美国国家科学院院刊。2004年7月13日；101(28): 10452–10457.
中国南方鸭体内H5N1流感病毒的进化
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H.陈
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
G.邓
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
Z.李
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
G.田
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
Y.Li（李彦宏）
*农业部动物流感实验室†中华人民共和国哈尔滨市马端街427号中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
P.Jiao先生
*农业部动物流感实验室†中华人民共和国哈尔滨市马端街427号中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
L.张
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
Z.刘
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
R.G.韦伯斯特
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
K.Yu公司
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
*农业部动物流感实验室†中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨市马道街427号，150001；和§田纳西州孟菲斯市圣犹德儿童研究医院传染病科病毒学科，邮编38105
¶现住址：中华人民共和国北京市麦子店街20号农业部国家畜牧兽医局，邮编：100026。
作者：R.G.Webster，2004年5月21日
摘要
自20世纪80年代中期以来，禽H5N1流感病毒对哺乳动物的致病性一直在演变。在此，我们证明，从1999年至2002年中国大陆表面健康的家鸭中分离出的H5N1流感病毒对哺乳动物的致病性越来越高，我们提出了一个假说来解释这种进化方向的机制。1999年至2002年，从中国南方貌似健康的鸭子中分离出21种病毒，经确认为H5N1亚型甲型流感病毒。这些分离物在抗原上与A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）病毒相似，该病毒是1997年香港“禽流感”血凝素基因的来源，所有分离物在鸡中都具有高致病性。根据病毒在小鼠中的复制和致死性，病毒形成四种病理类型。在哺乳动物模型中，这些分离物的致病性逐渐增加具有明显的时间模式。六个H5N1分离株中有五个在接种过的鸭子中复制，并从气管或泄殖腔中脱落，但没有一个引起疾病症状或死亡。全基因组系统发育分析表明，大多数病毒是含有A/Goose/Guangdong/1/96类血凝素基因和未知欧亚禽流感病毒的其他基因的重配子。这项研究是对最近在中国大陆鸭群中传播的H5N1禽流感病毒的特征分析。我们的研究结果表明，需要立即采取行动，防止高致病性禽流感病毒从看似健康的鸭子传播到鸡或哺乳动物宿主。
禽流感病毒是一种人畜共患病因子，被认为是对兽医和人类公共健康的持续威胁。在过去6年中，已多次检测到人类感染三种亚型禽流感病毒（H5、H7和H9）(1,2). 1997年，H5N1禽流感病毒在香港由鸟类传染给人类，导致18名感染者中有6人死亡(三,4). 香港通过屠宰所有家禽而消灭了该病毒，但2000年和2001年，香港家禽中继续出现新的H5N1病毒基因型(5,6)2003年，新的抗原和生物H5N1流感病毒杀死了两名感染者中的一人(7).
1999年从香港两名患病儿童中分离出H9N2亚型禽流感病毒(8)来自中国大陆的6名患者(9); 所有人都从感染中康复了。1999年，从中国大陆人身上分离出的H9N2变异体也从中国南方的猪身上分离出来(10,11)但没有血清学证据表明在猪或人中建立了稳定的病毒谱系。H9N2病毒继续在整个欧洲和亚洲的家禽中传播，现在被认为是整个地区的流行性病毒。
2003年，H7N7禽流感病毒在荷兰225个家禽养殖场引发了高致病性禽流感，该病毒与347人的结膜炎相关(12). 其中87例确诊感染H7N7流感病毒；一名兽医死于感染。也有人与人之间的病毒传播和猪感染H7N7的血清学证据(13). 此次疫情通过扑杀和检疫受感染家禽得到控制；为了防止人禽病毒重配物的出现和传播，家禽饲养工人接种了人流感疫苗和抗神经氨酸酶药物。
1997年H5N1“禽流感”向人类的传播首次确立了禽流感病毒向人类传播的能力，尽管它们优先结合禽唾液酸受体（即具有末端α2,3Gal连接的受体）(14). 1997年之前，曾有人感染H7N7流感病毒的孤立报告（通常导致结膜炎）(12)但没有令人信服的证据表明禽流感病毒会反复传播给人类。禽流感病毒是如何逐渐增强感染哺乳动物的能力的？在这里，我们描述了1999年至2002年从中国南方沿海省市表面健康的家鸭中分离出的21种H5N1流感病毒的特征。这些分离物对鸡具有高度致死性，并显示对小鼠（哺乳动物宿主）的致病性逐渐增强。它们在基因组上是异质性的，在非结构（NS）和神经氨酸酶（NA）基因中获得了多个基因片段和缺失。我们提出了一种假设机制来解释H5N1病毒对小鼠致病性增加的选择。
材料和方法
病毒分离和鉴定。在A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）（GSGD/1/96）病毒被确定为香港1997（HK/97）禽流感病毒的重要前体后，在广东、广西、福建、浙江和上海等中国沿海省市开始对表面健康的家禽进行常规流感病毒监测。泄殖腔样本取自农场上看起来健康的鸭子。如参考文献所述，在鸡胚中分离出病毒。15。通过血凝抑制（HI）和神经氨酸酶抑制试验，使用Office International Desépizoties Reference Laboratory（英国萨里郡兽医实验室局）提供的抗血清，共鉴定出21种H5N1病毒。每种病毒都是通过三轮限制稀释的胚胎特异性无色素卵子进行生物克隆的。H5N1病毒的所有实验均在生物安全3级实验室设施中进行，动物实验在高效微粒空气过滤（HEPA过滤）隔离器中进行。
动物实验。鸡。为了确定病毒分离物的致病性，根据国际兽疫局的建议测试了静脉致病性指数（IVPI）。隔离器笼子中饲养的10只6周龄无特定色素的白来亨鸡用0.2毫升1:10稀释的无菌尿囊液静脉接种，尿囊液中含有病毒（病毒滴度显示在). 另外10只鸡经鼻接种10只6鸡蛋50%感染剂量（eID50)每种病毒0.1-ml体积；第3天，每组杀死三只鸟，并在肺、法氏囊、肾、胸腺、甲状腺、脑、心脏、胰腺、肌胃、脾脏和气管样本中滴定病毒。对已经死亡的鸟类也进行了类似的测试。这些组织也进行了组织病理学研究；将其固定在10%中性福尔马林缓冲溶液中，切片并用苏木精和伊红染色。对未固定样品进行滴定，以检测胚胎蛋中的病毒感染性。
表1。
21株鸭源H5N1禽流感病毒和A/goose/Guangdong/1/96禽流感病毒感染鸡的死亡率和MDT
| 静脉接种
| i.n.接种
|
|---|
| 病毒滴度（log10电子身份证件50/毫升） | 死亡/接种人数 | MDT，天 | IVPI公司 | 死亡/接种人数 | MDT，天 |
|---|
| GSGD/1/96（8.5） | 9/10 | >5.9 | 2.1 | 6/10 | >8.3 |
| DKGX/07/99（8.4） | 5/10 | >第7.2条 | 1.2 | 2/7* | >8.8 |
| DKFJ/19/00（9.0） | 10/10 | 2.7 | 2.6 | 5/10 | >8.7 |
| DKGD/12/00（9.5） | 10/10 | 5.3 | 2.1 | 10/10 | 6.5 |
| DKZJ/11/00（9.5） | 10/10 | 1.1 | 3 | 10/10 | 3.3 |
| DKZJ/52/00（8.6） | 10/10 | 3.3 | 2.3 | 10/10 | 3.8 |
| DKGD/07/00（8.3） | 10/10 | 2.7 | 2.4 | 6/10 | >8.7 |
| DKGD/40/00（8.2） | 10/10 | 1.3 | 2.9 | 10/10 | 4 |
| DKGD/1/01（8.3） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 2.1 |
| 2001年8月8日（8.3） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 3.8 |
| DKSH/13/01（7.5） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 2.2 |
| DKFJ/17/01（7.2） | 10/10 | 1.4 | 3 | 10/10 | 3.1 |
| DKGX/22/01（7.5） | 10/10 | 1.6 | 2.9 | 10/10 | 4 |
| DKGX/35/01（7.4） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 2.1 |
| DKSH/38/01（8.0） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 2 |
| DKGX/50/01（8.6） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 2 |
| DKFJ/01/02（8.5） | 10/10 | 1.6 | 2.9 | 10/10 | 2.7 |
| DKFJ/13/02（8.5） | 10/10 | 1.1 | 3 | 10/10 | 1.7 |
| DKGD/22/02（8.5） | 10/10 | 1.5 | 2.9 | 10/10 | 2.5 |
| DKSH/35/02（7.5） | 10/10 | 1 | 3 | 10/10 | 2.7 |
| DKSH/37/02（8.7） | 10/10 | 1.5 | 3 | 10/10 | 1.8 |
| DKGX/53/02（8.0） | 10/10 | 4.1 | 2.1 | 8/10 | >6.5 |
老鼠。8只6-8周龄雌性BALB/c小鼠（北京实验动物中心，北京）被一氧化碳轻度麻醉2用10个6电子身份证件5050μl体积的H5N1流感病毒。对照组小鼠接种PBS。第3天，八只小鼠中的三只被杀死，以进行肺、肾、脾和脑的病毒滴定。其余五只小鼠每天进行体重减轻和死亡率监测。小鼠50%最小致死剂量（MLD50)通过对五只小鼠进行一组的i.n.接种来确定引起小鼠致命感染的病毒。MLD公司50采用Reed和Muench方法计算(16).
鸭子。每组5只3周龄的鸭子（一种舍德雷克本地近交系）经静脉接种10只7.85到108.5电子身份证件50一天后，每组引进三只接触鸭。连续10天每天观察鸭子是否有疾病迹象。在接种后第3天和第5天，从所有鸭子的口咽拭子和泄殖腔拭子中采集标本，以滴定鸡蛋中的病毒。
遗传和系统发育分析。使用RNeasy Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）从尿囊液中提取病毒RNA并进行反转录。使用片段特异性引物（引物序列可根据要求提供）进行PCR扩增。PCR产物用QIA-quick-PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化，并用CEQ-DTCS-quick-Start试剂盒在CEQ8000 DNA测序仪（Beckman-Coulter）上测序。序列数据用seqman公司程序（DNASTAR，Madison，WI）和核苷酸序列进行了比较，并用大木脂素程序（DNASTAR）。
核苷酸序列接入数。本研究中获得的核苷酸序列可从GenBank（登录号：。{“类型”：“entrez-nucotide-range”，“属性”：{“文本”：“AY585357-AY585524”，“开始项”：“EY585357”，“结束项”：”AY585524'，“开始term_id”：“47156268”，“end_term_id“：”47156266“}}AY585357-AY585524).
结果
抗原分析。用参考抗血清进行的HI和神经氨酸酶抑制试验表明，每种病毒都属于H5N1亚型。这些病毒具有相似的HI和神经氨酸酶抑制反应模式，表明它们与GSGD/1/96关系最密切（结果未显示）。从1999年至2002年分离的21种H5N1病毒没有显示抗原漂移的证据；即，它们的异源HI滴度比同源HI滴数低4倍（数据未显示）。
鸡的研究。我们使用IVPI和国际兽疫局推荐的标准来检测病毒分离物在鸡中的致病性。根据这些标准，所有分离物都具有致病性（IVPI>1.2）(). 然而，一个()早期分离物中（DKGX/07/99）只杀死了静脉接种的一半鸡，其中两个早期分离物的平均死亡时间（MDT）为静脉接种后8天。2000年H5N1分离株在接种后MDT表现出一定的多样性（3.3到>8.7），而2001年和2002年分离株在注射后MDT在1.7到4之间（唯一的例外是DKGX/53/02的MDT>6.5）。IVPI随时间呈上升趋势。在1999年和2000年分离的7株病毒中，IVPI为1.2-3.0，而在2001年和2002年分离的14株病毒中有13株病毒的IVPI为2.9-3.0。例外是DKGX/53/02，其IVPI（2.1）和MDT（>6.5天）值表明致病性较低。
接种后第2天或第3天死亡的所有鸡都有表明病毒系统复制的病变。这些疾病包括脑组织中度坏死、伴有水肿的严重组织细胞间质性肺炎、胰腺严重坏死、脾脏轻度坏死、轻度至中度肾病和囊轻度至重度坏死。只有DKGX/07/99显示非系统性复制（仅涉及肺部）。
小鼠研究。自1997年以来分离出的大多数欧亚支系高致病性禽流感病毒能够在哺乳动物中复制(4,5,15). 在小鼠中测试其致病性之前，我们通过三个限制稀释周期在特定无色素鸡胚中对每个分离物进行生物克隆。未尝试在小鼠中进行盲传代。我们的数据是从小鼠的单次静脉注射获得的。
基于他们复制并导致体重减轻和死亡的能力(和)H5N1分离株被分为四组。当接种10天后，在小鼠的任何器官中都检测不到病毒时6电子身份证件50并且未观察到小鼠体重减轻和死亡，该病毒在小鼠体内将被视为无致病性。可在小鼠体内复制的病毒进一步分为低（MLD50>6.5日志10电子身份证件50)，中等（3对数10电子身份证件50<MLD50≤6.5对数10电子身份证件50)，或高（MLD50≤3 log10电子身份证件50)根据其对小鼠的致死性进行致病性分组。非致病组包括七种病毒（包括GSGD/1/96），它们在小鼠体内没有复制，也没有引起体重减轻；只有一种病毒（DKGX/22/01）诱导了血清转化。低致病性组包含四种仅在肺部复制到中等滴度的病毒；所有这些小鼠在接种后第14天血清转化。这些病毒的高剂量（>106.5电子身份证件50)被要求杀死老鼠。中等偏生组的七种病毒均在小鼠肺部复制；在脾脏中检测到低水平的两种病毒，在大脑中检测到极低水平的一种分离物（DKSH/8/01）。所有这些病毒都会在小鼠中造成致命感染；但是高剂量的病毒（104到106电子身份证件50)需要，MLD50范围为4.7至6.4 log10电子身份证件50四种高致病性病毒在小鼠肺部复制到高滴度，在脾脏、肾脏和大脑中检测到病毒，表明系统性感染。MLD公司50该组病毒总数<2.3 log10电子身份证件50.
接种代表四种病理类型的H5N1鸭流感病毒的小鼠体重变化。每组5只小鼠经静脉接种10只6电子身份证件50（50μl）DKGX/22/01（⋄）（非致病性）、DKGD/07/00（○）（低致病性），DKSH/13/01（φ）（中等致病性）或DKFJ/01/02（*）（高致病性）病毒或PBS作为对照（□），每日称重14天。
表2。
H5N1病毒在小鼠体内的复制和毒力
| 病毒在器官中的复制，日志10电子身份证件50/毫升*
| | | | |
|---|
| 病毒 | 肺 | 脾脏 | 肾 | 大脑 | 血清转化† | 百万美元50，日志10电子身份证件50 | 病理类型‡ | 基因型§ |
|---|
| GSGD/1/96 | - | - | - | - | 不 | >6.5 | 不 | A类 |
| DKGX/07/99年 | - | - | - | - | 不 | >6.5 | 不 | B类 |
| 丹麦福焦/19/00 | - | - | - | - | 不 | >6.5 | 不 | C |
| 丹麦GD/12/00 | - | - | - | - | 不 | >6.5 | 不 | A类 |
| DKZJ/100年11月 | - | - | - | - | 不 | >6.5 | 不 | A类 |
| DKZJ/52/00号 | - | - | - | - | 不 | >6.5 | 不 | D类 |
| DKGX/01年22月 | - | - | - | - | 是的 | >6.5 | 不 | D类 |
| 丹麦GD/07/00 | 3.7 ± 0.1 | - | - | - | 是的 | >6.5 | 低 | A类 |
| DKGD/1年1月 | 1.8 ± 0.7 | - | - | - | 是的 | >6.5 | 低 | D类 |
| 2001年7月17日 | 1.4 ± 0.4 | - | - | - | 是的 | >6.5 | 低 | D类 |
| DKGX/53/02号 | 3.2 ± 0.5 | - | - | - | 是的 | >6.5 | 低 | 我 |
| 丹麦GD/40/00 | 3.9 ± 0.5 | + | - | - | 是的 | 6.4 | 中部 | E类 |
| DKGX/50/01号 | 4.0 ± 0.7 | + | - | - | 是的 | 6.4 | 中部 | G公司 |
| 丹麦夏令时/13/01 | 2.7 ± 1.4 | - | - | - | 是的 | 5 | 中部 | D类 |
| 丹麦夏令时/38/01 | 3.4 ± 1.2 | 1.8±0.7 | - | - | 是的 | 5.8 | 中部 | F类 |
| DKSH/01年8月 | 5.9 ± 0.4 | 1.7±1.2 | + | + | ND（无损检测） | 4.7 | 中部 | A类 |
| DKGD/22/02号 | 3.2 ± 1.0 | - | - | - | ND（无损检测） | 4.8 | 中部 | D类 |
| 丹麦夏令时/37/02 | 4.8 ± 0.6 | + | - | - | ND（无损检测） | 5.3 | 中部 | H（H） |
| DKGX/35/01号 | 5.1 ± 2.2 | 1.3 ± 0.8 | + | + | ND（无损检测） | 1.5 | 高 | D类 |
| 丹麦夏令时/35/02 | 5.6 ± 0.1 | + | + | + | ND（无损检测） | 2.3 | 高 | F类 |
| DKFJ01/02号 | 6.5 ± 0.3 | 2.0 ± 0.6 | + | 1.6 ± 0.5 | ND（无损检测） | <0.5 | 高 | 我 |
| DKFJ/13/02号 | 6.6 ± 0.2 | 1.2 ± 0.2 | 1.4 ± 0.1 | + | ND（无损检测） | <0.5 | 高 | H（H） |
我们观察到，随着时间的推移，对小鼠的致病性水平增加：1999年和2000年分离的病毒对小鼠的病原性低于2001年和2002年分离的，尽管2000年的一个分离物（DKGD/40/00）属于中等致病性组，而2002年的一种分离物（KGX/53/02）显示出低致病性。
鸭子研究。野鸭是禽流感病毒的天然宿主。所有亚型的禽流感病毒都是从世界各地的野鸭中分离出来的，历史上没有发现任何分离株，包括高致病性H5和H7毒株，会导致鸭子出现疾病迹象或死亡(17). 令人惊讶的是，2002年11月从香港野生水禽中分离出的H5N1病毒导致严重的神经系统疾病，并导致野鸭和实验室鸭子死亡(7). 我们用六种H5N1分离株（代表本研究中分析的分离株）给五只鸭子接种，其中包括来自小鼠高致病性亚群的三种病毒(). 在鸭子身上复制的六个H5N1分离株中有五个；它们从气管或泄殖腔脱落，脱落量为2.0–4.3 log10电子身份证件50/毫升。这些病毒并没有传播给隔离区内的接触鸟类，也没有任何病毒导致鸭子出现疾病症状或死亡。
表3。
H5N1病毒在家鸭体内的复制和传播
| 接种后第3天病毒脱落
| 接种后第5天病毒脱落
|
|---|
| 口咽的
| 泄殖腔
| 口咽的
| 泄殖腔
|
|---|
| 病毒 | 鸟类数量/总数 | 病毒滴度，log10电子身份证件50/毫升 | 鸟类数量/总数 | 病毒滴度，log10电子身份证件50/毫升 | 鸟类数量/总数 | 病毒滴度，对数10电子身份证件50/毫升 | 鸟类数量/总数 | 病毒滴度，log10电子身份证件50/毫升 |
|---|
| 丹麦GD/12/00 | 0/5 | ND（无损检测） | 0/5 | ND（无损检测） | 0/5 | ND（无损检测） | 0/5 | ND（无损检测） |
| DKZJ/100年11月 | 3/5 | ≤2.0-4.3 | 2/5 | ≤2.0-2.7 | 0/5 | ND（无损检测） | 0/5 | ND（无损检测） |
| DKFJ/17/01号 | 1/5 | ≤2.0-2.7 | 0/5 | ND（无损检测） | 2/5 | ≤2.0-3.0 | 1/5 | ≤2.0-2.7 |
| DKGX/35/01号 | 2/5 | ≤2.0-4.0 | 3/5 | ≤2.0至4.0 | 1/5 | ≤2.0-3.0 | 1/5 | ≤2.0-2.7 |
| DKSH35/02号 | 4/5 | ≤2.0-3.5 | 2/5 | ≤2.0-4.3 | 0/5 | ND（无损检测） | 0/5 | ND（无损检测） |
| DKFJ/01/02号 | 0/5 | ND（无损检测） | 1/5 | ≤2.0-3.5 | 0/5 | ND（无损检测） | 0/5 | ND（无损检测） |
分子和系统发育分析。为了确定我们观察的分子基础，对21个分离物中每个分离物的整个基因组进行了测序。将这些序列与GenBank获得的代表性H5N1序列进行比较，包括GSGD/1/96的序列，以及1997年HK/156/97、HK/483/97和HK/486/97的香港人分离株的序列。对从中国出口韩国的鸭肉中分离得到的A/duck/Anyang/av-1/01（H5N1）（DK/AY/01）的血凝素（HA）和NA序列进行了系统发育分析。
21株H5N1分离株的HA基因与GSGD/1/96的HA基因核苷酸同源性为97.4–98.9%，与HK/97的HA基因同源性为96.7–98%。所有21个分离株在HA（-RRKKR-）的裂解位点都含有一系列碱性氨基酸，这是鸡中高致病性流感病毒的特征。HA基因的系统发育分析()显示DKGX/07/99与其余菌株位于不同的分支上。2000年4个鸭分离物与GSGD/1/96和HK/97分离物在系统发育树上形成一个叉。2001年的大多数分离株与2002年的分离株形成了一个单独的分支，从韩国鸭肉中分离出的病毒（DKAY/01）是2002年分离株的基础。
HA的系统发育树(一)，不适用(b条)，PB2(c（c）)，PB1(d日)，宾夕法尼亚州(e（电子）)、NP(（f）)，男(克)、和NS(小时)分析了H5N1甲型流感病毒的基因。这些树是使用大木脂素基于以下基因序列的软件（DNASTAR）：HA的核苷酸29–1732（1704 bp），NA的核苷酸21–1367或1427（1347或1407 bp），PB2的核苷酸28–2304（2276 bp），PB1的核苷酸25–2295（2271 bp），PA的核苷酸25-2172（2148 bp），NP的核苷酸45–1539（1495 bp），M的核苷酸26–781（756 bp），NS的核苷酸27–708或725（682或699 bp）。每对分支的长度表示序列对之间的距离，树底部的单位表示替换事件的数量。颜色表示在小鼠中鉴定的病理类型：红色，高致病性；粉红色，致病性中等；绿色，致病性低；黑色，无致病性。列出病毒的名称；划线病毒序列来自GenBank。
H5N1鸭分离物的NA基因与GSGD/1/96的NA基因（96.4-98.3%同源性）的关系比与HK/97分离物的NA基因（89.5-92%同源性）更密切。系统发育分析表明，在我们的鸭分离物中，HK/97 NAs与NAs形成了一个独立的分支(). 鸭分离物的NA分为两个叉，DKGX/07/99位于叉B1的底部，GSGD/1/96位于叉B2的底部。每个分叉都含有2000年至2002年分离的病毒。DK/AY/01位于源自GSGD/1/96的叉中。对推导出的氨基酸序列的分析表明，来源于GSGD/1/96的叉中的所有病毒在NA茎中都有20-aa的缺失（残基49-68），而GSGD/1/66本身没有。这种NA柄缺失与从人类分离的HK/97病毒（残基54–72）中发现的19-aa缺失不同，但与之重叠。来源于DKGX/07/99的分叉中的病毒NA没有缺失。
22种H5N1病毒的PB2、PB1和PA基因的系统发育树非常相似(). 人HK/97分离物形成一个单独的分支，而鸭分离物和GSGD/1/96分为两个主要分支，其中早期分离物主要位于一个分支中。在PB2的系统发育树中，B分支的两个分支的基因具有很高的同源性，属于一个谱系。另一方面，PB1和PA基因的B1和B2分叉具有90-93%的同源性，可以认为是不同的谱系。核蛋白（NP）系统发育树()不同；三个鸭分离物（DKSH/35/02、DKSH/38/01和DKGX/50/01）的NP基因形成一个单独的分支，而人类HK/97 NP形成一个分支，其他H5N1分离物形成多个姐妹分支，与时间或地理区域不一致。M（基质）基因的系统发育树()与聚合酶基因树相似，但DKFJ/19/00和DKGD/40/00的M基因位于B分支的不同分支上。
鸭病毒的NS基因被分离为两个等位基因(). 四种鸭病毒和GSGD/1/96被包括在A类等位基因，而包括人类HK/97病毒在内的其余基因位于B类等位基因，进一步分为两个分支。推导出的B分支B1分支中所有病毒的NS氨基酸序列B类等位基因有15-nt缺失，导致NS蛋白中5-aa缺失（位置80-84）。
在基因组多样性的基础上，病毒形成了九种基因型，其进化和关系如值得注意的是，在不同的基因型中发现了相同的PB2、HA和NA基因。在小鼠中，这些病毒的基因型和病理类型之间没有紧密联系；然而，同一基因型的病毒，尤其是a型和D型病毒的致病性逐渐增加，有一个明确的时间模式。DKSH/38/01和DKSH/35/02属于同一基因型（F），但DKSH/35/02为10三-对小鼠的致死性是DKSH/38/01的两倍。基因型H和I组中两种病毒的毒力差异大于105×和>106分别为×。这些结果表明，决定其致病潜力的可能是个体突变，而不是基因组群。
1999-2002年中国南方地区鸭源H5N1病毒的基因型进化。每个示意性病毒颗粒中的八个基因片段是（从上到下）PB2、PB1、聚合酶（PA）、HA、NP、NA、基质（M）和NS基因。相同谱系的基因以相同的颜色显示。大写字母表示基因型。列出了每个基因型的病毒。
讨论
本研究描述了自GSGD/1/96（H5N1）被报道以来，从中国大陆鸭群中分离出的以前没有特征的H5N1流感病毒(18,19). 我们的研究结果表明，从1999年至2002年，从中国沿海省份（广东和上海之间）表面上健康的鸭子中分离出高致病性H5N1流感病毒。这些H5N1分离株对抗血清的反应类似，并且具有系统发育同源的HA基因。除一种病毒外，所有这些病毒都能在鸡体内引起致命的、广泛的全身感染，并且在HA裂解位点都含有一系列与高致病性相关的碱性氨基酸。
我们的研究结果表明，1999年至2002年在中国家鸭中传播的H5N1流感病毒获得了在小鼠体内复制的能力，并在没有适应的情况下导致全身感染和死亡。一些研究人员报告说，从人类分离出的H5N1流感病毒对小鼠是致命的(20–25). 据报道，许多因素与H5N1致病性有关。反向遗传学研究表明，PB2蛋白的627残基和HA裂解位点的一系列碱性氨基酸对小鼠H5N1致病性至关重要(26). 其他研究表明NS基因及其调节细胞因子反应的能力(27,28). 反向遗传学研究发现，人类分离物A/HK/156/97（H5N1）NS1分子的92残基与猪严重病理的诱导有关(27). 然而，所有H5N1鸭病毒都在PB2中保留Glu-627氨基酸残基，在NS1中保留Asp-92氨基酸残基。它们在受体结合位点包含常见的禽HA1残基Gln-226和Gly-228（H3编号）。因此，这些残基可能与H5N1鸭病毒在小鼠体内的复制和毒力差异无关。剩下的重要问题是H5N1病毒何时以及如何在哺乳动物中获得复制能力。
我们的结果表明，H5N1病毒在家鸭中传播时，逐渐获得了使其在小鼠中致死的特性。这一发现的一个可能解释是鸭H5N1病毒向人类传播、病毒在人类中的选择性进化以及随后向鸭的传播。人类感染H5N1的血清学证据有限，人与人之间传播H5N1病毒的证据有限(29). 现有证据表明，自1997年以来，亚洲的H5N1病毒已导致有限的严重或致命人类感染(三,4)但尚未在人与人之间传播。尽管有证据表明H9N2禽流感病毒已从鸭传给其他家禽，然后又传回鸭，但很难想象病毒会从人传回鸭(30).
禽流感病毒向哺乳动物传播的分子基础尚未解决。它当然涉及多种病毒基因，包括HA。已经提出了一些鸟类基因星座来促进向哺乳动物的传播。1997年美国出现在猪身上的H3N2流感病毒是三重重配体，含有人类、猪和禽流感病毒的基因片段(31). 这些H3N2三重相合病毒在猪中高度传播，并已在美国广泛传播(32). 同样，目前在欧洲广泛传播的H1N1猪流感病毒含有1979年获得的禽流感病毒基因。因此，当禽流感病毒基因是某些基因群的一部分时，它们似乎能够促进哺乳动物物种之间的传播。鸭体内不同基因型H5N1病毒的进化可能提供了允许哺乳动物传播的基因群。
另一种可能性是猪（假定的中间宿主）参与选择。在本研究中分离出H5N1病毒的中国地区，猪和鸭被安置在附近，特别是在农村，那里的家庭通常拥有少量猪和鸭。我们的工作假设是，H5N1病毒通过猪和鸭之间可能传播产生的选择压力，逐渐获得在哺乳动物中复制的能力。迄今为止，没有从猪中分离出H5N1病毒的报告，尽管猪已被实验感染H5N1(33). 我们最近获得了福建省猪感染H5N1病毒的初步病毒学和血清学证据。
事实上，这里研究的一种H5N1病毒未能感染接种过的鸭子，这与我们的假设不符，因为没有传播给接触过的鸭。然而，实验室实验无法模拟现场条件，其中可能包括压力以及与多种细菌和病毒因子的复合感染。此外，在隔离装置中，病毒向接触鸭的传播受到限制，受感染动物的粪便通过滤网落入锅中，强制空气供应经过高效空气过滤器过滤。然而，我们可以从我们的研究结果中得出结论，本研究中2002年从鸭子中分离出的H5N1病毒对鸭子的致死性并不高，2002年11月从香港野生水鸟中分离到的H5N1病毒对鸭的致死性也不高(7).
从表面上健康的鸭子中分离出鸡致死性H5N1病毒解释了出口到日本和韩国的鸭肉中存在H5N1禽流感病毒(34). 然而，我们对21个分离株的详细基因型分析表明，1999-2002年在中国大陆鸭群中传播的H5N1病毒与Guan报告的香港活禽市场中的H5N1病毒不同等人。(6). 这些鸭H5N1病毒与2004年中国分离的H5N1型病毒之间的关系尚待确定。
HA和PB2基因似乎在小鼠H5N1病毒的复制和致病性中起着重要作用(26). 我们的研究结果表明，H5N1流感病毒的多种基因型在哺乳动物中具有致病性。显然，H5N1流感病毒正在亚洲继续发展。需要继续监测，还需要详细描述向哺乳动物传播所需的基因星座和特定残基。
致谢
K.Y.和H.C.是计划和协调这些研究的共同负责人；R.G.W.设计了部分实验，并与H.C.Z.和G.D.共同编写了报告。Li和G.D.在L.Z.、Z.Liu和P.J.的协助下，对鸡和小鼠的研究做出了同等贡献，并进行了序列分析。；G.T.和Y.L.进行了菌株监测并进行了鸭子实验。我们感谢Denis Alexander博士（国际兽疫局参考实验室）提供禽流感病毒参考株和抗血清；卡罗尔·沃尔什行政协助；莎伦·纳龙（Sharon Naron）提供编辑协助。本研究得到国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目G1999011905和G19990111902；中国国家科技“十五”计划资助2002BA514A-15；国立卫生研究院拨款AI95357（发给R.G.W.）；以及美国-黎巴嫩-叙利亚联合慈善机构。
笔记
缩写：DK，duck；电子身份证件50，鸡蛋50%感染剂量；福建福建；广东省；GS，鹅；广西GX；HA、血凝素；香港、香港；IVPI，静脉致病性指数；MDT，平均死亡时间；NA，神经氨酸酶；NP，核蛋白；NS，非结构性；上海，上海；浙江ZJ；i.n.，鼻内注射。
数据保存：本文中报告的序列已保存在GenBank数据库中（登录号AY585357–AY585524）。
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