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美国国家科学院院刊。2004年7月13日；101(28): 10458–10463.
2004年7月6日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0401827101
PMCID公司：项目经理478591
PMID：15240883

阻遏因子1沉默转录因子/神经限制性沉默因子（REST/NRSF）靶基因的全基因组分析

亚历山大·布鲁斯,*† 伊恩·唐纳森,*†‡ 伊恩·C·伍德,* 萨莉·耶伯里,* 迈克尔·萨多夫斯基,* 迈克尔·查普曼,‡ 伯托尔·戈特根斯,‡和诺埃尔·J·巴克利*§
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

全基因组测序项目的完成为生命提供了遗传指令。然而，尽管基因编码区的鉴定取得了进展，但转录调控基序的定位进展得较慢。为了了解如何建立和维持不同的表达谱，需要更好地了解这些序列及其反作用因子。这里我们使用了一个组合生物信息学和生物化学方法，以确定人类、小鼠和小鼠体内RE1沉默转录因子/神经限制性沉默因子（REST/NRSF）的结合位点[阻遏因子1/神经限制性消音因子（RE1/NRSE）]和潜在靶基因河豚基因组。我们利用全基因组分析鉴定了1892名人类、1894名小鼠和554名河豚RE1/NRSE并在可搜索的数据库中显示其位置和基因链接。此外，我们确定了体内RE1/NRSE的不同亚群与内源性REST/NRSF水平相互作用的层次结构，而其他亚群仅在REST/NRSF水平升高时才作为真正的转录控制元件发挥作用。这些数据表明，单个RE1/NRSE位点与特定细胞类型内的REST/NRSF的相互作用存在差异。这种生物信息学和生物化学相结合的方法有助于说明转录因子与其潜在结合位点相互作用并调节靶基因的选择性方式。此外，该方法为与建立神经元基因表达特定模式相关的特定转录因子结合位点提供了独特的全基因组图谱。

多细胞生物中的基因表达模式主要是通过转录因子与靶基因的相互作用和随后的转录调控来建立和维持的。然而，大多数转录因子的直接靶基因仍然未知。为了最终了解多个转录因子的相互作用如何调节全球基因表达，有必要确定所有转录因子的所有靶基因。这一过程主要依赖于对特定基因启动子序列的个别研究，以确定调控序列元素。尽管这些研究产生了大量有价值的信息，但它们并没有提供整个基因组中转录因子结合位点的完整概述。基因组测序项目最近取得的成功为生物信息学领域提供了实现这一目标所需的数据，允许查询基因组序列以获得一致的转录因子结合位点。然而，这样的生物信息学大多数转录因子结合位点（≈4–8bp）的短且通常是冗余的性质阻碍了分析，导致识别的基序频率比少数真正的结合位点高出许多倍。因此，战略已经演变为使这种分析与上下文相关。搜索同源位点簇(1–4)，接近其他监管要素(5–7)或CpG岛和核心促进者(2,8)已成功用于识别真正的转录因子结合位点，但计算量大。然而，设计用于搜索大的调控基序（偶然发生的频率应该很低）的简单模式匹配算法不需要这种上下文依赖性，并提供了识别给定转录因子的一整套靶基因的机会。

在这里，我们重点研究了阻遏因子1（RE1），这是一种沉默因子[也称为神经限制性沉默因子（NRSE）]，最初发现于电压门控钠II型通道(钠V1.2)和颈上神经节10(SCG10系列)基因(9,10). 随后在30多个基因的调控区域中发现了这个21-bp的元件，其中大多数是神经元特异性的(11–20). 必需的Kruppel型锌指转录抑制因子RE1沉默转录因子（REST；也称为神经限制性沉默因子或NRSF）与RE1相互作用，在几种脊椎动物的非神经组织中检测到广泛的REST表达，包括非洲爪蟾、红色河豚、小鸡、老鼠、老鼠和人类(21,22). REST通过招募两种组蛋白去乙酰化酶复合物抑制基因表达(23–27). REST的拟议作用是一种转录沉默子，通过沉默非神经组织中这些基因的表达，限制神经系统中神经元基因的表达(21,22). 然而，REST的作用体内更加模糊。REST mRNA存在于成年中枢神经系统神经元中(28)在缺血或癫痫发作时，其水平会升高(28,29)最近，研究表明REST蛋白与亨廷顿病基因产物亨廷顿蛋白相互作用(30). 在这种背景下，我们已经着手在人类、小鼠和河豚使用生物信息学和生物化学方法相结合的方法。此外，我们使用染色质免疫沉淀（ChIP）和表达分析来证明REST与其内源性靶基因的相互作用。这项研究强调了一个事实，即在同一细胞群中，单个转录因子可以具有高度选择性的靶基因招募模式。

材料和方法

RE1数据库建设。对人类基因组GenBank格式的DNA序列平面文件（下载自合奏版本11.31并组织为重叠克隆）珍珠受核心17核苷酸正则表达模式约束的脚本。该模式代表RE1一致序列，由32个已知RE1序列的比对得出，这些序列包含反映已知变化的简并（类似于参考文献。31). 搜索输出和相应的注释或外部引用(瑞士人-保护版本40.43和颤抖第22.13版蛋白质序列数据库）用于指定基因描述，并测定每条链上100 kb以内的注释基因。鼠标和河豚基因组也进行了类似的检查（通过使用合奏版本11.3和11.2）。在使用的搜索输出中确定CpG岛的接近度新cpgreport程序（浮雕2002，www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS)使用默认设置，并使用屏幕删除重复基因组区域中的搜索点击。创建了搜索结果的mySQL关系数据库（RE1db）（使用4.10α版），可以在http://bioinformatics.leeds.ac.uk/group/online/RE1db/RE1db_home.htm.

细胞培养。JTC-19和U373细胞在含有6g/l青霉素、10g/l链霉素和2mM的10%FCS的DMEM中培养我-37°C下5%CO中的谷氨酰胺2.

炸薯条。使用抗-REST抗体（P-18，Santa Cruz生物技术）、抗组蛋白H3（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）和正常兔IgG（Sigma）对U373细胞进行ChIP分析。ChIP基本上按照参考文献所述进行。27用实时PCR（iQ Cycler，Bio-Rad）分析纯化的DNA，并在20μl实时PCR中使用2μl作为模板，重复进行。引物浓度为300 nM。单个引物序列可用作支持信息，包括表1-4和图6，并发布在PNAS网站上。

腺病毒的构建、扩增和感染。如参考文献所述产生腺病毒载体。32约109感染JTC-19细胞或U373细胞时，使用每毫升病毒颗粒的噬菌体形成单位。如参考文献所述，48小时后采集全细胞蛋白、RNA和染色质。27和32.

电动迁移分析（EMSA）。Klenow填充Bgl公司pGL3NaII生成的悬垂(32)聚丙烯酰胺电泳纯化产生150-bp，钠V1.2RE1、[32P] dATP标记的DNA探针。核蛋白的制备如参考文献所述。32和EMSA的执行详见参考。33（请参见支持信息作为竞争对手的互补脱氧寡核苷酸序列）。

RT-PCR分析。使用MMLV RNase H（–）逆转录酶（Promega）逆转录提取的RNA，如参考文献所述。32用两微升的cDNA作为模板进行20μl PCR反应，并用脱氧寡核苷酸引物设计假定的REST/NRSF靶基因（参见辅助信息). PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色。

结果

硅胶材质人、鼠和人RE1位点的鉴定河豚基因组。我们的最初目标是通过生物信息学方法识别人类和小鼠基因组中所有潜在的RE1。然而河豚基因组(34)促使我们检查它是否有任何潜在的REST同源物，随后我们鉴定了一个部分基因序列，该序列与人类和小鼠REST的DNA结合结构域（ENSF00000003748）显示52%的氨基酸序列同一性。因此，我们扩展了生物信息学搜索，将河豚基因组。在人类、小鼠、大鼠、鸡、，爪蟾、达尼奥雷里奥（随后确定为ENS-DARG0000007222），以及河豚; 而中不存在REST果蝇属这表明REST可能是在过去5亿年内首次出现的，与脊椎动物的进化同步。基于32个已知RE1元素NT（T/C）AG（A/C）（A/G）CCNN（A/G）G（A/C）（G/S）AG的序列的一致性RE1用于搜索人类、小鼠和河豚 合奏基因组序列数据库珍珠脚本。从这些搜索中获得的信息已整理成可搜索的在线数据库：RE1db(http://bioinformatics.leeds.ac.uk/group/online/RE1db/RE1db_home.htm). RE1db数据库包括RE1序列的精确信息、染色体/连体内的位置/方向，以及与RE1重叠或位于100 kb内的最近转录单位。通过将搜索限制在外显子、内含子或基因间序列（与注释的转录起始位点的距离不同）或包含CpG岛或与其相邻（<500 bp）的区域内，可以施加进一步的限制。也可以通过使用合奏基因标识符，从而确定特定基因是否定位于RE1。在人类、小鼠和河豚基因组分别为1892、1894和554个，有355、358和416个转录单位在其5′区具有10kb内的RE1，593、564和181个基因含有基因内RE1（因为RE1的浓缩性质河豚基因组中，任何单个RE1的10kb范围内可能存在一个以上的转录单位）。人类、小鼠和河豚基因组在支持信息在RE1db数据库中可以在线找到综合信息。

发现的基因分类硅胶材质.然后，我们通过使用我们的生物信息学方法对潜在的REST靶基因进行分类合奏基因组注释(图1). 已知至少40%的已鉴定基因在神经系统中表达，这与目前REST作为神经元基因表达的消音器或阻遏物的功能模型一致(24,33,35,36). 这些基因包括编码神经递质受体（例如M4毒蕈碱、D3多巴胺和γ-氨基丁酸型β3受体）、转运体（例如γ-氨基丁酸转运体4）和神经营养受体[例如神经营养酪氨酸激酶受体3型（NTRK3）和胶质细胞系衍生神经营养因子受体]的基因以及编码参与囊泡运输和融合的蛋白质的蛋白质[例如，突触体相关蛋白，25kDa（SNAP25）；突触结合蛋白IV、V和VII；突触蛋白8；和Rab3）、离子通道（例如NaV1.3、Kv3.4和Cavl.3）和轴突导向[例如，SCG10、stathmin 3、netrin-2、roundabout、semaphorin 5A、L1细胞粘附分子（L1CAM）]也有许多基因编码不具有明显神经元特异功能的蛋白质，例如那些参与细胞代谢过程的蛋白质（例如过氧化物酶体和蛋白质组成分）。此外，还有一些基因指定执行神经元功能但在非神经元组织中也需要的蛋白质，包括那些参与心血管张力调节的蛋白质，如内皮型一氧化氮合酶、血管活性肠肽、心钠素、脑钠肽和KCNH2。在RE1db数据库中可以在线找到一份全面的列表。

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RE1db数据库中假定REST靶基因的分配可以分配给10个功能组中的1个。该数据库包括关于RE1序列的准确信息、染色体/连体中的位置/方向，以及与RE1重叠或位于100 kb范围内的最近转录单位的信息，可以在http://bioinformatics.leeds.ac.uk/group/online/RE1db/RE1db_home.htm.

善意RE1序列的鉴定。接下来，我们希望确定上面鉴定的哪些RE1序列代表了真正的调控序列，即哪些位点可以结合REST在体外为此，我们开展了一系列EMSA。本研究中使用的RE1共识序列是退化的，共允许4096个排列。其中，892、944和291在人类、小鼠和河豚基因组。将人类基因组中每个RE1变异发生的频率与小鼠和河豚基因组（见表1）。我们推断，由于RE1在许多基因的调控区域中具有保守性，因此具有较高频率的RE1更有可能在功能上发挥重要作用。因此，EMSA分析是通过使用单个RE1的100倍摩尔过量量（源自表1）来进行的，以竞争由感染了携带REST DNA结合域的腺病毒（Ad）的JTC19细胞的全细胞蛋白与来源于钠V1.2基因(图2一). RE1来源于M4级毒蕈碱受体基因作为阳性对照(16,20). RE1来源于P2Y4嘌呤能受体(第二个RY4),NMDA谷氨酸受体2a(GRIN2a公司),电压门控钙2+ 通道γ2（CACNG2），谷氨酸受体KA1（网格4），以及神经丝三联体H(NEFH公司)所有基因在100倍过剩时都能完全抑制凝胶位移；而RE1来源于新瑞辛III(NRXN3号机组),神经元五肽受体(NPTXR公司),SNAP25、NTRK3G蛋白信号转导7（RGs7）基因的调节器产生部分抑制。我们推断，这种表达变化可能反映了这些RE1对EMSA中使用的REST DNA-结合域的相对结合亲和力的差异（见下文）。没有竞争的序列（hR E1ID51、hR E1ID 184和hRE1ID315）缺乏与任何注释基因的接近性，并且只出现在人类基因组的重复区域内，在小鼠或河豚。EMSA分析显示hRE1ID51无法绑定REST，如所示支持信息有趣的是，小鼠基因组特有的最普遍的RE1序列（mRE1ID100）也不能结合REST(图2一). 在我们对人类基因组的搜索和之前的研究中发现的所有功能性RE1的每个位置的每个碱基的相对发生率的总体一致序列显示在图2b条.

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与潜在REST靶基因相关的假定RE1序列可以与REST相互作用(一)EMSA分析是通过使用100倍摩尔过量的假定RE1来竞争含有REST DNA结合域的核提取物与来自于钠V1.2基因。(b条)根据EMSA数据得出的共识RE1，该数据显示了RE1每个位置上单个碱基的相对出现频率。单字母代码是国际生物化学联合会命名委员会的标准格式，用于核酸序列中不完全指定的碱基(www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/misc/naseq.html).

REST对内源性基因的占有率。确定了能够绑定REST的RE1在体外，我们继续研究REST与其内源性靶基因的相互作用。为此，我们对U373胶质瘤细胞进行了ChIP分析。之所以选择U373细胞，是因为尽管REST在非神经细胞中所起的作用已被广泛研究，但其在神经细胞中的作用尚不清楚。我们首先通过使用EMSA证实U373表达功能性REST蛋白，以证明U373的核蛋白提取物产生特定的蛋白质/DNA复合物，该复合物可被抗REST抗体识别并“超转移”(图3一). 然后通过ChIP探测内源性U373 REST与已发表和假定靶基因的RE1之间的相互作用(图3b条). 有趣的是，尽管存在功能性U373 REST蛋白，但所研究的六个已知靶基因中的五个的RE1，SCG10系列(9),GRIN2a公司(13),突触素1(同步1) (18)、突触素(SYNPHY公司) (31)、和脑源性神经营养因子(BDNF公司) (19)未使用抗REST抗体进行富集。只有L1CAM公司基因RE1(14,15)被富集了。六个RE1与P2RY4、NPTXR、NRXN3、NTRK3、NEFH、和国民账户体系25基因也进行了测试。其中，只有RE1国民账户体系25基因得到了丰富。这些数据表明，U373细胞中只有一部分RE1被占据（或L1CAM公司和国民账户体系25基因RE1表现出更大的REST占有率）。因为所有这些RE1元素都能够绑定REST在体外(图2)，我们考虑了内源性REST水平可能限制本地基因的占用。为了验证这一假设，我们使用Ad结构（Ad:REST）来驱动U373细胞中的高水平REST表达。在所有情况下，除了SCG10系列RE1，REST过度表达导致可检测到的占用水平(图4b条)此外，该实验还表明，内源性REST招募的明显缺乏并不是由于染色质环境对REST表位的掩盖造成的。有趣的是，国民账户体系25和L1CAM公司在自然表达或过度表达的REST中，显示出比其他基因座更大的REST占有率。对RE1侧翼序列的仔细检查显示，在原始RE1的30 bp内，仅在国民账户体系25和L1CAM公司基因。第二个位点偏离了本研究中使用的一致RE1 1 bp。然而，随后的EMSA分析表明，两个次级RE1位点都能结合REST，尽管亲和力低于初级位点(图4d日). 可以区分三组RE1。高亲和性序列被定义为在0.5μM时产生完全抑制凝胶位移的序列。低亲和性序列是那些需要1μM竞争对手的序列，而那些不产生抑制的序列，即使是在5μM的竞争对手下，也被认为无法结合（见图。​图22和​和4d日4d日和辅助信息). 串联RE1的存在为REST占用率的增加提供了潜在的解释国民账户体系25和L1CAM公司与那些只拥有单一RE1的基因相关的基因。

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REST/NRSF被选择性招募到靶基因。(一)U373蛋白提取物与放射性标记RE1孵育后的EMSA分析钠V1.2基因表现出特定的“转变”(*)在存在抗REST抗体的情况下可以超移位(**)，证实U373细胞核内存在功能性REST蛋白。(b条)使用抗REST抗体对U373细胞进行的ChIP分析显示，只有在RE1的国民账户体系25和L1CAM公司基因。

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过度表达的REST可以与U373细胞中RE1db中识别的RE1相互作用。(一)表达增强GFP或增强GFP和REST（Ad:REST）的Ad载体用于向U373细胞进行转基因传递。从显微照片中增强的GFP荧光可以看出基因传递的效率，而通过使用针对REST和GAPDH的引物，通过RT-PCR可以看到转基因表达。循环编号显示在每个面板的左侧。(b条)U373细胞的ChIP分析。提取染色质并用抗REST抗体沉淀。使用基因特异性引物评估自然U373（填充条）和Ad:REST感染的U373中RE1/NRSE的占有率（开放条）。(c（c）)的序列分析国民账户体系25和L1CAM公司基因RE1侧翼区域揭示了人和小鼠之间存在保守的次级RE1/NRSE。蓝色序列是最初识别的RE1，红色序列是本研究中识别的RE1。(d日)初级RE1（SNAP25 RE1.1）和次级RE1（SNAP25 RE1.2）的EMSA分析。使用0.01–5.0μM未标记RE1进行分析，以竞争凝胶位移(*)由核提取物与放射性标记的RE1孵育产生，RE1来源于钠V1.2基因。

REST对内源性基因表达的调控。在证明了ChIP对REST/NRSF的占用后，我们继续使用RT-PCR来比较未感染U373细胞和感染携带REST（Ad:REST）或显性阴性REST（DNREST）结构的空Ad或Ad的细胞中每个基因的表达水平(图5). 后一种结构仅由REST DNA结合域组成，预计将导致那些需要REST存在才能维持抑制或沉默的基因的去表达。使用Ad:DNREST载体或Ad:REST的感染水平是相同的(图4一). 所有靶基因，除了SCG10系列在天然U373细胞中表达。Ad-：REST感染导致大多数基因进一步受到抑制，包括P2RY4、NPTXR、NRXN3、NTRK3、SYN1、NEFH、SYNPHY、GRIN2a、BDNF、和L1CAM公司仅限国民账户体系25和SCG10系列基因表达未受影响。Ad:DNREST感染只导致国民账户体系25基因。这个SCG10型基因在所有条件下都保持沉默。总的来说，这些结果可以区分四类基因。第一组代表大多数靶基因，包括P2RY4、NPTXR、NRXN3、NTRK3、SYN1、NEFH、SYNPHY、GRIN2a、和BDNF公司基因。这些基因在转录上是活跃的，不被内源性REST所占据，但可以被REST的过度表达所抑制国民账户体系25基因。国民账户体系25也在U373细胞中转录，但受到内源性REST水平的抑制，REST的过度表达导致更大的占有率，但没有进一步的抑制。第三组由L1CAM公司基因。与相同卡扣25，L1CAM转录并被内源性REST占据，但与SNAP25、L1CAM似乎不受内源性REST水平的抑制。抑制只发生在REST过度表达的情况下。最后一组包括SCG10系列不被REST占据并且无论REST或DNREST表达水平如何都保持沉默的基因。除了验证假定的REST靶基因外，本研究还强调了内源性REST优先被招募到特定RE1位点的高度选择性方式，并能够在同一神经细胞内差异调节靶基因表达。

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REST对U373细胞基因表达的调节。对自然细胞和感染了携带REST（Ad:REST）的Ad载体或包含REST DNA结合域的显性阴性结构体的细胞进行mRNA表达水平的RT-PCR分析。

讨论

本研究采用生物信息学和生物化学相结合的方法对RE1位点和REST靶基因进行全基因组鉴定。我们在人类、小鼠和河豚基因组。这些数字远远大于仅凭偶然机会预测的数字（分别为770、653和88）。值得注意的是，这项研究虽然全面，但并未确定所有RE1位点，如在L1CAM公司和国民账户体系25与共识RE1不同的基因(图4c（c）). 然而，重要的是，在该分析中采用保守的一致序列，以尽量减少误报的识别。同样，采纳过于严格的共识可能会导致遗漏真正的目标，因为在一个共识监管要素的背景下被认定为关键的个别基础在替代监管要素的环境下被证明是多余的(31,37).

这个河豚基因组包含38000个基因(34)与哺乳动物的近亲数量相似，但它基本上没有重复的DNA，导致基因组非常紧凑，为365Mb，仅为人类基因组的8%。基于纯粹随机的理由，RE1基序在河豚基因组；然而它实际发生了554次。这一发现表明，大多数这些基序代表真实的RE1位点，表明对潜在REST靶基因数量的估计较低，约为460个。在哺乳动物的基因组中，这个数字可能更高，其中鉴定出的RE1数量更高。询问黑腹果蝇基因组（不含休息同源）证实了这一观察结果，假设RE1的发生率为51(D.黑腹果蝇基因组释放，合奏版本11.3），该数字接近仅凭偶然性预测的39次事件。RE1一致序列的持续出现频率远大于其在表达REST的生物体中出现的几率，这表明大多数出现的RE1与真正的RE1相对应。然而，在河豚基因组表明，哺乳动物基因组中的一些已鉴定序列可能是无功能的，例如那些存在于无法结合REST的重复DNA中的序列在体外(图2). 因此，对RE1db进行了修改，以筛选出出现在已知重复区域中的RE1/NRSE序列。

在脊椎动物基因组测序项目完成之前进行的有限搜索基础上，本文提出的RE1搜索大大扩展了之前使用简单的法斯塔搜索GenBank DNA序列数据库以识别25个候选基因(31). 另一组(38)报告了对RE1的生物信息学搜索，但关于搜索工具的类型或使用的参数的详细信息很少，也没有提供染色体位置、物种或RE1序列的详细信息，这使得比较困难。然而，在研究中列出的75个精选基因中，有60个在这里被鉴定出来（作为RE1db中列出的完整补体的一部分）。这些基因的功能分类揭示了许多基因编码与神经元功能（例如，突触释放和神经传递）有关的蛋白质，这些蛋白质具有特异性或选择性。然而，一些基因产物也在非神经组织中发挥作用，如心钠素、脑钠素、内皮型一氧化氮合酶、血管活性肠肽、KCNH2和电压门控钾型β2通道，所有这些都参与心血管或心脏功能的调节(39–41).

生物信息学和在体外这些方法可以识别潜在的REST绑定站点；然而，两者都不能表明内源性基因是否能够被REST调节体内通过使用ChIP，我们发现单个RE1可以与U373细胞内内源性或升高的REST水平相互作用，从而导致转录抑制。有趣的是，只有国民账户体系25和L1CAM公司基因与U373细胞中的内源性REST相互作用。大多数基因似乎并不与U373 REST的内源性水平相互作用，但在表达水平较高时仍保留结合REST的能力，因此，似乎已“准备好”抑制。这些位点缺乏结合不是由于内源性REST缺乏，因为U373细胞表达可以结合RE1的REST在体外(图4一)，在包含RE1的区域检测到L1CAM公司和国民账户体系25ChIP基因(图4b条). 如何在同一细胞核内建立这种REST–RE1相互作用的优先模式？在l1凸轮和国民账户体系25基因可能解释了REST在这两个位点上的占有率增加。由于这些串联RE1非常接近，因此ChIP无法确定是否存在一个站点的优先占用情况，或者其相对占用率是否会随着REST水平的提高而发生变化。然而，很明显存在这样的可能性，即多个RE1有可能在不同阈值浓度或更大范围的REST浓度下发生抑制。事实上L1CAM公司基因包含2个RE1(图4c（c）)对解释先前的转基因小鼠研究具有重要意义，其中L1CAM公司比较了由l1凸轮启动子和一个在先前特征RE1中突变的启动子(14). 去除一致RE1导致神经嵴、中胚层和外胚层的间充质衍生物中报告基因表达选择性去表达，但不是在表达REST的所有组织中。本研究的一个启示是，可能需要第二个RE1的突变才能在这些其他组织中看到异位表达。

REST可以选择性地结合和调节同一细胞核内的靶基因，这一观察结果与最近的一份报告相一致，该报告显示内源性c-Myc仅在过度表达的c-Myc能够结合的靶基因中的11%检测到(42). 这种与高亲和力位点的关联似乎主要与CpG岛相关，尽管并非完全相关，其特征是组蛋白H3和组蛋白H4乙酰化水平高，这是典型的转录活性染色质结构。相反，过度表达的c-Myc也可能与低亲和力位点相关，这些位点的特征是基础组蛋白乙酰化水平较低(42). 该模型似乎没有对U373单元中的优先REST占用提供类似的解释，因为SCG10系列和国民账户体系25RE1位点都位于CpG岛附近，但只有国民账户体系25该基因被内源性水平的REST占据。另一份报告描述了由两种不同的有丝分裂原活化蛋白激酶介导的选择性转录因子结合位点Ste12p占据酿酒酵母(43). 显然，有转录因子选择性结合的先例，但REST用于实现这一目的的机制仍有待阐明。然而，这种绑定选择性将为REST监管提供额外的维度。例如，在神经发生过程中，REST表达在大鼠前脑中被动态调节(21,22)REST水平的这种变化可能导致不同的RE1结合谱，从而在不同的发育阶段以基因调控为目标。此外，据报道，缺血后海马CA1锥体神经元的REST水平增加(29)在红藻氨酸诱导的癫痫发作中穿过海马(28). 不难想象，随着REST水平的增加，不同类别的RE1位点会被占据，从而建立REST靶基因表达的时间调节反应。

总之，已经对三种不同脊椎动物基因组中的RE1和潜在REST靶基因进行了全基因组分析。我们已经将这些信息集成到一个免费的在线数据库中。我们根据其在U373胶质瘤细胞中的占有率和REST的调节，区分了四组靶基因。我们预计这些群体的成员将根据细胞类型和/或发育阶段而变化。

补充材料

支持信息：

致谢

威康信托基金会和英国生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）资助了这项工作。A.W.B.是BBSRC的一名研究生。

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：RE1，阻遏因子1；NRSE，神经元限制性消声器元件；REST，阻遏物元件1沉默转录因子；神经限制性沉默因子；ChIP，染色质免疫沉淀；EMSA，电迁移率变化分析；腺病毒；DNREST，显性负性REST。

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院