心肌纤维化和心律失常中的肌细胞-成纤维细胞通讯：机制和模型系统

1.3.1. 旁分泌介体

旁分泌介质允许心肌细胞和成纤维细胞间接交流，因为这些因子可以从一种细胞类型分泌，扩散并循环到另一种细胞。该领域的大多数研究重点是在心脏纤维化、肥大和心律失常的背景下，TGF-β1和血管紧张素II信号通路对肌细胞-成纤维细胞通信的影响。最近的工作已经确定了涉及白细胞介素和Wnt信号通路的额外旁分泌因子，因为它可能在心脏肥大和纤维化的背景下影响肌细胞-成纤维细胞的通讯。在本节中，我们将讨论TGF-β1、血管紧张素II、白细胞介素和Wnt信号在肌细胞-成纤维细胞通信中的作用。

TGF-β1是心肌纤维化时调节肌细胞-成纤维细胞通讯的主要旁分泌因子。心肌细胞和成纤维细胞中表达TGF-β1及其受体[40–43]. 在成纤维细胞中，TGF-β1治疗增加成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，并增加其ECM的生成[44,45]，概括了纤维化途径。体内下调TGF-β1的研究也表明，TGF-α信号的抑制与纤维化的丧失有关，这突出了TGF-γ信号对心脏成纤维细胞的优先作用体内[46,47]. 有趣的是，Koitabishi等表明小鼠心肌细胞特异性TGF-βR2的丢失（从而导致TGF-α信号的丢失）体内在压力超负荷的情况下，还可以减少纤维化，强调肌细胞衍生TGF-β信号的丢失足以削弱心脏成纤维细胞的功能体内[46]. 在心房和心室心肌细胞中过度表达TGF-β1的小鼠模型中进行的研究表明，心房纤维化和心律失常增加，但心室没有增加[48]这表明，心房肌和心室肌中肌细胞-成纤维细胞通讯的调节方式及其对纤维化和心律失常通路的影响可能会增加潜在的复杂性。

血管紧张素II（AngII）也被认为是促进肌细胞-成纤维细胞通信的主要旁分泌因子，其功能可能与TGF-β1信号通路交叉。明确地，在体外用成纤维细胞条件培养基进行的共培养研究和心肌细胞单层研究表明，血管紧张素Ⅱ介导的心肌细胞肥大反应需要成纤维细胞[14,49–51]. 在AngII治疗的TGFβ-1缺陷小鼠中进行的研究进一步证明，TGFβ1是AngII介导的肥厚反应所必需的体内[52]. 据推测，血管紧张素II可能对成纤维细胞产生优先效应，因为血管紧张素I型受体在成纤维细胞中的表达高于心肌细胞[50]. 如其他文献所述，AngII对心肌细胞电生理也有一些直接影响，因此这些影响可能转化为心律失常[53]. 未来的研究重点是更好地了解Ang II在促心律失常环境中的作用，以确定这些影响是否可以通过肌细胞-成纤维细胞相互作用介导。

白细胞介素也可能作为心肌细胞和成纤维细胞之间的信号传导介质，因为它们由两种细胞类型表达并影响这两种细胞。白血病抑制因子（LIF）和心肌营养素-1（CT-1）是白细胞介素（IL）-6家族的细胞因子，均在心肌细胞和成纤维细胞中表达[54]. 在心肌细胞中，LIF和CT-1均可刺激心肌细胞肥大[55–57]. 在成纤维细胞中，LIF和CT-1治疗可以增加成纤维细胞增殖[55–57]. 有趣的是，LIF治疗还可以通过阻止成纤维细胞向肌成纤维细胞分化以及减少胶原分泌来抑制纤维化激活[56]. 白细胞介素33（IL-33）是IL-1家族的成员，也是由成纤维细胞产生的[58,59]. 在心肌细胞中，IL-33可以抑制AngII和苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大在体外[59].体内研究表明，IL-33可以抑制压力过载后的心肌肥厚并减轻纤维化[59]提示IL-33可能作为成纤维细胞产生的旁分泌信号，调节心肌细胞对肥厚刺激的反应。

Wnt信号也参与了肌细胞-成纤维细胞通信的调节。缺血再灌注损伤后心脏成纤维细胞Wnt1上调[60]. 小鼠Wnt信号的整体抑制（因此在心肌细胞和成纤维细胞中）体内减少心肌梗死后的纤维化，改善心肌细胞/心脏恢复[61–64]. 有趣的是，心肌细胞通过过度表达Wnt的内源性抑制剂Sfrp1来抑制Wnt信号传导，体内导致相反的反应，包括心肌梗死后纤维化增加和心肌细胞/心脏恢复恶化[65]. 这些结果表明，成纤维细胞中的Wnt信号可能直接调节心肌细胞的存活，因此，心肌细胞-成纤维细胞的串扰可能是心脏对Wnt信号在心脏损伤情况下的整体抑制与心肌细胞特异性抑制的不同反应的基础。

1.3.2. ECM交互

ECM的既定作用是为心脏细胞提供结构支持。最近，ECM蛋白也可以作为心肌细胞和成纤维细胞之间的信号介质发挥作用。成纤维细胞是产生和分泌ECM成分（例如胶原蛋白和纤维连接蛋白）以及降解ECM成分的酶（例如基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP））的主要细胞类型[66,67]. 这些蛋白质反过来可以被邻近的细胞（如心肌细胞）感应到[66,67].

成纤维细胞产生并分泌胶原蛋白，胶原蛋白可以直接与心肌细胞相互作用[68,69]. 成纤维细胞胶原水平和分泌的改变与心肌细胞功能的改变直接相关。特别是，由于心脏纤维化导致过量ECM生成，从而导致心脏胶原蛋白水平增加，可能导致心肌细胞连接和功能受损[70]. 此外，心脏中主要胶原蛋白亚型（I型和III型胶原蛋白）比率的改变也会影响心肌细胞的功能，因为它们的物理性质不同。患有扩张型心肌病（DCM）并随后出现舒张功能障碍的心脏病患者，胶原成分发生变化（I型胶原与III型胶原比值增加），从而影响心肌细胞顺应性[71,72].

纤维结合蛋白是另一种主要的ECM成分，由成纤维细胞产生，可被心肌细胞感知。心肌细胞通过整合素与细胞表面的纤维连接蛋白特异性相互作用，本期已对此进行综述[73]和其他地方[74,75]. 虽然没有研究直接评估纤维连接蛋白在心脏中的功能作用，但针对整合素复合体成员的小鼠模型的研究结果表明，心肌细胞破坏纤维连连接蛋白相关的相互作用对心脏电生理学和功能有不利影响[74]. 具体地说，心肌细胞特异性的vinculin（连接肌动蛋白细胞骨架网络和整合素的蛋白）缺失，在没有心力衰竭的情况下可能导致心律失常和猝死[76]. 这些发现表明，整合素信号改变可能足以产生心律失常的底物；然而，整合素-纤维连接蛋白相互作用在该途径中的重要性仍有待研究。

成纤维细胞和心肌细胞都产生MMPs，MMPs是降解细胞外ECM成分的酶，TIMPs抑制MMPs的作用[77]. 来自共培养系统的证据表明，基质金属蛋白酶在改善成纤维细胞对心肌细胞组织的驱动作用方面至关重要。在这个系统中，发现与单独培养的心肌细胞相比，与成纤维细胞培养的心肌细胞核显示出更好的排列，并且这种改进被MMP抑制所抵消[78]. 作为证据，这种相互作用也可能与患病心脏有关体内扩张型心肌病和心肌梗死后重塑模型显示MMP活性升高，抑制MMPs可以改善心脏的恢复[79–81]. 虽然还需要做更多的工作来证明直接相互作用的影响，但这些发现表明，在患病心脏中，成纤维细胞和心肌细胞之间的MMP依赖性串扰可能有重要贡献。

1.3.3. 电子调制器

心肌细胞和成纤维细胞也能通过缝隙连接直接相互作用。在单通道水平上，全膜片钳研究了共同培养的新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞的细胞对中的同型和异型缝隙连接，发现这些细胞类型之间存在功能性缝隙连接，并显示出半通道的特性，因为它们具有比例较低的电导，这表明由两种不同类型的连接蛋白形成的通道反映了两种不同的细胞类型[82]. 然而，其他利用2D和3D共培养的研究小组的发现已经确定了连接蛋白43斑块以及心室肌细胞和成纤维细胞之间的表达[83,84]. 这些发现与工作心肌的心肌细胞相毗邻，后者主要在缝隙连接处表达连接蛋白43[83]. 有趣的是，对兔窦房结心肌细胞和成纤维细胞的研究表明，连接蛋白40主要在成纤维细胞之间表达；然而，当窦房结成纤维细胞靠近并与心肌细胞偶联时，它们现在主要表达连接蛋白45，突显肌细胞-成纤维细胞偶联对缝隙连接表达和功能的影响[83,85].

另一种可能对细胞之间的电连接产生影响的细胞-细胞连接是膜纳米管或隧道纳米管，它们首次在培养的PC12细胞中观察到[86]. 膜纳米管是一种长而薄的膜结合连接，携带膜成分Ca²⁺线粒体和细胞间的其他货物[87]. 这些结构已在心肌细胞和成纤维细胞之间得到鉴定在体外和体内[88]. 尽管仍有研究要做，以确定膜纳米管的全部功能，但它们在心肌细胞和成纤维细胞之间的存在，以及在其他系统中携带离子的能力，都支持其在心肌细胞-成纤维细胞相互作用中的作用。

从电生理学的角度来看，这些电连接在心脏传导中起着重要作用。成纤维细胞本身不能产生动作电位，但可以表现出导电特性。在培养中，成纤维细胞可以与心肌细胞一起表现出节律性去极化，影响电同步性并改变自动性参数[89–92]. 成纤维细胞甚至可以显示电导和阳离子通量的拉伸依赖性变化[90,93,94]. 理论模型以零、单面和双面耦合度描述了心肌细胞和成纤维细胞之间的电相互作用，并在计算系统中证明了其有用性。当成纤维细胞在功能上绝缘，并且不通过缝隙连接与心肌细胞耦合时，会发生零边耦合。当成纤维细胞通过缝隙连接连接到一组电互连的心肌细胞时，就会发生单侧耦合。在这种耦合中，成纤维细胞具有很强的缓冲作用（电紧张负荷）。当成纤维细胞与心肌细胞连接时，并不是所有的心肌细胞都彼此直接接触，从而起到桥梁的作用，使成纤维细胞形成传导通路。心脏组织可能表现出这些相互作用的组合，成纤维细胞密度或活性的改变可能改变主导的耦合机制[95,96].

1.4.1.体外试验模型系统

肌细胞与成纤维细胞的相互作用通常使用2D共培养模型系统进行评估，因为它们简单且具有成本效益。简单地说，将心肌细胞和成纤维细胞的混合物接种到细胞培养皿上，使心肌细胞与成纤维细胞之间的相互作用呈随机和非均匀分布。可以测量肌细胞和成纤维细胞之间直接和间接（旁分泌）相互作用的影响在体外通过各种读数。读数包括测量（i）肌细胞-成纤维细胞相互作用环境中的蛋白质分泌/旁分泌效应，（ii）肌细胞与成纤维细胞交互作用部位的各种蛋白质表达，以及（iii）电生理特性（动作电位、场电位、搏动率、电耦合）肌细胞-成纤维细胞相互作用（直接和间接）[14,107,108]. 二维共培养研究在确定TGF-β对心脏成纤维细胞AngII介导的功能的旁分泌作用方面至关重要。具体而言，研究表明，心肌细胞衍生因子增加了Ang II诱导的心脏成纤维细胞胶原表达[14,107]. 旁分泌效应也可以在心脏成纤维细胞和心肌细胞物理分离的跨孔培养中进行分离；然而，通过媒体保持间接接触[109]. 新技术（电细胞基质阻抗传感系统）也被应用于传统的2D共培养模型，以更严格地评估合胞体中肌细胞-成纤维细胞相互作用的收缩和电生理特性，并实时进行评估[110]. 例如，可以在培养皿中控制成纤维细胞与心肌细胞的比率，以评估其在整体心肌细胞收缩性和沟通中的作用[110]. 虽然目前关于成纤维细胞的许多知识都是从二维培养系统中获得的，但应该注意的是，成纤维细胞在刚性基质上生长时会迅速转化为肌成纤维细胞[111,112]. 因此，由于在这些研究中缺乏对细胞类型的正确识别，我们对“成纤维细胞”功能的大多数理解可能是通过肌成纤维细胞获得的。然而，基于病变心脏中肌成纤维细胞的增加，这些采用2D培养系统的研究可能会阐明疾病发病的重要途径[三,25–29].

利用微制造技术的二维模式共培养技术目前正在被用于空间分离和表征肌细胞-成纤维细胞相互作用的分子和生理属性。这是有利的，因为它提供了细胞间相互作用的空间控制。微加工是在微米和纳米尺度上制造微型结构的过程。微加工硅梳提供了一种完全或部分分离电池类型的途径[113]. 硅梳已被用于研究骨骼肌细胞与成纤维细胞的相互作用[114]. 其应用的一个例子包括研究肌细胞-成纤维细胞相互作用对肌管分化和排列的影响[114]. 通过利用不同细胞类型的不同粘附特性，光刻可以用于空间分离细胞类型[115,116]. 以前的技术利用光刻和微流体技术在细胞培养表面上对胶原蛋白进行结构设计，以创建心肌细胞和成纤维细胞的粘附区域[115]. 这些研究表明，这些结构化的肌细胞-成纤维细胞共培养能够重现体内心室组织结构[115]. 最近的研究已经利用光刻技术在细胞培养表面形成不同的细胞外基质图案[116]. 简言之，i）用光敏电阻化合物涂覆成纤维细胞粘合剂琼脂涂层玻璃盖玻片，ii）选择性去除化合物以露出下面的琼脂层，iii）心肌细胞粘附表面分层在暴露的琼脂上，iv）去除剩余的光敏电阻化合物，留下心肌细胞粘附区域和成纤维细胞粘附区域的图案，v）心肌细胞在成纤维细胞之前进行顺序电镀，以允许其在24小时后进行电镀[116]. 这项技术已被用来更好地理解肌细胞和成纤维细胞之间的电耦合[117]. 微图形细胞表面的其他用途包括基于聚合物的微流体和软岩性成像，这些在其他地方已经过详细审查[12,118,119]但仍有待开发，以更好地了解肌细胞-成纤维细胞的相互作用。

3D共培养提供了一个被认为可以模拟组织复杂性的环境，因为细胞间网络和相互作用在3D中得到了促进[12]. 基于支架和无支架的3D共培养系统分别用于研究人工或天然ECM环境中肌细胞-成纤维细胞的相互作用。基于支架的方法使用多孔和纤维水凝胶等生物材料[120,121]以及纳米纤维[122]. 这些生物材料创建了一种结构，以吸引细胞在3D基质中相互作用，从而研究细胞-细胞和细胞-ECM生物学在类似组织环境中的影响。例如，GelMA水凝胶被用作支架来研究肌细胞-成纤维细胞（连接蛋白43）和成纤维细胞-ECM（β1-整合素）相互作用对同步收缩的影响[123]. 与基于支架的系统相比，在这种系统中，细胞与细胞之间的相互作用占主导地位[123]，在无支架的自组装三维培养中，细胞间的相互作用最大化。对于这项技术，将心肌细胞和成纤维细胞的混合物接种在低附着表面或其他特殊表面上，以促进细胞与细胞的相互作用，从而产生球形心脏微组织[124]. 发现肌细胞和成纤维细胞以组织样分布自我组装和散布，并表达心脏ECM和收缩蛋白（例如Ca2+处理蛋白）。此外，发现这些微组织具有功能性，因为它们表现出自发动作电位和收缩[124]. 附着表面的修改为控制球形尺寸提供了关键改进，从而能够评估更大、更复杂的微观组织[124].

目前关于更好地理解肌细胞-成纤维细胞相互作用的许多研究都集中于在二维和三维共培养环境中开发小鼠和大鼠的心肌细胞和成纤维细胞。然而，肌细胞-成纤维细胞的相互作用在人类中也起着关键作用。来自人类胚胎干细胞衍生心肌细胞的证据强调，成纤维细胞相互作用（通过共培养或条件培养基）是人类心肌细胞分化的关键驱动因素[125–128]. 这些相互作用也可能导致人类心脏病，其中肌细胞-成纤维细胞偶联缺陷可能是高度流行的心脏纤维化和心律失常的基础。鉴于越来越多的基于hiPSC的心脏病模型[129]以及使用hiPSC的3D工程组织模型的出现[130]，未来的研究重点是更好地了解肌细胞-成纤维细胞通信在这些2D和3D模型系统中的影响，这对于更好地了解它们对人类疾病环境的贡献具有重要意义。

1.4.2.在体内模型系统

为了更好地理解患病心脏背景下的细胞间通讯，还建议将来自人类和动物模型的活心脏组织切片作为实验模型系统[131–133]. 该实验系统具有以下优点：（i）与人类直接相关；（ii）提供了一个在疾病背景下保留肌细胞-成纤维细胞相互作用的天然细胞结构的环境；（iii）可用于药物筛选。然而，由于（i）缺乏用于比较研究的健康对照，（ii）获取这些组织需要侵入性程序，以及（iii单个细胞类型在这些相互作用中的贡献很难分离和评估。

利用心脏和成纤维细胞特异性基因靶向方法的条件遗传小鼠模型可以用于分离或与培养研究相结合，作为一种强大的体内模型系统有助于剖析心肌细胞-成纤维细胞相互作用对心脏病的影响体内Periostin-Cre在压力过载后心脏中的成纤维细胞特异性表达模式已被开发[16]. 成纤维细胞特异性缺失Klf5公司是Krüppel-like因子家族的成员体内使用骨膜抑素-Cre导致对压力过负荷诱导的心肌肥大和纤维化反应迟钝[16]. 另一方面，心肌细胞特异性缺失Klf5公司在小鼠中体内使用α-肌球蛋白重链Cre，导致与对照组相似的正常肥大和纤维化反应[16]. 这些结果表明，成纤维细胞可以直接与心肌细胞沟通以调节肥厚反应[16]. 然而，骨膜炎被认为在成人心脏低水平表达[134]因此，它的使用可能仅限于处于压力过载等应激状态的成纤维细胞[16]. 香港等最近，在纤维化模型的背景下，使用绿色荧光蛋白报告物探索了成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）-Cre小鼠系的表达模式，并且显示出对成纤维细胞的低特异性，因为超过30%的FSP1阳性细胞是造血细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞[134]. 因此，这些研究表明，目前已知的成纤维细胞启动子在心脏的所有成纤维细胞中都没有活性。因此，未来的研究需要专注于识别成纤维细胞的通用生化标记物，以推动这一领域的研究向前发展。

1.4.3.硅胶材质模型系统

基于离子、细胞（2D）和全心脏（3D）的计算模型可用于模拟心脏纤维化和心律失常背景下心肌细胞和成纤维细胞的结构和电特性。

早期的研究利用离子和基于细胞的模型系统来更好地理解心律失常情况下肌细胞和成纤维细胞之间的相互作用。在这些模型中，可以模拟心肌细胞和成纤维细胞膜的电特性，如离子通道、交换器、泵以及细胞信号[135–139]. 这些模拟已扩展到研究人类心肌细胞的电特性[140]. 对于成纤维细胞，使用了两个模型进行模拟，其中包括成纤维细胞的被动和主动特性[141]. 在被动模型中，膜电容与欧姆电阻并联，可用于控制成纤维细胞静息膜电位和膜电导参数[142,143]. Noble小组使用第一个被动成纤维细胞模型将窦房肌细胞模拟为细胞对[142]. Winslow及其同事率先将计算模型扩展到二维板材[136]. 在主动模型中，利用四种膜电流的特性，包括钾电流（内向整流、时间和电压依赖整流）、生钠钾ATP酶和钠电导，进行了模拟[143]. 被动和主动成纤维细胞模型可以与心肌细胞模型相结合，以更好地了解在无继发性疾病表现的环境中肌细胞-成纤维细胞耦合[143]. 特别是在被动模型中，当心肌细胞与成纤维细胞结合时，观察到动作电位持续时间发生微小变化。然而，在活动模型中，当与成纤维细胞和成纤维细胞结合时，观察到心肌细胞的动作电位持续时间显著缩短，显示出强电去极化，这可能表明收缩发生改变[143]. Brown等人使用这些肌细胞-成纤维细胞模型来更好地理解在促心律失常环境中耦合对这些细胞许多其他电特性的影响[141].

最近的研究利用多尺度水平的计算模型来探讨肌纤维母细胞-肌细胞耦合在体内心房和心室心律失常中的作用[144]. 根据活体动物和人类的高分辨率磁共振成像重建心脏的三维模型[145,146]. 这些3D模型保留了心脏天然心房和心室中观察到的几何形状和纤维方向[144,146]. 然后将细胞尺度上的肌细胞-成纤维细胞耦合模型引入这些3D模型中，以表征肌细胞-纤维细胞相互作用如何影响心脏的电生理特性体内[144]. 例如，这些模型可以模拟离子流的减少(我_纳,我_钙，L,我_氪和我_{Ks（千克）})在兔心肌梗死模型中观察不同比例的浸润性肌成纤维细胞对近梗死区的影响。他们发现心律失常的倾向是双向的，并且在中、高密度浸润性肌成纤维细胞中发生改变[144]. 这些结果提高了我们对肌成纤维细胞在心律失常发生中的作用的认识。

然而，由于不同的成纤维细胞-肌细胞相互作用被用于模拟，并且这些不同的模型会影响传导反应，因此该领域存在一些争议[147,148]. 在中进行的平行研究在体外和体内生物系统可能有助于验证肌细胞-成纤维细胞相互作用的性质以及这些模拟得出的结论。因此，应考虑更精细和标准化的模型，以更准确地描述肌细胞-成纤维细胞的相互作用。还应考虑描绘人类心脏中这些相互作用的模型。

J.P.由NIH F31 Ruth L.Kirschstein国家研究服务奖研究生奖学金（1F31HL120611-01）资助。F.S.得到了NIH/NHLBI（HL09780）、美国心脏协会（GRNT22940045）和烟草相关疾病研究（24RT-22）的资助。