt-和蜗牛诱导的EMT。Gln激活雷帕霉素复合物1（mTORC1）高度保守的激酶哺乳动物靶点，刺激蛋白质翻译和细胞生长；因此，谷氨酰胺剥夺通过抑制几种类型细胞中的mTORC1强烈抑制生长[50–52]. 谷氨酰胺剥夺还通过减少GCN2蛋白激酶介导的翻译起始因子eIF2α的磷酸化来抑制整体蛋白翻译[53,54]. 许多研究表明，mTOR信号激活EMT、癌症侵袭和转移[55–57]. 尽管mTORC1的遗传和药理学抑制在正常永生化人上皮细胞系和原代上皮细胞中触发EMT[58]，mTORC1抑制抑制结肠癌和乳腺癌细胞的EMT[59]. mTORC1抑制EMT作用的差异可能是由于细胞突变状态的差异所致[59]. 蔡等（2014）显示，mTORC1诱导cap依赖性翻译阻遏物4E-BP1磷酸化，导致其与eIF4E分离并形成翻译起始复合物。这导致Snail翻译的帽依赖性激活和癌细胞中EMT的诱导[59]. mTORC1/4E-BP1介导的蜗牛翻译也可能有助于Dlx-2/Gln代谢诱导的蜗牛表达。Dlx-2/GLS1/Gln代谢是否激活mTORC1信号需要进一步研究。

癌基因代谢，包括谷氨酰胺代谢，已被认为通过提供生物合成前体物来为癌细胞提供生长优势[2,4–8]. 我们认为，除了通过提供代谢物在支持肿瘤生长方面的明确作用外，Gln代谢还可能有助于肿瘤EMT、转移和进展。转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞从原发部位脱落。细胞-基质相互作用的丧失导致失巢凋亡，对失巢凋亡的抵抗是肿瘤转移的先决条件[60,61]. 蜗牛诱导糖酵解开关并抑制线粒体氧化代谢[30]，这可能通过防止过量ROS的产生而有助于失巢细胞的抵抗和转移。因此，除了EMT外，Dlx-2/GLS1级联可能通过增加蜗牛介导的失巢凋亡抵抗来促进肿瘤转移。我们的结果表明GLS1可能是预防转移和肿瘤进展的潜在治疗靶点。

材料和方法

细胞培养

在既定条件下培养MCF-7、Madin Darby犬肾（MDCK）和来自美国型培养物收集（ATCC）的L细胞[29]. Wnt3a-分泌L细胞和HCT116细胞分别由Min DS博士和Kim YJ博士（韩国釜山釜山国立大学）提供。通过应用不含Gln的EMEM进行Gln剥夺实验（GIBCO，Carlsbad，CA，USA）。将重组TGF-β（美国明尼苏达州研发系统公司）以10 ng/ml的浓度应用于细胞。40μM DON（美国密苏里州圣路易斯市西格玛）、5μM 968（美国加利福尼亚州圣地亚哥市钙生物化学公司）、10μM BPTES（西格玛公司）或1 mM二甲基-α-酮戊二酸（α-KG；西格玛集团）也应用于细胞中。

转染和短发夹RNA（shRNA）干扰

表达载体pCAGGS-Dlx-2（由加利福尼亚大学旧金山分校John L.R.Rubenstein博士提供）和pCR3.1-Snail-Flg（由韩国延世大学J.I.Yook提供）通过jetPEI（Polyplus transformation，SA，USA）转染到MCF-7、MDCK和HCT116细胞。如前所述，产生并转染针对对照、Dlx-2、蜗牛、GLS1、Smad2、Smad3、Smad4、β-catenin、TCF4、Axin1、Axin 2和p53的shRNA pSUPER载体[29]. shRNA靶序列列于补充表S1.

免疫印迹、实时qrtPCR、免疫荧光（IF）染色和染色质免疫沉淀（ChIP）分析

如前所述进行免疫印迹、实时qrtPCR、IF和ChIP分析[29,33].

线粒体呼吸、Glc消耗、Lac生成和ATP生成的测定

如上所述测量线粒体呼吸[29,62]. 根据制造商的说明，分别使用Glc氧化分析试剂盒（美国密苏里州西格玛）、比色法和基于荧光的Lac检测试剂盒（加利福尼亚州BioVision，美国）和ATP生物发光检测试剂盒，测定培养基中的Glc、Lac和细胞内ATP水平。Glc、Lac和细胞内ATP水平标准化为蛋白质浓度。有氧呼吸和糖酵解产生的ATP水平通过测量乳酸产生量和耗氧量来确定[29,63].

补充数据图表

单击此处查看。^{（340万，pdf）}

致谢

这项工作得到了韩国政府（MSIP）资助的韩国国家研究基金会（NRF）拨款（编号：2011-0011084、2013M2B2A9A03050902和2012R1A1A2044246）以及大韩民国卫生福利部癌症控制国家研发计划（1320040）的拨款支持。我们感谢K.L.Jang博士、Y.H.Moon博士和D.S.Min博士提供了他们的实时qrtPCR机器。

脚注

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

贡献者

作者贡献

S.Y.Lee、H.M.Jeon和H.S.Kang构思并设计了该项目。S.Y.Lee、H.M.Jeon、M.K.Ju和E.K.Jeong进行了实验。S.Y.Lee、H.M.Jeon、M.K.Ju、E.K.Jeong、C.H.Kim、H.G.Park、S.I.Han和H.S.Kang对数据进行了分析和解释。S.Y.Lee、H.M.Jeon、E.K.Jeong和H.S.Kang撰写了手稿。H.S.Kang监督了该项目。

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文章来自Oncotarget公司由以下人员提供Impact Journals有限责任公司

Dlx-2和谷氨酰胺酶上调上皮-间质转化和糖酵解开关

李素妍

Hyun Min Jeon先生

Min Kyung Ju女士

尤金贞（Eui Kyong Jeong）

赵熙金（Cho Hee Kim）

惠庆园

宋爱翰

何松康

关联数据

摘要

简介

结果

GLS1由Dlx-2诱导

shGLS1抑制体内肿瘤生长和转移

抑制谷氨酰胺代谢可预防EMT

谷氨酰胺代谢抑制和shDlx-2降低蜗牛mRNA水平

Gln代谢抑制和shDlx-2通过p53调节增加蜗牛靶向miRNAs的表达

表1

抑制Gln代谢可防止Dlx-2/TGF-β/Wnt3a/蜗牛诱导的糖酵解转换和线粒体抑制

人类肿瘤中Dlx-2、GLS1、蜗牛、p53和蜗牛靶向miRNA的表达

讨论

材料和方法

细胞培养

转染和短发夹RNA（shRNA）干扰

免疫印迹、实时qrtPCR、免疫荧光（IF）染色和染色质免疫沉淀（ChIP）分析

线粒体呼吸、Glc消耗、Lac生成和ATP生成的测定

补充数据图表

致谢

脚注

参考文献