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EMBO J。2016年3月1日；35(5): 515–535.
2016年1月21日在线发布。 数字对象标识：10.15252/embj.201592534
预防性维修识别码：项目经理4772849
PMID：26796577

可诱导染色质启动与T细胞免疫记忆的建立相关

莎拉·贝文顿，1 皮埃尔·考西，1 杰森·派珀，2 伊丽莎白·伯特兰，三 纳文·拉利，2 丽贝卡·贾维斯，1 利亚姆·尼尔镀金，1 萨沙·奥特，2 Constanze Bonifer公司，1和彼得·科克里尔通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

免疫记忆是脊椎动物生理学的一个决定性特征，可以对反复感染做出快速反应。然而，对其建立和维持所需的分子机制仍知之甚少。在这里，我们证明了获得T细胞记忆的第一步发生在原始T细胞通过抗原刺激的初始激活阶段。这一事件引发了广泛的染色质重塑，使免疫反应基因在终末分化之前重新编程，进入稳定的启动状态。激活诱导转录因子美国国家足球协会和AP公司‐创造了数千个新的DN（公称直径）酶I-超敏位点(国土安全部s） ，启用电动滑行系统‐1和RUNX（运行）1个招聘到以前无法访问的网站。重要的是，这些国土安全部s在激活停止后很长时间内保持稳定，在复制后保持不变，并在记忆表型细胞中保持。我们展示了素数国土安全部s在调节免疫反应的诱导基因和增强子附近维持活性染色质区域。我们认为，这种启动机制可能通过促进先前激活的T细胞中附近诱导型调节元件的诱导，有助于T细胞的免疫记忆。

关键词：染色质、表观遗传学、基因调节、免疫、记忆T细胞
主题类别：染色质、表观遗传学、基因组学和功能基因组学、免疫学

介绍

免疫记忆在维持哺乳动物免疫反应中起着至关重要的作用，使其能够在再次遇到外来病原体时对其作出快速反应。记忆T细胞（TM（M）)由于先前的免疫反应而产生，并在再次激发时有效上调关键反应基因，而抗原缺乏的原始T细胞（T细胞N个)对同样的刺激做出反应需要更长的时间（罗杰斯等，2000; Sprent&Surh公司，2002). T的初始激活N个抗原提呈细胞（APC）参与T细胞受体（TCR）与APC上主要组织相容性复合体结合的特定抗原的相互作用。这与与共刺激分子如CD28（Brownlie&Zamoyska，2013). 这些反应触发蛋白激酶和钙调神经磷酸酶信号通路，激活诱导转录因子（TF），如AP‐1、NFAT和NF‐κB。这些TF与先前存在的发育调节TF（如RUNX1和ETS‐1）一起，是诱导性细胞因子和细胞溶解分子表达所必需的，它们在复杂的免疫细胞网络中发挥作用，以消除感染。许多实验室的工作导致了对Ca的详细了解2+NFAT的依赖性激活和AP-1和NFκB的激酶依赖性激活，以及它们在创建可诱导的DNase I超敏位点（DHS）和调节TCR诱导基因（如IL2型，IL3、，和CSF2型（霍根等，2003; 约翰逊等，2004). ETS‐1和RUNX1在T细胞发育和激活（Muthusamy等，1995; Telfer&Rothenberg，2001; 江川等，2007; 伦赫斯特等，2009).

第一次刺激时，TN个经历一个漫长的内部重组过程，需要1-2天的时间，在此期间，它们从静止的孢子状状态转变为活跃增殖的T母细胞（TB类)（赵等，1998). 在此期间，细胞核经历广泛的Brg1依赖性染色质重塑，体积增加5至10倍。一旦成型，TB类在没有进一步TCR刺激的情况下，使用IL-2作为生长因子，能够经历多轮增殖。在没有TCR信号的情况下，这些最近激活的TB类细胞不再表达通常与完全激活的T细胞相关的诱导性细胞因子和细胞溶解分子。然而，再次刺激后，TB类像T一样回应M（M）并对TCR信号（Mirabella等，2010). 例如，我们之前在T中显示B类细胞，一种NFAT依赖的DHSCSF2型增强剂可以在刺激后20分钟内形成（约翰逊等，2004).体内，根据感染类型，在成纤维细胞转化阶段之后通常进一步分化为效应细胞，如Th1和Th2细胞。克隆扩增和病原体清除后，效应T细胞群收缩，留下一小部分存活细胞。这些细胞以T的形式返回到静止状态M（M），同时保留了T的一些特性B类。

一些研究比较了染色质修饰和基因表达的稳态水平，并确定了TN个和TM（M）在Trithorax和Polycomb调节的组蛋白甲基化染色质结构域之间的平衡中（Yamashita等，2004; 荒木经惟等，2009; Nakayama和Yamashita，2009; 俄罗斯等，2014; Seumois公司等，2014; 克朗普顿等，2015)，组蛋白乙酰化域（荒木等，2008)和DNA甲基化（桥本等，2013; 小森公司等，2015). 然而，尽管这些结构域可能与静息T细胞中稳态mRNA水平的差异相关N个和TM（M），它们与诱导基因表达的相关性在很大程度上仍未被探索。此外，还没有描述如何创建和维护这些域的机制。

T之间差异的分子机制N个和TM（M）尚不清楚，因为没有明显的T候选人M（M）特定TF。然而，有足够的证据表明表观遗传机制在维持T细胞分化和记忆中发挥作用（Rothenberg&Zhang，2012). 人们早就知道，T细胞向Th1或Th2 T细胞分化的末端伴随着特定细胞因子基因位点DHS的增加（Agarwal和Rao，1998)同时诱导Th1和Th2特异性因子，如TBX21和GATA-3。然而，在激活和分化过程中获得的许多DHS在不同类别的分化T细胞中共享，其中许多位点的意义尚不清楚。例如，特定于Th2的Il4号机组该基因与Il4/半径50存在于Th1和Th2细胞中，但在幼稚T细胞中不存在的位点（Agarwal和Rao，1998; 字段等，2004). 这个伊尔10该基因同样受到Th2特异性DHS和DHS的调节，DHS也存在于未分化的T母细胞或Th1细胞中（Jones和Flavell，2005). 调节性T细胞（Treg）代表另一类分化的T细胞，它们获得一组在T细胞中缺失的DHSN个分化为Treg是由TF FOXP3驱动的，但在这种情况下，许多特定于Treg的DHS是在最终分化为Treg之前获得的（Samstein等，2012). 综上所述，这些研究表明，T细胞激活可能会在许多位点产生一种允许状态，使其能够接受任何可能遇到的由包括FOXP3、TBX21和GATA-3在内的谱系特异性因子介导的随后分化诱导信号。

在我们之前对人类的研究中IL3号机组/CSF2型基因座，我们研究了控制T细胞中这两个高度诱导的细胞因子基因激活的调节元件的特性。与上述研究类似，我们确定了两类不同的DHS，它们是在T细胞分化和激活的不同阶段获得的（Mirabella等，2010; 巴克斯特等，2012). 当T细胞首次通过TCR信号被激活时，胸腺和幼稚T细胞中不存在的一类稳定维持的DHS在T母细胞转化过程中形成。一旦形成，这些引物DHS（pDHS）在没有持续TCR信号的情况下被保存许多细胞周期。此外，在循环的人类记忆T细胞中检测到了该位点的pDHS，这表明它们在可能几个月或几年的时间内都是稳定的（米拉贝拉等，2010). 然而，这些pDHS的功能尚不清楚，因为当使用报告基因（Hawwari等，2002; 巴克斯特等，2012). 除了这些pDHS之外，我们还鉴定了几种可诱导的DHS（iDHS），它们在对TCR信号传导的激活的直接反应中短暂出现（Cockerill，2004; 巴克斯特等，2012). 类似于在T细胞的其他诱导基因中检测到的iDHS，例如Il4号机组（字段等，2004)和伊尔10（琼斯和弗拉维尔，2005)、中的iDHSIL3号机组/CSF2型在瞬时转染试验和转基因小鼠（Cockerill等，1999; 巴克斯特等，2012).

在当前的研究中，我们的目标是在全球范围内确定和表征维持交替染色质状态并支持两种T的回忆反应特征的调控元件和因子M（M）和TB类我们的目的是确定可能在所有类型的T细胞中共享的共同机制，以建立一种允许状态，促进先前激活的T细胞的二次反应。我们对DHS进行全基因组测序（DNase‐Seq），对TF进行染色质免疫沉淀分析（ChIP‐Seg），并对T细胞进行组蛋白修饰N个，T型M（M）、和TB类刺激前后。我们鉴定了2000多个pDHS，这些pDHS在T中缺失N个但在两个T中都存在M（M）和TB类并由CD4共享+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。在主动分割T时B类细胞中，许多pDHS被ETS‐1和RUNX1稳定结合，我们认为其具有维持染色质启动的功能。在再次刺激后，它们也受到AP-1的约束，我们建议AP-1是建立启动和促进随后诱导反应所必需的。值得注意的是，pDHS被嵌入以H3K4me2和H3K27ac标记的活性染色质岛中，这些染色质岛通常包含可在T细胞激活的诱导增强子B类，但不在T中N个与通过Polycomb调节的H3K27me3修饰在幼稚T细胞中沉默的一些基因相比，我们发现的pDHS在幼年T细胞中没有H3K26me3标记。

因此，我们提出了一个模型，其中许多诱导免疫反应基因存在于T细胞中不可接近的染色质中N个直到细胞被激活为活性染色质状态，这允许NFAT和AP-1快速诱导增强子，并可获得额外的诱导分化TF。我们的模型提供了一种简单的基于染色质的机制来维持T的启动M（M）使用预先存在的TF的特异性调节元件，可以使T细胞保留免疫记忆，而不需要额外的特异性因子来沉默T细胞中的基因N个。

结果

为了确定建立免疫记忆的调节网络，我们进行了一组全基因组的综合分析，以确定与T细胞稳定重编程状态相关的DNA元件、TF、共激活物和组蛋白修饰M（M）和TB类因为我们想研究T细胞调节的整体机制，所以我们选择检测自然产生的记忆表型细胞（T细胞M（M）)而不是可能局限于单个T细胞谱系和分化状态的TCR特异性T细胞。我们首先纯化了不同群体的CD4+T辅助细胞和CD8+然后分析它们对TCR信号通路刺激的反应。为此，我们使用了C42转基因小鼠模型，该模型含有完整的人类IL3/CSF2型编码IL‐3和GM‐CSF的位点（图1A） （米拉贝拉等，2010; 巴克斯特等，2012).IL3号机组和CSF2型是在T细胞中有效诱导的典型细胞因子基因M（M）或TB类，但不在T中N个或胸腺细胞（Mirabella等，2010). 该位点已被广泛研究，作为确定T细胞中增强子激活诱导机制的模型B类（约翰逊等，2004; 伯特等，2007; 巴克斯特等，2012). 此外，该位点包含已知存在于T中的DHSB类和TM（M）但胸腺细胞或T细胞中没有N个（米拉贝拉等，2010; 巴克斯特等，2012)为研究维持记忆的DNA元素提供了明显的候选对象，同时也使我们能够检查记忆维持的实际机制是否在人和小鼠之间保持不变。

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先前激活的T细胞稳定地维持广泛的国土安全部s位于伊利诺伊州3/CSF公司2轨迹

  • A类
    130‐kb人类伊利诺伊州3/CSF公司2 美国银行转基因。绝缘体（Ins）和增强器元件（E）如方框所示。
  • B类
    T母细胞转化和再活化的步骤。已净化光盘4+或光盘8+用2μg/ml ConA激活T细胞40小时，然后将其保存在伊利诺伊州‐2作为T型B类用20 ng/ml重新刺激细胞项目管理局和2μM钙离子载体(项目管理局/一） ●●●●。
  • C类
    可诱导的信使核糖核酸表达式级别光盘4T型N个和T型B类用刺激项目管理局/I表示指定的时间。信使核糖核酸表达的水平与β-2微球蛋白的水平有关(200万)使用SEM。复制次数(n个)下面显示了每种情况。
  • D类
    UCSC公司人类基因组浏览器快照伊利诺伊州3/CSF公司2轨迹显示DN（公称直径）ase-Seq和ChIP（IP）‐顺序输入光盘4T型N个和T型B类有（红色）和无刺激（黑色）项目管理局/I 2小时，加上编码器Jurkat T细胞DN（公称直径）ase-Seq数据（瑟曼等，2012). 黑色箭头表示稳定国土安全部s和红色箭头是可诱导的国土安全部s、 距离以千为单位国土安全部来自伊利诺伊州三或CSF公司2发起人。
  • E类
    人类CSF公司2 信使核糖核酸中的表达式光盘4T型N个和光盘4T型M（M）刺激2小时项目管理局/一、 表示为（C）。
  • F类
    Southern印迹DNA杂交分析国土安全部人体中的sT型N个和T型M（M）和C42T型B类。
  • G、 小时
    转染荧光素酶报告基因的刺激Jurkat T细胞的检测pXPG公司含有CSF公司2（G） 或伊利诺伊州三（H） 启动子单独或与指示的pDHS公司和增强剂DNA（D）中定义的区域。这个伊利诺伊州三−4.1/1.5构造包含跨越伊利诺伊州三启动子从-4.3kb到+50bp。复制次数(n个)如下所示，误差条表示SEM（G）或SD（H）。

我们从C42小鼠脾脏制备了静止T淋巴细胞亚群，并进一步纯化了T淋巴细胞N个和TM（M）.积极增殖的TB类通过用凝集素伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激CD4和CD8 T细胞2天来激活表面受体，然后在IL‐2的存在下快速增殖2–3天（图1B） ●●●●。我们证实ConA刺激过程足以快速诱导AP‐1家族基因福斯然而，人类CSF2型转基因和小鼠趋化因子（C‐C基序）配体1基因(Ccl1公司)在16小时内诱导速度慢得多(附录图S1A). 我们还使用流式细胞术（FACS）证明每个群体的大部分CD4 T细胞具有预期的特性：（i）TN个主要是CD62L+缺乏活化标记物CD44和CD25的细胞，（ii）TM（M）主要是表达CD44的记忆表型细胞，但缺乏CD62L和CD25，因此类似于效应记忆T细胞，以及（iii）T细胞B类主要表达活化标记CD25和CD44，与活化效应T细胞一致(附录图S1B).

然后用PMA和钙离子载体A23187（PMA/I）刺激每个T细胞群2小时，以激活诱导AP-1和NFAT活性的TCR信号通路。通过直接激活TCR下游的通路，我们确保我们研究了与表观遗传和转录反应直接相关的机制，而不仅仅是介导细胞表面信号的分子表达或功能的差异。人类mRNA表达分析IL3号机组和CSF2型，以及鼠标Il4号机组和Il10，证实CD4 T中的每个基因都被PMA/I快速强烈地诱导B类但不在T中N个单元格（图1C） ●●●●。这些实验证实了诱导细胞因子基因在TN个和TB类PMA/I刺激为研究记忆回忆反应提供了一个有意义的模型。两种细胞类型均在刺激前以可比水平表达NFAT和AP‐1家族蛋白的mRNA。在经过2小时的PMA/I入职培训后B类和TN个诱导mRNA达到相似水平，尽管动力学略有不同（图电动汽车1A） ●●●●。这表明不仅仅是TF mRNA表达的差异区分了T细胞的反应B类和TM（M）来自T的单元格N个，但这些因素的不同使用或处理。

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鼠标的比较T型N个和T型B类TF mRNA和染色质轮廓

  1. 聚合酶链反应分析信使核糖核酸的表达式美国国家足球协会和AP公司‐1家族转录因子光盘4T型N个和T型B类用…刺激项目管理局/我在指定的时间内。表达式级别规范化为200万值表示3到10个重复的平均值和SEM，每个值的中位数为5个重复。
  2. UCSC公司小鼠chr11基因900kb区域的基因组浏览器截图显示DN（公称直径）ase I‐顺序光盘4和光盘8T型N个，T型B类、和T型M（M）以及H3K27me3的已发布数据集光盘4和光盘8T型N个和Th2细胞。T型N个（2） 以及T型B类（2） 代表生物复制。

人类IL-3/GM-CSF基因座在T细胞中显示出特定的DHSM（M）和TB类

映射所有潜在活动顺式在C42小鼠T细胞中的调节元件中，我们进行了全局DNase‐Seq，以确定受转录因子（Cockerill，2011). 人类覆盖区域的具体分析IL3/CSF2型转基因检测到了所有之前由常规检测定义的DHS（Baxter等，2012)，加上之前未知的DHS下游集群CSF2型（图1D） ●●●●。许多DHS具有与上述pDHS定义的调节元件类别一致的特性。这个IL3号机组−1.5kb、−4.1kb、–34kb和−41kb pDHS，以及CSF2型+T中有30 kb DHSB类而不是TN个。CSF2型mRNA在两种T细胞中也高度诱导B类和TM（M）但不在T中N个（图1C和E）。此外CSF2型+30‐kb和IL3号机组循环人外周血CD4中存在−34‐kb pDHS+CD45RA−记忆表型T细胞，与C42小鼠T细胞水平无明显区别B类，并且在人类CD4中较弱或缺失+CD45RA+原始T细胞（图1F） ●●●●。这些发现表明pDHS（i）维持在活跃增殖的T细胞中B类在没有TCR信号的情况下，（ii）有助于非除法循环T中记忆的长期维持M（M）这些分析也证实了T的制备B类通过ConA的刺激，人类的DHS呈现出相同的模式IL3/CSF2型T的轨迹B类通过特异性刺激TCR复合物和CD28（Baxter）制备等，2012)，从而验证了我们的选择在体外模型。

为了进一步确定稳定维持的pDHS的特征，我们对CD4T中的组蛋白H3K4me2和H3K27ac进行了ChIP‐Seq分析B类这些活性染色质修饰通常用于绘制活性增强子元素（Rivera和Ren，2013). 在转基因中，pDHS位于以H3K4me2和H3K27ac标记的广泛域中，特别是在TB类（图1D） ●●●●。在刺激的CD4 T中B类（TB类 +)，我们检测到额外的诱导性DHS（iDHS），其中包括定义明确的−37‐kb和−4.5‐kbsIL3号机组增强剂和IL3号机组启动子和新的iDHS下游25和28 kbCSF2型值得注意的是，这些iDHS存在于pDHS和活性染色质修饰区附近。每个iDHS，加上−3‐kb的iDHSCSF2型增强子在T细胞中高度诱导B类但不在T中N个这与稳定的pDHS将染色质跨越诱导增强子维持在启动状态的机制一致，使其能够快速响应TCR信号。

我们之前已经表明IL3号机组基因座缺乏增强子活性，而−37‐kb iDHS是一种强大的诱导增强子（霍瓦里等，2002; 巴克斯特等，2012). 因此，我们假设人类IL3号机组−34-kb和−41-kb DHS代表了一类不同的调节元件，它们维持活性染色质的稳定区，但缺乏典型的增强子活性（Baxter等，2012). 与此想法一致CSF2型+22kb和+30kb pDHS与CSF2型启动子和受刺激Jurkat T细胞的报告基因检测（图1G） 而在同一试验中，+28‐kb iDHS作为一种经典的诱导增强子发挥作用，增加了CSF2型启动子活性为三倍。然而，尽管其本身是非活性的，但+30‐kb pDHS与+28‐kb-增强子协同激活启动子。此外，DNA片段包含IL3号机组-1.5 kb和-4.1 kb pDHS同样缺乏增强子活性IL3号机组发起人，就像IL3号机组−34-kb和−41-kb pDHS，与−37-kb iDHS形成鲜明对比（图1H） ●●●●。综上所述，这些数据表明，稳定的pDHS不一定是经典增强子，但当T细胞被重新刺激时，可能有助于在自然环境中诱导诱导增强子。

激活人体IL3号机组基因座由基因座启动辅助

人类Jurkat T细胞在IL3号机组与T中的状态极为相似的轨迹B类（图1D） ●●●●。为了研究pDHS在缺乏经典增强子活性的情况下的潜在功能，我们使用CRISPR技术专门删除人类IL3号机组Jurkat细胞中两个等位基因的−34‐kb pDHS（图2A） ●●●●。对平均mRNA水平的分析显示IL3号机组，但不是6月与具有完整基因座的克隆相比，在2个缺乏−34‐kb pDHS的克隆中（图2B和C）。接下来，我们采用基于PCR的染色质可及性分析来证明邻近的−37‐kbIL3号机组增强子iDHS在缺失−34‐kb pDHS的克隆中降低了对DNase I的可及性，而在活性TBP启动子或非活性对照区中没有观察到一致的差异（图2D） ●●●●。这些数据与pDHS通过建立允许的活性染色质结构域促进诱导增强子激活的功能一致。

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诱导受损伊利诺伊州三基因表达与增强子国土安全部删除后形成pDHS公司在人类Jurkat T细胞中

  1. 上游地区地图伊利诺伊州三跨越−34‐kb的基因pDHS公司和−37‐kb诱导增强子，以及指南的位置核糖核酸s用于删除−34‐kbpDHS公司和聚合酶链反应用于检测缺失的引物。右边是一个聚合酶链反应确认删除−34‐kb的分析pDHS公司在选择用于如下所示分析的4个克隆中的2个克隆中的两个等位基因上。
  2. 平均伊利诺伊州三（上部）和6月（下部）信使核糖核酸在−34‐kb中的表达−/−克隆A和B与重量克隆A和克隆B用项目管理局/一、。信使核糖核酸首先将级别标准化为GAPDH公司然后达到未转染的Jurkat T细胞中的基因表达水平。值表示两个−34‐kb的平均值−/−和两个重量两个独立实验的克隆(n个=4）带有SD。
  3. 伊利诺伊州三和6月 信使核糖核酸刺激2小时后的表达水平项目管理局/如（B）所示，我进行了归一化。标准误差来自五个独立的实验。
  4. 删除−34‐kbpDHS公司损害iDHS公司在−37‐kb诱导增强子。−34‐kb−/−克隆A和B重量克隆A和B以及未转染的Jurkat T细胞被刺激项目管理局/I持续3小时。一系列DN（公称直径）酶I浓度用于确定−37‐kb的染色质可及性iDHS公司在两个独立的克隆中，其值相对于正常的未刺激Jurkat细胞表达。通过检测到的信号减少检测到可访问性增加定量PCR.活动TBP（待定）启动子和Chr18上的一个非活性区域被用作对照。−34‐kb的独立实验−/−和重量克隆A和克隆B与未转染Jurkat T细胞的比较分别显示在上下面板中。

人和小鼠IL-3/GM-CSF基因座共享保守的pDHS

为了在全球范围内研究pDHSs的形成，我们使用DNA酶序列数据绘制了整个小鼠基因组的DHSs。图电动汽车1B显示CD4 T的比较N个，T型B类、和TM（M）和CD8 TN个和TB类跨越小鼠基因组的900 kb区域，其中包括Il3/Csf2轨迹伊尔4/伊尔13/伊尔5Th2细胞因子基因簇，以及其他几个无关基因。所有样品中存在的共享DHS作为有用的内部控制，以确认描述了适当的刻度，并使用了同等水平的DNA酶消化。大多数DHS在人和小鼠之间是保守的Il3/Csf2位置（图1D和电动汽车1B） ●●●●。最重要的是，我们在CD4 T和CD4 T的人类基因座中检测到了相同的pDHS和iDHS的一般模式M、，CD4、CD8 TB类和TN个，确认存在一个不同的T类B类/T型M（M）由记忆表型细胞稳定维持的特异性pDHS。这种模式具有高度的重复性，因为它在CD4 T的2个独立分析中被发现N个和TB类（图电动汽车1B） ●●●●。900‐kb窗口，如图所示电动汽车1B、 再加上许多其他普遍活跃的基因座，用于将所有浏览器轨迹设置为等效的检测级别。此处使用的比例以及下面描述的所有浏览器轨迹如所示附录图S2下面显示的是维恩图，描述了在生物复制可用的三个数据集中检测到的最显著峰值的DHS峰值集之间的重叠。

先前的研究发现，记忆性T细胞特异性基因子集的启动子在幼稚T细胞和胸腺细胞（Nakayama和Yamashita，2009). 然而，这不太可能是一种普遍的机制，正如我们之前证明的那样，诱导人类的启动子并非如此IL3号机组/CSF2型也不能在胸腺中诱导的转基因（米拉贝拉等，2010). 与这一发现一致的是，我们对其他已发表数据集的分析（Wei等，2009; 俄罗斯等，2014)确认跨越上述T的区域B类小鼠基因组中的特定DHS在CD4和CD8 T中的背景水平均为H3K27me3N个，其中这些位点是不活跃的，并显示出与分化的Th2细胞相同的模式（图电动汽车1B） ●●●●。

鼠标T细胞显示数千个记忆T细胞特异性pDHS

我们的下一个目标是鉴定小鼠T细胞中pDHSs和iDHSs的完整补体。然而，这并不是一项简单的任务，因为基因调控元件是一个极其多样化的群体，它跨越了广泛的DNA元件连续体，与pDHS或iDHS具有不同程度的相似性。为了定义pDHS和iDHS的一般属性，我们首先需要确定每个子集中最丰富和最具体的DHS的代表组。

我们首先评估CD4和CD8 T中DHS的不同特性N个和TB类和CD4 TM（M）确定每个人群中最具体的DHS。为此，TM（M）和TB类DHS数据集分别根据DNase‐Seq标签计数的倍数变化进行排名，首先是（i）CD4 TM（M）相对于CD4 TN个（图三A） 然后用于（ii）CD4 TB类相对于CD4 TN个（图三B） 数据绘制为以峰值为中心的2 kb窗口的密度图。在图中三B、 T型M（M）数据也直接沿着T坐标绘制B类/T型N个比较。有两个观察值得注意：（i）TB类和TM（M）共享了T中没有的许多特定DHSN个强调最近激活的增殖T细胞之间的相似性B类和静止初级TM（M）; （ii）我们再次观察到同一DHS种群在TB类与T相比N个CD4和CD8 T细胞的所有数据，包括CD4 T的独立复制N个和TB类样本，使用与原始CD4 T相同的排名绘制N个和TB类数据如图所示三B（图电动汽车2A） ●●●●。总的来说，这些数据表明CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞利用一组常见的DHS在先前激活的T细胞中维持表观遗传启动。在T细胞分化为特定亚型（如Th1和Th2）之前，这些位点很可能在细胞首次激活后很快建立。CD4 T中pDHS的持续存在M（M）提出了一种有趣的可能性，即它们可能具有使记忆T细胞中的诱导基因快速重新激活的额外目的。

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全基因组映射确定了一类国土安全部仅限于先前激活的T细胞

  1. 描述所有DN（公称直径）ase‐Seq峰值的增加顺序DN（公称直径）ase-Seq标签计数信号光盘4T型M（M）与相比T型N个右边是定义的2882子集的位置pDHS公司s和log2T型M（M）/T型N个最接近对应基因表达的折叠变化国土安全部。
  2. 所有的密度贴图DN（公称直径）ase-Seq和ChIP（IP）按递增顺序显示的顺序峰值DN（公称直径）ase-Seq标签计数信号光盘4T型B类与相比T型N个. TheT型N个H3K27ac轨道来自公布的数据（Lara‐Astiaso等，2014).
  3. 平均国土安全部2882时的信号pDHS公司s和2882不变量国土安全部中的光盘4T型N个，T型B类、和T型M（M）.2882的位置pDHS公司s如（A）和（B）所示。
  4. 显示基因组分布的饼图pDHS公司第条。
  5. 平均H3K4me2、H3K27ac和BRD公司2882时为4信号pDHS公司第条。
  6. 2小时后基因表达log2倍变化图项目管理局/我代表光盘4T型M（M）与相比T型N个.1895个基因（黑色）在T型M（M）但不是T型N个。
  7. 距离和基因表达分析。P（P）‐值代表χ2相对于TSS 25kb内随机预期的pDHS数量的显著性（方法描述于附录).

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光盘4和光盘8个T细胞共用一组pDHS公司秒

  • A类
    表示DN（公称直径）ase‐Seq峰值出现在顶部所示的细胞类型中，以递增的顺序显示DN（公称直径）用于的ase‐Seq标签计数信号光盘4T型B类与相比光盘4T型N个。T型B类（2） 以及T型N个（2） 是生物复制品。
  • B类
    平均DN（公称直径）ase I个人资料pDHS公司中的光盘4T型B类（2） 以及T型N个(2),光盘8T型B类和T型N个，加上公共可用的平均H3K27me3配置文件光盘4和光盘中的8个数据集T型N个T型M（M），效应T细胞(T型E类)和Th2细胞。
  • C、 D类
    1895 T的log2 mRNA表达倍数变化（C）和绝对表达水平（D）的箱线图M（M）CD4 T中的特异基因N个，CD4 TB类和CD4 TM（M）。方框分别表示第一个和第三个四分位。底部和顶部胡须代表第一和第三个四分位减去和加上1.5倍的四分位范围。
  • E类
    1895年的基因本体论T型M（M）特异基因。
  • F类
    平均累积值信使核糖核酸两种交替剪接形式基因编码的数组值美国国家足球协会c1.数值基于4个单独的微阵列数值，并以SD表示。
  • G公司
    的层次相关聚类信使核糖核酸方差最大的前1%基因的水平信使核糖核酸种群之间的表达光盘4和光盘8T型N个 ， T型B类、和T型M（M）.治疗项目管理局/I用“+”号表示。Pearson相关性根据色标显示（左上角）。B、 N和+（右）表示聚类产生的优势群。

为了获得对pDHS形成的整体机制的机械见解，我们通过图三A定义CD4 T富集至少三倍的峰M（M）相对于CD4 TN。排除次要峰值后，我们选择了2882个CD4 T的可重复子集M（M）CD4 T中也存在的pDHSB类DHS数据集(数据集EV1). 2882个CD4-pDHS中的大多数也存在于CD8 T细胞中B类（2382=83%）和复制CD4 TB类（85%）数据集如图所示电动汽车2A.然后将这2882个共享DHS用作pDHS的代表性群体，但不一定包括所有pDHS，以供我们进一步分析。CD4中这些pDHS的平均DHS谱+单元格（图三C） 确认它们在两个T中都是强大的DHSM（M）和TB类但T弱N个CD8 T中2882个CD4 pDHS的平均分布也是如此N个和TB类和CD4 T重复样本N个和TB类（图电动汽车2B） ●●●●。作为非特异性DHS的内部控制，我们使用了2882个经证实存在于所有三种CD4 T细胞类型中的不变DHS的随机选择子集（图三C） ●●●●。2882个pDHS被映射回基因组，主要由基因间和内含子区域的远端位点（83%）组成，只有12%位于转录起始位点（TSS）的1kb范围内（图三D） ●●●●。

接下来，我们通过ChIP‐Seq测量了所有DHS中两种增强子相关组蛋白修饰的水平。H3K4me2和H3K27ac在T中的富集N个和TB类绘制了每个DHS的密度图（图三B） ●●●●。正如在人类体内观察到的pDHSIL3/CSF2型轨迹（图1D） ，2882pDHS仅在T细胞中用H3K4me2和H3K27ac标记B类而不是TN个（图三B和E）。我们还对转录激活物BRD4进行了ChIP‐Seq，BRD4与乙酰化组蛋白结合，并且在有丝分裂期间保持结合（Zhao等，2011)，并在T中发现pDHS强烈富集B类（图三B和E）。相反，H3K27me3的平均分布取自公布的数据集（Wei等，2009; 俄罗斯等，2014)基本上是CD4和CD8 T中pDHS的基线N个和Th2细胞（图电动汽车2B） 这表明，这些区域并不是通过失去抑制性组蛋白修饰而受到差异调节的。

激活的TB类和TM（M）表达一组常见的诱导型基因

与全基因组DNase-Seq和ChIP-Seq分析平行，我们测量了不同CD4细胞类型（TN个，T型B类，T型M（M）)和CD8 T中N个和TB类通过对未经处理的细胞和用PMA/I刺激2小时后的细胞进行微阵列分析，比较CD4 T中每个基因的折叠诱导N个和TB类显示1895 TM（M）特异性基因在T细胞中至少是双重诱导的M（M）并且在T中诱导不到两倍N个（黑点，图三F、，数据集EV2). 此外，平均折叠变化值证实1895 CD4 TM（M）CD4 T中的特异性诱导基因上调M（M）和TB类（图电动汽车2C） ●●●●。然而，T细胞中mRNA的稳态水平几乎没有差异N个，T型B类、和TM（M），T中的值实际上略低M（M）和TB类（图电动汽车2D） ●●●●。基因本体论分析表明，这1895个上调的基因通常与免疫反应和信号通路的激活有关（图电动汽车2E） ●●●●。除上述基因外，还包括许多免疫调节因子，如白细胞介素9、19、20、22、27和31，CSF‐1、IL‐1，IL‐2、IL­12、IL‐）和IL‐13受体，细胞因子或趋化因子途径中的其他基因，如Cxcl3，和Cxcl5公司，Cxcr3、Cxcr5，Ccl2、Ccl19、Ccl24、Ccr2、Ccr6、Tnfrsf4和Tnfrsf9、Tnfsf8，以及编码转录因子NFIL3、NFATc1和NFAT5的基因。请注意，尽管Nfatc1号机组仅在T中轻度诱导B类（图电动汽车1A） ，在T中诱导作用更强M（M）比T大B类（图电动汽车2F） 。

为了寻找不同T细胞亚群之间差异mRNA表达的共同模式，我们对所有亚群（242个基因，图电动汽车2G） ●●●●。这揭示了受刺激的CD4 T共同的表达模式M（M），CD4 TB类和CD8 TB类而刺激T的模式N个细胞与非刺激性T细胞更为相似N个CD4和CD4细胞+和CD8+T细胞。有趣的是，CD4 T的基本模式M（M）更类似于CD4 TN个而不是刺激CD4 TM（M）可能反映了这些细胞的静止增殖状态。这些观察结果意义重大，因为它们表明2882个pDHS的存在对基因表达的基线水平几乎没有影响，这与图三A和电动汽车2D和以下概念：（i）pDHS的作用是调节诱导性而非基础基因表达，以及（ii）pDHSs不是在缺乏刺激的情况下激活基因的经典增强子。直接比较最接近2882个pDHS的基因和图中确定的1895个诱导基因的mRNA值三F、 也证明在T细胞缺乏刺激的情况下，这些基因的表达没有实质性差异N个与T相比M（M）(附录图S3).

引物DHS位于携带诱导DHS的诱导基因附近

为了全面评估pDHS在调节诱导基因表达中的作用，我们绘制了1895 TM（M）特异性诱导基因到最近的pDHS。我们鉴定了683个基因(数据集EV3)其pDHS位于诱导基因TSS的150 kb范围内，占所有pDHS的23.7%（图三G） ●●●●。与大小相似的随机生成坐标（214/2882，7.4%）、随机选择的组成DHS（223/2882，7.7%）和随机选择的诱导基因内的iDHS（438/2882，15.2%）相比，该数字更高。值得注意的是，在这683个pDHS中，有200多个位于距离起始点仅25 kb的范围内(P（P） ≤ 10−324磅)，表明与先前存在的pDHS的接近性和记忆T细胞中的诱导基因表达之间有很强的相关性。在其余的可诱导基因中，91%的基因在150kb范围内含有构成DHS。

为了鉴定控制基因表达诱导的DNA元件，我们在CD4 T的整个基因组中定位了诱导型DHS（iDHS）B类用PMA/I（TB类 +). 同时，我们对H3K4me2、H3K27ac和BRD4进行了ChIP‐Seq。这两组DHS数据被绘制成密度图，密度图根据DNA酶-Seq标记计数在组合T中的折叠变化进行排序B类 +和TB类数据集（图4A） ●●●●。这项分析揭示了数千个iDHS，它们与iDHS侧翼H3K4me2水平的稳步增加以及相邻基因mRNA表达水平的增加有关，这表明这些元素中的许多起到了增强子的作用。

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iDHS公司的位置很近pDHS公司s和与诱导基因相关

  • A类
    密度图识别iDHS公司s和显示DN（公称直径）ase-Seq和H3K4me2 ChIP（IP）‐序列峰值按增加顺序DN（公称直径）ase-Seq标签计数信号光盘4T型B类 +与相比T型B类细胞。此外，还描述了6823大调的位置国土安全部是5.5倍诱导的以及其中1217个的子集iDHS公司是11倍诱导的。右边是日志2T型B类 +/T型B类最接近对应基因表达的折叠变化国土安全部。
  • B类
    平均DN（公称直径）1217的ase I配置文件iDHS公司中的T型N个(+/−项目管理局/I） 以及T型B类(+/− 项目管理局/I） （左）和T型M（M）(+/− 项目管理局/一） （右）。
  • C类
    平均DN（公称直径）1049的ase I和H3K27ac剖面国防安全部中的T型N个和T型B类(+/− 项目管理局/一） 刺激后会减少四倍。
  • D类
    1217的基因组分布iDHS公司第条。
  • E–H（E–H）
    显示T数的条形图M（M）‐在TSS（E）150 kb范围内具有iDHS的特定基因；TSS和T最近iDHS之间的中间距离M（M）根据T细胞中的折叠诱导对特异性基因进行分组M（M）2小时后加上PMA/I，与T相比M（M）对于来自iDHS（F）的TSS<1 Mb的基因；T的数量M（M）在683个pDHS（G）的150 kb范围内具有iDHS的特定基因；以及根据T中的折叠诱导分组的从最近的pDHS到最近的iDHS的中间距离M（M）2小时后加上PMA/I，与T相比M（M）（H） ●●●●。P（P）‐值表示χ2对25 kb（F和H）内随机预期DHS数量的显著性，或t吨测试同等大小随机DHS（E和G）的显著性。用于计算的方法P（P）值在附录。
  • 我
    UCSC公司Th2的基因组浏览器截图Il4/Il13/Rad50轨迹显示DN（公称直径）aseI‐序列和通道IP（IP）‐顺序。黑色和红色箭头表示pDHS公司s和iDHS公司s、 分别是。箭头上方的值表示与Il4号机组发起人。

为了识别和表征iDHS，我们首先关注了前15%的iDHS并确定了6823个iDHS的群体，这些iDHS是由相对于CD4 T的5.5倍诱导的B类（图4A） ●●●●。然而，由于最高度诱导的峰与H3K4me2和mRNA表达的变化具有最强的相关性，我们也对1217个最强的iDHS进行了更严格的选择，这些iDHS至少富集了11倍(数据集EV4). 这1217个高度特异性iDHS的平均DHS图谱证实，它们是严格诱导的，仅存在于TB类 +和TM（M） +而非非刺激TB类，T型N个，或TM（M）（图4B） ●●●●。然而，还有一部分1049个DHS在刺激后（dDHS）减少了至少四倍，dDHS平均H3K27ac谱的诱导性变化表明H3K24ac水平降低，这些位点的无核小体区域关闭（图4C） ●●●●。该亚群包括249个pDHS，表明包含pDHS和iDHS的染色质是高度动态的。相反，iDHSs在细胞被刺激后变得高度富集H3K27ac、H3K4me2和BRD4（图电动汽车3A） ●●●●。与pDHS相似，1217个iDHS主要位于基因内和内含子区域，只有1.4%位于TSS的1kb范围内（图4D） ●●●●。

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诱导物的性质国土安全部秒

  1. 平均H3K4me2、H3K27ac和BRD公司1217的4个信号iDHS公司中的光盘4T型B类和T型B类 +，加上H3K4me2和H3K27acT型N个。
  2. 187年的基因本体论T型M（M）特异性基因位于pDHS公司和一个iDHS公司。
  3. DN（公称直径）ase I \Seq和ChIP（IP）‐顺序伊尔10基因座光盘4T型N个 ， T型M（M） ， T型B类 ， T型B类 +、Th2细胞和光盘8T型N个和T型B类。
  4. Il4号机组和伊尔10 信使核糖核酸中的表达式光盘4T型N个和光盘4T型M（M）用刺激项目管理局/我在指定的时间内。相对mRNA值如图所示​图1C，1C、 使用SEM。每个重复的次数(n个)如下图所示。

接下来，我们研究了iDHS在基因表达方面的潜在意义，并测量了1895年TM（M）特异性诱导基因（图三F） 到最近的iDHS（使用更具包容性的6823子集）。大约1000个诱导基因在TSS的150 kb范围内具有iDHS，其中近500个元素位于25 kb范围之内，这是非常显著的(P（P） = 10−92)（图4E） 进一步表明iDHS作为这些基因的诱导增强子的作用。与这一发现一致M（M）特异性基因与最近的iDHS相关，其中诱导的48个基因大于10倍，平均在iDHS的10 kb范围内（图4F） 表明这些元素作为增强剂的作用。

接下来，我们通过聚焦于683个pDHS（位于T的150kb范围内）来解决pDHS、iDHS和诱导基因之间的潜在关系问题M（M）特异性诱导基因（图三G） 并测量这些pDHS和最近的iDHS之间的距离（图4G） 。值得注意的是，685个pDHS中有587个（86%）在150 kb内包含iDHS，其中312个（46%）在25 kb内(P（P） = 10−132). 这些数据加强了pDHS在近距离发挥作用以支持诱导增强子功能的观点。此外，我们发现诱导率最高的基因也显示pDHS和iDHS之间的距离最短（图4H） ●●●●。因此，诱导的54个基因至少有6倍的pDHS位于iDHS的平均15kb范围内。值得注意的是，这312个位点中的187个也携带了位于TSS 25 kb范围内的iDHS。对这187个基因的基因本体分析表明，它们与免疫反应和信号通路的激活具有高度显著的相关性（图电动汽车3B） 包括免疫调节器，如Il3、Il4、Il31、Il15ra、Il1rl1、Il18rap、Cxcr3、Ccr2、Tnfrsf4、Tnfersf9、Tnfsf8，Tnfaip8、Itga3、Itgav、Alcam、Mpzl2、Lpar3、Notch1、Icos、Map3k5、，和费恩，和关键TF基因，如继电器，Nfil3，和Nfatc1号机组。

为了进一步研究pDHS的潜在意义，我们绘制了它们相对于iDHS的位置，这些iDHS位于可诱导T启动子的150kb范围内M（M）特异性基因(附录图S3C). 这证实了pDHS位于iDHS附近的强烈趋势，与这些DHS与启动子的距离无关。

为了为利用pDHS和iDHS的基因座提供额外的例子，我们研究了诱导性细胞因子基因座的另外两个经典模型：Th2细胞因子基因座位，包括Il4号机组，Il13中，和Th2基因座控制区（LCR）（Lee等，2005)（图4一） 、和伊尔10轨迹（琼斯和弗拉维尔，2005)（图电动汽车3C） ●●●●。类似于伊利3和CSF2型，Il4号机组和伊尔10在T中特异性诱导B类和TM（M）但不是TN个（图1C和电动汽车3D） 并且含有多个pDHS和iDHS，这些仅在先前激活的T细胞中检测到（图4我和电动汽车3C） ●●●●。Th2细胞因子位点包含几个TB类特异性iDHS，包括一个11.5kb的下游Il4号机组和Th2 LCR中的一个，它们之前都显示为增强子（Lee等，2001). 这两个iDHS都位于T中的pDHS附近B类和TM（M）（图4一） ●●●●。就像在IL3/CSF2型轨迹（图1D） （巴克斯特等，2012)，的Il4号机组+9‐kb pDHS（其他人定义为HS4）也缺乏独立的增强子功能（Lee等，2001). 下面是一个类似的示例伊尔10（图电动汽车3C） 其中，pDHS和iDHS阵列在启动子上游延伸30 kb，特别是在先前激活的细胞中。这个Il4号机组+11.5‐kb和伊尔10−24‐kb iDHS均包含在T中H3K27ac和H3K4me2水平升高的启动区内B类在刺激之前。已发布的H3K27me3数据集的并行分析Il4号机组和伊尔10再次显示先前在CD4或CD8 T中没有这种修饰的富集N个在随后形成T的区域M（M）成纤维细胞转化期间的特定DHS（图4我和电动汽车3C） ●●●●。然而，有一个TN个H3K27me3在伊尔10启动子，这与调节TN个至TB类和TM（M）但在不同类别的监管要素下运营。

引物DHS结合组成性表达的转录因子

在T细胞原始细胞转化过程中产生的2882个pDHS在分裂和非分裂细胞中都能稳定维持，而TF表达程序没有任何实质性改变。因此，一个关键问题是为什么pDHS在T中保持开放B类和TM（M），而iDHS不维护。为此，我们使用HOMER（Heinz等，2013). 最丰富的基序对应于已知的ETS和RUNX家族转录因子的一致结合序列，它们分别存在于44%和47%的靶标中（图5A） ●●●●。值得注意的是，这里确定的ETS基序与复合ETS/RUNX基序相对应，这些因子在T细胞中以协同方式与之结合（Hollenhorst等，2009). 在较小程度上，pDHS还富含对TCR和生长因子信号转导作出反应的诱导因子的基序，包括AP-1、IRF和STAT家族蛋白。我们将图案的坐标绘制回DHS，按照T的DHS强度折叠变化对其进行排序B类与T相比N个（图5B） ●●●●。与T细胞发育过程中的已知功能一致，RUNX和ETS基序在T细胞发育中均被发现B类特定pDHS和T共享的构成DHSB类和TN个相反，AP‐1和STAT的基序主要出现在TB类特定DHS。我们还进行了自举分析，确定了50 bp内模体共现的统计意义，并观察到ETS、RUNX、STAT、GATA和AP-1模体在pDHS内共定位（图6A） 最有可能形成相互作用的复合物。

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pDHS公司s结合组成性表达的转录因子

  1. 从头开始2882年内丰富的图案pDHS公司s使用确定HOMER（主页）。
  2. 所有主题分布国土安全部s按递增顺序排列DN（公称直径）的ase‐Seq标签计数信号光盘4T型B类相对于T型N个如图所示三B。
  3. DN（公称直径）ase-Seq和RUNX（运行）1和电动滑行系统‐1信道IP（IP）‐序列密度图，显示国土安全部s按（B）排序，平均轮廓为RUNX（运行）1和电动滑行系统‐1绑定到pDHS公司中的T型B类与相比T型N个如下所示。
  4. 6月中国IP（IP）‐顺序输入T型B类和T型B类 +在国土安全部中定义的T型N个和T型B类并按（B）中的顺序排序，平均剖面如下所示。
  5. 的模式RUNX（运行）1,电动滑行系统‐1，和6月绑定于RUNX（运行），电动滑行系统、和AP公司‐1个主题事务处理程序6轨迹。

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联合电动滑行系统‐1和RUNX（运行）1英寸pDHS公司s、 以及RUNX（运行）在建立启动注水时为1

  1. 基序共联想丰富性的层次聚类pDHS公司s.Z评分表示在1000个随机选择的染色质可及区域中计算的观察到的与背景相关的丰富程度。
  2. 日志2信使核糖核酸的表达水平运行x1，等1，和200万未经处理和项目管理局/I处理T型N个 ， T型M（M） ，和T型B类来自微阵列分析。

验证预测的TF基序是否被占据体内，我们进行了ChIP‐Seq以评估RUNX1和ETS‐1在两个T中与DHS的结合水平N个和TB类（图5C） ●●●●。在共享DHS的两种细胞类型中均检测到RUNX1和ETS‐1结合。然而，这些因子与pDHS的结合仅限于TB类（图5C、，附录图S4). 我们通过检查从每种不同细胞类型的独立制备的重复品中获得的基因表达微阵列数据，排除了这种结果是由RUNX1和ETS‐1表达增加引起的观点（图6B） 显示出类似水平的运行x1和等1T中的mRNAN、，T型M（M）、和TB。因此，我们假设pDHS的原始发生可能需要额外的诱导因子，并通过执行JUNB ChIP‐Seq分析来研究AP‐1结合水平。然而，在T细胞中观察到很少的基础水平AP-1结合B类（图5D） ，AP‐1结合在TB类 +刺激后，pDHS高度富集，与升高的AP‐1家族mRNA水平一致（图电动汽车1A） 以及观察到的AP‐1基序和ChIP峰的分布（图5B、，附录图S4). 我们之前展示过福斯mRNA在T细胞中被诱导N个在母细胞转化过程中通过ConA(附录图S1A). 这些数据支持这样的观点，即AP‐1在pDHS的生成和随后的重新激活中发挥作用，但不一定是pDHS稳定状态的维持福斯，福斯，和六月检测到mRNA（图电动汽车1A） ●●●●。

T的一个具体示例M（M）包含预测基序并显示ChIP富集的特异性DHS如图所示5E表示瞬时受体电位M6(事务处理程序6)包含多个T的轨迹M（M）/T型B类特定DHS。在−3.2 kb和+21 kb pDHS下，检测到T中RUNX1和ETS‐1的ChIP峰值B类但不是TN个重要的是，这两个因子的基序都存在于超敏区。在−2.4‐kb DHS中，我们识别出一个RUNX基序，但没有ETS基序，这反映在RUNX1而不是ETS‐1的结合上。此外，该基因座中至少有6个DHS包含AP‐1基序，这可以通过T中特定的JUNB结合反映出来B类 +而不是TB类（图5E） ●●●●。

需要进一步研究RUNX1和ETS‐1的功能，但这是一个难以解决的问题，因为RUNX和ETS蛋白在T细胞发育和功能的许多方面发挥着重要作用（Muthusamy等，1995; Telfer&Rothenberg，2001; 江川等，2007). 我们开始初步尝试评估RUNX1在母细胞转化中的作用以及与pDHS相关的诱导性细胞因子基因的激活。为此，我们准备了TB类在存在抑制剂Ro5‐3335的情况下，据报道，该抑制剂抑制RUNX1功能（坎宁安等，2012)或以DMSO作为控制。在ConA激活CD4 T细胞的过程中加入抑制剂，然后用抑制剂和IL‐2培养细胞24小时。然而，抑制剂大大降低了作为活的非凋亡细胞在转化过程中存活的T细胞的比例(附录图S5A). 然而，当去除抑制剂并刺激存活的活细胞时，抑制剂的残余作用是抑制与pDHS相关的基因的诱导(Il4号机组，Il3，和CSF2型)但不包括被认为独立于pDHS的诱导基因或构成基因(天花和Cd2号机组) (附录图S5B). 这些数据与RUNX1在高效母细胞转化和记忆回忆响应方面的要求一致。

RUNX和ETS图案在T中占据B类和TM（M）

为了筛选潜在的额外因素，而不必推测用于ChIP分析的抗体，我们使用了我们最近开发的惠灵顿算法（Piper等，2013)执行生物信息学来自T的DNase-Seq数据上的DNase I足迹B类该算法对一种不平衡的模式进行了统计评分，即从封装外形的5′开始的正链读取和从封装外形3′开始的负链读取，跨越了作为读取次数减少的区域检测到的绑定位置。HOMER检测到的图案在这些足迹中的分布（图7A） 与在全长DHS中检测到的基序相似（图5A） RUNX和ETS是最突出的主题，占所有预测FP的一半以上。随后是STAT基序，代表另一个可能影响pDHS形成的诱导因子家族。图7B描述了每个受保护RUNX、ETS和STAT基序FP周围的相对DNase I剖面，显示了上链（红色）与下链（绿色）DNaseⅠ切割的相对密度。图中显示了足迹AP-1、KLF、GATA和RFX图案的等效轮廓电动汽车4A.根据入住率得分的增加订购FP，最突出的模式代表最佳FP（图7B和电动汽车4A） ●●●●。数字7B和电动汽车4A还显示了DNA酶I的平均剖面，以说明围绕基序的上链（红色）和下链（蓝色）的平均切割。在T细胞中检测到类似的足迹RUNX和ETS基序模式M（M）（图7C和电动汽车4B） ●●●●。对足迹ETS和RUNX基序位置的评估显示，T细胞与pDHS的结合模式相同M（M）如T中共享DHS所示N个（图电动汽车4C） ●●●●。T中占用的ETS和/或RUNX图案示例B类显示了位于3.7 kb和35 kb上游的2个pDHSCcl1公司其中通过ChIP‐Seq证明了ETS‐1和RUNX1的结合（图7D） ●●●●。与pDHS在启动诱导基因表达中的作用一致，Ccl1公司在T中上调更有效B类和TM（M）与T相比N个（图7E） ●●●●。我们还使用上述用于测试IL3号机组pDHS公司。类似于IL3号机组pDHS，这两个Ccl1公司pDHS在转染试验中没有显著的增强子活性（图7F） ●●●●。

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本构模型TF公司s是脚印体内在里面pDHS公司秒

  1. 丰富的图案由HOMER（主页）使用从头开始的数字图像的motif搜索DN（公称直径）以I为例FP公司中确定的pDHS公司中的T型B类。
  2. DN（公称直径）酶I切割模式T型B类来自FP公司由惠灵顿在pDHS公司s以顶部命名的图案为中心，并按递增顺序排列FP公司入住率得分。左：切割显示在一个200 bp的窗口中，其中有正（红色）和负（绿色）链失衡DN（公称直径）当我切的时候。右：实际的平均剖面DN（公称直径）ase I在pDHS公司s、 带上部钢绞线DNA切割显示为红色，下链切割显示为蓝色。
  3. 平均概况DN（公称直径）ase I在pDHS公司中的T型M（M）如（B）所示。
  4. 的示例FP公司−3.7-kb和−35-kb的图案和图案pDHS公司s位于Ccl1公司基因座T型B类。
  5. 信使核糖核酸数组值Ccl1公司表达式。
  6. 刺激Jurkat T细胞的荧光素酶报告基因检测如图所示1的H伊利诺伊州三启动子单独或与Ccl1公司−3.7‐kb或−35-kb国土安全部s、 带有标准偏差值表示为平均值，每个值的重复次数为(n个)如下所示。
  7. 的足迹AP公司‐1个站点T型B类 +。DN（公称直径）ase I上链和下链的解理模式计算为（B）（左）加上平均值DN（公称直径）所有用户的ase I配置文件（右）AP公司‐定义的2882子集中的1个图案pDHS公司中的T型B类刺激前后的细胞，按降序排列计划概率得分。
  8. 分配FP公司（G）中所示数据的概率分数。

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DN（公称直径）ase I的足迹TF公司中的T型B类

  1. 左侧：DN（公称直径）Wellington在pDHS公司s以顶部命名的图案为中心，并按递增顺序排列FP公司入住率得分。的相对水平DN（公称直径）ase I切割显示在一个200 bp的窗口中，带有上链DNA切割显示为红色，下链切割显示为绿色。右：的平均配置文件DN（公称直径）因为我在pDHS公司s、 上部钢绞线DNA切割显示为红色，下链切割显示为蓝色。
  2. 的结果HOMER（主页） 从头开始的主题搜索pDHS公司数字足迹区域光盘4T型M（M）。
  3. 电动滑行系统和RUNX（运行）图案包含脚印（右）国土安全部中的T型M（M）按排序T型M（M）/T型N个折叠更改（左侧）。

在非刺激性T细胞中pDHS FPs的比例要小得多B类与占据RUNX和ETS基序的数量相比，（4%）包含占据的AP‐1基序（图7A） ●●●●。然而，刺激后，AP-1位点的保护作用在TB类 +(P（P） = 10−51，图7G） ，与增加的JUNB绑定一致（图5D） 用PMA/I治疗后发生的情况。这可以通过足迹概率得分的分布反映出来（图7H） ●●●●。

总之，我们的ChIP和足迹分析表明，RUNX1和ETS‐1与诱导因子（如AP‐1）合作建立pDHS，并且在维持这些位点的开放染色质方面起着重要作用。

诱导转录因子与组成转录因子的比率决定了短暂和稳定DHS的特性

接下来，我们讨论了在T细胞中组成型pDHS和高度诱导型iDHS的区别问题B类 +。为此，我们执行了从头开始的使用1217个最丰富的iDHS子集进行motif搜索（图8A） ●●●●。T中iDHS的图案分布B类 +在T中与pDHS显著不同B类因为该模式主要由可诱导TFs AP-1（58%）和NFAT（56%）的基序控制。其中许多是首次描述用于伊利2发起人和CSF2型增强器（斗鸡等，1995; 陈等，1998)，并在上面的事务处理程序6+23‐kb iDHS（图5E） ●●●●。图中所示的全长复合NFAT/AP‐1图案8A存在于34%的iDHS中，其也富含TF的诱导型EGR和NF-κB家族的基序。iDHS中RUNX基序的富集率（12%）明显低于pDHS（47%），ETS基序根本没有富集。这些结果得到了50 bp内模体共现的统计显著性自举分析的支持，这表明诱导因子（而非ETS‐1或RUNX1）共同定位于iDHS（图电动汽车5A） ●●●●。

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可诱导的国土安全部s结合诱导和组成性表达转录因子

  1. 从头开始1217的主题搜索iDHS公司s使用HOMER（主页）。
  2. Motif分布在国土安全部s按递增顺序排列DN（公称直径）ase-Seq标签计数信号光盘4T型B类 +单元格与T型B类单元格，如图所示4答：。
  3. RUNX（运行）1和6月中国IP（IP）描述所有绑定的序列密度图国土安全部如（B）所示订购。
  4. RUNX（运行）1和6月中国IP（IP）‐序列配置文件国土安全部s位于伊尔10基因座T型B类和T型B类 +。
  5. DN（公称直径）ase I解理链不平衡模式如图所示7G代表足迹TF公司中的图案T型B类 +在iDHS公司第条。
  6. 的示例FP公司−15kb和−35kb的图案和图案iDHS公司中的T型B类 +单元格位于Ccl1公司轨迹。

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诱导物的联合TF公司中的iDHS公司秒

  1. 基序共联想丰富性的层次聚类iDHS公司s.Z评分表示在1000个随机选择的染色质可及区域中计算的观察到的与背景相关的丰富程度。Z分度表如图所示6答：。
  2. UCSC公司基因组浏览器截图Il4号机组，Il13，和半径50轨迹显示DN（公称直径）ase-Seq和ChIP（IP）‐顺序T型B类和T型B类 +。
  3. 从头开始图案由HOMER（主页）在内部iDHS公司数字的FP公司第条。
  4. 的平均配置文件DN（公称直径）因为我在iDHS公司s.上部钢绞线DNA切割用红色显示，下链切割用蓝色显示。

诱导型TF基序被映射回组合的TB类和TB类 +DHS数据集（图8B） ，再次根据DHS在T中的富集程度排名B类 +与T相比B类如图所示4答：这表明诱导型TF结合位点在iDHS中高度富集，并且主要位于其中心。相反，RUNX基序和RUNX1绑定的DHS被划分为共享DHS和iDHS（图8B和C），与T中观察到的类似B类和TN个分析（图5B） ●●●●。然而，ChIP‐Seq分析表明，RUNX1仅在刺激后与iDHS结合（图8C） ●●●●。JUNB ChIP‐Seq还证实，只有当细胞受到刺激时，AP‐1才会特异性结合到诱导位点（图8C） ●●●●。相反，刺激后丢失的dDHS不包含AP-1基序。无法招募AP‐1很可能使他们容易受到染色质重塑的影响，而染色质重塑源自其他与AP‐2结合的邻近DHS。

针对伊尔10轨迹（图8D） 其中，RUNX1和JUNB仅在T中绑定到−24‐kb和−30‐kb iDHSB类 +RUNX1在刺激前也与−9‐kb和−26‐kbpDHS结合，而AP‐1仅在用PMA/I处理后与这些位点结合。在Th2细胞因子基因位点观察到类似的结合模式（图电动汽车5B） ●●●●。惠灵顿FP对T的分析B类 +DNase‐Seq数据显示iDHS上有很强的足迹，其中AP-1、NFAT和EGR基序是最丰富的占据基序（图8E和电动汽车5C和D）。这一结果与iDHS富含由多种可诱导TF占据的基序的概念一致，这些基序对并发信号作出响应。此处显示的AP-1和AP-1/NFAT FP示例适用于位于Ccl1公司基因座。在这种情况下，−35‐kb DHS代表了先前存在的DHS，该DHS招募了AP‐1，并在刺激后成为更广泛的DHS。总的来说，我们的分析发现pDHS和iDHS之间的结合基序组成存在显著差异的强烈趋势。

上述研究表明，iDHS和pDHS结合一组常见的诱导和组成表达的转录因子，但在染色质内表现出不同的动力学行为，其中一类结合位点保持不变，而另一类没有。为了进一步研究这种差异的原因，我们测定了每类DHS中最丰富人群中每个DHS的基序数。为此，我们将1217个iDHS的最特异亚群与TM（M）为了进一步验证TB类作为T的代理模型M（M），我们还分析了在TB类和TN个（图9A和B），因为这些应给出与T相同的模式M（M）如预期，TM（M）‐和TB类特定DHS具有基本相同的基序组成，RUNX、ETS和STAT基序丰富，而NFAT和AP-1基序在iDHS中更为常见（图9A） ●●●●。我们将每个数据集的5个最丰富的诱导因子基序（AP‐1、NFAT、EGR、NF‐κB和CREB/ATF）的基序计数和5个最充分的构成因子基序的基序（ETS、RUNX、KLF、GATA和E‐box）制成表格（图9B） ●●●●。用于此目的的图案被确定为从头开始的上面HOMER的图案(数据集EV5). 对ChIP峰的分析证实，ETS‐1和RUNX1分别与2882 pDHS中的三分之二结合（图9C） ●●●●。总的来说，这些分析表明TM（M）‐和TB类特异性pDHS包含的构成因子基序是诱导因子基序的三倍，而诱导因子与构成因子结合位点之比为二比一的iDHS则相反。此外，对pDHS和iDHS中的共定位基序的比较表明，pDHS中诱导和构成因子结合位点之间的共定位很强，而iDHS没有（图6A和电动汽车5A） ●●●●。这些不同的基序组成以+9‐kb pDHS和+6.5‐kbiDHS为例协同效应3基因座、Th2 LCR和Cxcr3号机组轨迹(附录图S6). 在协同效应3+9‐kb pDHS，还有一个复合ETS/RUNX图案的示例，如图所示5答：。

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的组成和性质pDHS公司s和iDHS公司秒

  1. 主题内容丰富TF公司特定的结合位点国土安全部中的T型M（M），T型B类、和T型B类 +。
  2. 5个诱导基序的总基序数(AP公司‐1,美国国家足球协会，废气再循环，法国试验标准κB，以及CREB公司/自动变速箱油)和5个构成主题(电动滑行系统，RUNX（运行），荷兰皇家空军，《服务贸易总协定》和E‐box）国土安全部中的T型M（M），T型B类、和T型B类 +。此处使用的图案定义见数据集EV5。
  3. 之间的重叠电动滑行系统‐1和RUNX（运行）1通道IP（IP）峰值和2882pDHS公司中的T型N个与相比T型B类。
  4. 的机制pDHS公司和iDHS公司T细胞的调节。

综上所述，这些数据表明了一个模型，根据该模型顺式元素决定转录因子组装和维持的动力学行为以及核小体占有率（图9D） ●●●●。这一发现支持了一个模型，即T细胞免疫记忆的获得是在母细胞转化过程中由诱导因子驱动的，诱导因子能够重新分配先前存在的因子。该模型的关键是，一旦pDHS形成，与pDHS结合的组成因子的密度足以长期维持它们，但在没有诱导因子的额外支持的情况下，不足以最初产生这些DHS。诱导型DHS的情况恰恰相反，它使用高密度的诱导基序作为快速反应元件，一旦诱导刺激被去除，就无法维持。此外，还有许多其他DHS共享pDHS和iDHS的一些属性。

讨论

这项研究极大地提高了我们对支持细胞长期保持稳定分子记忆的基本分子机制的理解，这些细胞以前对瞬态刺激有反应。在我们的模型中，由幼稚T细胞初级反应激活的诱导因子引导先前存在的因子ETS‐1和RUNX1重新定位到数千个新建立的pDHS，这些pDHS仍与pDHS相关，并在初始刺激停止后继续修改染色质结构。由于图5A是一个复合ETS/RUNX基序，协同结合这些因素（Hollenhorst等，2009). 根据这里描述的功能和相关研究，许多pDHS并不是典型的经典增强子，而是在没有刺激的情况下在近距离内保持活性染色质的区域状态，并增加诱导增强子对直接免疫回忆反应的因素的可及性。值得注意的是，诱导增强子的染色质与TM（M）和TB类在T中无法访问N个因此，这些元素无法有效地对相同的刺激作出反应。为了支持pDHS起促进作用的观点，我们证明了在先前激活的T细胞中基因的优先诱导与（i）pDHS与iDHS之间的紧密联系，以及（ii）iDHS与这些可诱导基因的TSS之间的密切联系。值得注意的是，与经典增强子相比，pDHS的存在或缺失对附近基因的稳态转录几乎没有影响。其他人最近也观察到，与单纯存在开放染色质或活性组蛋白修饰相比，TF结合的证据是增强功能更可靠的指南（Kwasnieski等，2014; 多甘等，2015). 考虑到这些被测试的修饰区域中只有11%具有较强的增强子活性（Kwasnieski等，2014)显然，越来越需要定义不同类别的远端调控元件。

我们的数据还提供了一个有价值的资源，定义了T细胞中所有潜在的诱导增强子，以及激活这些增强子所需的因素。驱动活化T细胞中诱导基因表达的机制已在许多单个基因座上得到明确定义，包括上述细胞因子基因。这通常涉及TCR信号通路对NFAT、AP‐1和NF‐κB的诱导，后者反过来介导启动子和增强子处DHS的诱导以及mRNA表达的激活。这里我们显示，所有iDHS中有三分之一使用复合NFAT/AP‐1元素，其中NFAT和AP‐1已知会协同结合。我们之前报道过这种机制CSF2型轨迹（斗鸡等，1995; 约翰逊等，2004)在当前研究中，我们定义了支持NFAT和AP-1合作绑定的共识序列，以实现iDHS的完整补充。此外，我们的研究为为什么iDHS的这些增强子在T中不起作用提供了坚实的基础N个，即使TN个在激活时有效表达NFAT和AP-1，这仅仅是因为它们的染色质是不可接近的。

有趣的是，pDHS和iDHS基本上使用同一组TF，但它们的行为方式截然不同。我们提供了令人信服的全球证据，证明构成型与诱导型TF基序比率的差异区分了这两类调控元件并解释了它们的特性。pDHS中诱导性TF基序的低密度与在母细胞转化期间需要大量接触TCR信号，然后才能获得包含这些元素的染色质有关。然而，一旦通过这种“击中并逃跑”机制激活，它们的高密度构成TF基序就可以让它们保持可访问性。相反，iDHS中高密度的诱导性TF基序加上低密度的组成性TF模序确保了它们的严格调控，从而快速诱导，但一旦刺激物被移除，它们很容易被核小体重新占据。

先前的研究发现，DHS的一个子集和与DHS结合的TF的一个子集中可以在有丝分裂期间维持（Martinez‐Balbas等，1995; 卡杜克等，2012; 香等，2015). 这些研究将GATA‐1定义为一种有丝分裂书签因子。然而，这些研究还发现，大多数有丝分裂保存的DHS定位于启动子，而包括增强子在内的大多数远端DHS被清除。事实上，pDHS在多轮细胞分裂过程中保持不变，这表明pDHS可能形成一类远端元件，与大多数增强子不同，它们可以在有丝分裂期间维持可接近的染色质。这更可能是因为pDHS结合了共同定位、组成性表达的TF，如RUNX1和ETS‐1，这些TF可以协同结合到复合ETS/RUNX元素（Hollenhorst等，2009). 在这种情况下，值得注意的是RUNX转录因子家族的所有成员都与有丝分裂染色质（Young等，2007; 巴克什等，2008; 潘德等，2009). 转录因子复合物招募染色质修饰物，pDHS两侧的染色质区域由活性修饰H3K4me2和H3K27ac标记，这可以吸引含有PHD结构域或Bromo结构域的染色质附加修饰复合物。我们在这里显示pDHS与共激活物BRD4结合，其结合也在有丝分裂期间保持（Zhao等，2011). 因此，我们建议pDHS包含稳定的转录因子复合物，在细胞分裂期间保持这些元素无核小体，从而创建更松散和更动态的染色质结构，（i）允许在细胞分裂后重新组装整个复合物，（ii）将更多染色质结合的DNA暴露给寻找结合位点的诱导TF。

我们目前的工作也增加了我们对分化T细胞中关键免疫调节因子的紧密调控的上下文依赖性表达的理解，例如Il4号机组Th2细胞和Cxcr3号机组Th1细胞中。在未提交T中首次激活时N个，这两个基因利用一组相似的TF来建立特定的pDHS和iDHS。然而，它们的pDHS在存在的额外GATA和T‐box基序方面有所不同，这使得它们能够以一种可访问的状态存在，随时准备响应其他替代信号。这样，非极化TB类能够响应GATA‐3与Th2 LCR GATA基序的结合，或TBX21与T‐box基序的连接Cxcr3号机组−3‐kb pDHS，取决于它们随后遇到的Th2或Th1分化诱导信号。因此，我们认为，pDHS的获得代表了一种染色质印迹的形式，在所有类型的T细胞首次激活时普遍使用，而不管它们是CD4还是CD8 T细胞，并且与随后的分化决定无关。其他人也预测了H3K4me2标记的染色质区域在支持Th1和Th2细胞（Seumois）基因激活中的作用等，2014)，但建立这种模式的机制尚不清楚。本文所述的机制也可能有助于解释一类预先存在的DHS的起源，这些DHS存在于活化的T细胞中，并在调节性T细胞分化过程中募集FOXP3（Samstein等，2012). 综上所述，这组证据支持了一种新的观点，即建立免疫记忆的关键步骤确实发生在幼稚T细胞激活的初始阶段，而不是在随后的分化阶段，即补充额外的细胞类型特异性TF（Badovinac等，2005; 凯泽尔斯卡等，2007; 俄罗斯等，2014; 克朗普顿等，2015).

最后，但并非最不重要的是，我们的工作解释了之前的研究，这些研究表明T细胞中激活和抑制染色质标记的分布存在差异N个和TM（M）（Rothenberg和Zhang，2012)并提供了这些模式背后可能的监管机制。最近的一项研究发现T细胞中DNA甲基化水平较低M（M）通常与较高水平的刺激诱导有关（小森等，2015). 也有证据表明抑制性H3K27me3修饰的缺失与效应T细胞（荒木等，2009). 然而，并非所有的诱导性TM（M）特异性基因以较高水平的H3K27me3或T细胞DNA甲基化为标志N个TCR激活前（Mirabella等，2010; 泽迪亚克等，2011). 因此，这些修饰不能单独对幼稚T细胞中的沉默基因状态负责。我们现在的研究表明，至少有两种平行的调控模式控制记忆性T细胞基因表达程序的建立：一种涉及H3K27me3的丢失和H3K4me3的获得，主要在启动子处，另一种涉及从头开始的激活与H3K4me2相关的一组主要是远端调控元件。在诱导基因的情况下，我们的数据表明，记忆T细胞中的记忆回忆效应主要不是由于幼稚细胞中抑制性修饰的丢失。相反，这是T中不活跃的致密染色质固有的不可接近性N个以及获得主动修改以增加T中的可访问性B类和TN个这使得基因重新激活成为一个更有效的过程。我们在此将其作为一种基本机制，有可能确保免疫系统的严密调节（图​（图9D），9D） ，这可能在T细胞获得免疫记忆中起主要作用，并将染色质的可及性置于转录调节物结合的核心。

材料和方法

详细方法见附录中的补充方法。

老鼠

含有人类130 kb AgeI基因组DNA片段的C42转基因小鼠IL3/CSF2型以前描述过C57BL/6J背景上的基因座（米拉贝拉等，2010). 涉及这些小鼠的研究得到了英国内政部动物许可证PPL 40/3086的伦理审查批准。

细胞培养和纯化

T型N个和TM（M）使用MACS（Miltenyi）和Easy Sep（干细胞技术）纯化试剂盒（参见附录补充方法). T型B类由纯化T生成N个5×10培养5细胞/ml，并用2μg/ml刀豆球蛋白A活化40小时。细胞保持在5×105在收获前，每毫升细胞在50 U/ml IL‐2（Peprotech）中再培养2-3天。用20 ng/ml佛波酯醋酸酯（PMA）和2μM钙离子载体（I）刺激细胞长达4小时。

DNase I‐超敏位点分析

如前所述（伯特等，2007). 中提供了更详细的协议附录补充方法。

染色质免疫沉淀

如前所述，对H3K4me2和H3K27ac抗体进行了ChIP（Lichtinger等，2012). 对于所有其他抗体，按照附录中的补充方法。

mRNA表达分析

使用TRIzol（Invitrogen）从细胞中提取总RNA。RNA要么（i）使用M‐MLV逆转录酶（Invitrogen）逆转录成cDNA，以通过定量PCR进行分析，要么（ii）准备用于微阵列分析(附录中的补充方法).

图书馆准备

从DNase I或ChIP样本中的~10 ng DNA制备测序用DNA文库。未经处理的CD4和CD8 T的DNA酶序列库N个和TB类准备在SOLiD上测序™平台符合制造商的说明（Applied Biosystems）。根据制造商的说明（Illumina），使用Tru‐Seq库准备套件准备所有其他库。

生物信息学和数据分析

详细数据分析见附录中的补充方法。

公共数据集

幼稚CD4 T细胞中的H3K27me3 ChIP‐Seq数据集[（Wei等，2009)，GEO登录号GSM361998标准]、天真、效应、记忆CD8 T细胞[（Russ等，2014)，SRA登录号分别为SRX793474、SRX793485，Th2细胞[（Wei等，2009)，GEO登录号GSM362002标准]以及ENCODE Jurkat DNaseI‐Seq[（瑟曼等，2012)，GEO登录号GSM736501型]和幼稚CD4 T细胞中的H3K27ac[（Lara‐Astiaso等，2014)，GEO登录号GSM1441281型]如上所述进行检索、对齐和处理，并选择使用UCSC基因组浏览器进行查看。

作者贡献

SLB、EB、RCJ、LNG和PNC进行了实验室研究，PC、JP、NL和SO进行了生物信息学分析，SLB、PC、CB和PNC设计了实验并编写了手稿。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

支持信息

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数据集EV1

数据集EV2

数据集EV3

数据集EV4

数据集EV5

审查过程文件

致谢

这项工作得到了BBSRC和Bloodwise的支持。我们感谢Steve Kissane在DNA测序和微阵列分析方面的帮助，感谢Maria Rosaria Imperato在mRNA分析方面的协助，感谢Matthew MacKenzie在细胞分选方面的帮助以及Andrew Bert、Fabio Mirabella、Euan Baxter、Sally James、Aude Marine Bonavita、，以及Sarion Bowers，以协助开展本研究之前的大量实验工作。我们感谢彼得·莱恩（Peter Lane）和大卫·威瑟斯（David Withers）就记忆T细胞的特性提出的宝贵建议。

笔记

欧洲分子生物学组织(2016)35：515–535[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

工具书类

  • 阿加瓦尔·S、拉奥·A（1998）染色质结构的调节调节T细胞分化过程中细胞因子基因的表达。免疫 9: 765–775[公共医学][谷歌学者]
  • Araki Y、Fann M、Wersto R、Weng NP（2008）组蛋白乙酰化通过效应分子（中胚层蛋白及其靶点：穿孔素和颗粒酶B）的差异表达促进快速而稳健的记忆CD8 T细胞反应。免疫学杂志 180：8102–8108[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Araki Y、Wang Z、Zang C、Wood WH III、Schones D、Cui K、Roh TY、Lhotsky B、Wersto RP、Peng W、Becker KG、Zhao K、Weng NP（2009）组蛋白甲基化的全基因组分析揭示了基于染色质状态的基因转录调控和记忆CD8的功能+T细胞。免疫 30: 912–925[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Badovinac副总裁，Messingham KA，Jabbari A，Haring JS，Harty JT（2005）加速CD8+树突状细胞接种后的T细胞记忆和初始增强反应。自然·医学 11: 748–756[公共医学][谷歌学者]
  • Bakshi R、Zaidi SK、Pande S、Hassan MQ、Young DW、Montecino M、Lian JB、van Wijnen AJ、Stein JL、Stein GS（2008）致白血病t（8；21）融合蛋白AML1‐ETO控制rRNA基因并与有丝分裂染色体上的核仁组织区域相关。细胞科学杂志 121: 3981–3990[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Baxter EW、Mirabella F、Bowers SR、James SR、Bonavita AM、Bertrand E、Strogantsev R、Hawwari A、Bert AG、Gonzalez de Arce A、West AG、Bonifer C、Cockerill PN（2012）人IL-3/GM-CSF基因座的诱导性组织特异性表达由一系列复杂的发育调节增强子控制。免疫学杂志 189: 4459–4469[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bert AG、Johnson BV、Baxter EW、Cockerill PN（2007）模块增强子受GATA和NFAT元件的差异调节，这些元件指导核小体定位和诱导染色质重塑的不同组织特异模式。摩尔细胞生物学 27: 2870–2885[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brownlie RJ，Zamoyska R（2013）T细胞受体信号网络：分支、多样和有界。Nat Rev免疫学 13: 257–269[公共医学][谷歌学者]
  • Chen L，Glover JN，Hogan PG，Rao A，Harrison SC（1998年）NFAT、Fos和Jun中与DNA特异结合的DNA结合域的结构。自然 392: 42–48[公共医学][谷歌学者]
  • Cockerill PN、Bert AG、Jenkins F、Ryan GR、Shannon MF、Vadas MA（1995）人类GM‐CSF增强子功能与AP‐1和NFATp/c之间的协同作用有关。摩尔细胞生物学 15: 2071–2079[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Cockerill PN，Bert AG，Roberts D，Vadas MA（1999）人类粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因是自主调节的体内通过可诱导的组织特异性增强子。《美国科学院院刊》 96: 15097–15102[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 科克里尔PN（2004）诱导组织特异性启动子和增强子对人IL-3/GM-CSF基因座的转录调控机制。Crit Rev免疫学 24: 385–408[公共医学][谷歌学者]
  • Cockerill PN（2011）活性染色质和DNase I超敏位点的结构和功能。2月J日 278: 2182–2210[谷歌学者]
  • Crompton JG、Narayanan M、Cuddapah S、Roychoudhuri R、Ji Y、Yang W、Patel SJ、Sukumar M、Palmer DC、Peng W、Wang E、Maricola FM、Klebanoff CA、Zhao K、Tsang JS、Gattinoni L、Restifo NP（2015）CD8 T细胞亚群的世系关系通过表观遗传景观的渐进变化揭示。细胞分子免疫数字对象标识：10.1038/cmi.2015.032 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 坎宁安（Cunningham L）、芬克贝纳（Finckbeiner S）、海德（Hyde RK）、索思豪尔（Southall N）、马鲁根（Marugan J）、叶达瓦利（Yedavalli）、德戴什蒂（Dehdashti）、莱因霍尔德（Reinhold）、阿莱姆（Alemu L）和赵（Zhao L）、叶（Yeh JR）、苏德（Sood R）、波米耶（Pommie通过定量高通量筛选RUNX1‐CBFβ相互作用鉴定苯二氮卓Ro5‐3335作为CBF白血病抑制剂。《美国科学院院刊》 109: 14592–14597[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dogan N、Wu W、Morrissey CS、Chen KB、Stonestrom A、Long M、Keller CA、Cheng Y、Jain D、Visel A、Pennacchio LA、Weiss MJ、Blobel GA、Hardison RC（2015）与组蛋白修饰或染色质可及性相比，关键转录因子的占用是增强子活性的更准确预测因子。表观遗传学染色质 8: 16[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Egawa T、Tillman RE、Naoe Y、Taniuchi I、Littman DR（2007）Runx转录因子在胸腺细胞分化和原始T细胞稳态中的作用。实验医学杂志 204: 1945–1957[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Fields PE、Lee GR、Kim ST、Bartsevich VV、Flavell RA（2004年）Th2细胞因子位点控制区中Th2特异性染色质重塑和增强子活性。免疫 21: 865–876[公共医学][谷歌学者]
  • 桥本（Hashimoto）S、Ogoshi K、Sasaki A、Abe J、Qu W、Nakatani Y、Ahsan B、Oshima K、Shand FH、Ametani A、Suzuki Y、Kaneko S、Wada T、Hattori M、Sugano S、Morishita S、Matsushima K（2013）抗原特异性记忆CD4 T细胞DNA甲基化的协同变化。免疫学杂志 190: 4076–4091[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hawwari A、Burrows J、Vadas MA、Cockerill PN（2002）人类IL‐3基因座由两种具有不同组织特异性活性的NFAT依赖性增强子协同调节。免疫学杂志 169: 1876–1886[公共医学][谷歌学者]
  • Heinz S、Romanoski CE、Benner C、Allison KA、Kaikkonen MU、Orozco LD、Glass CK（2013）自然遗传变异对增强子选择和功能的影响。自然 503: 487–492[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hogan PG、Chen L、Nardone J、Rao A（2003）钙、钙调神经磷酸酶和NFAT的转录调控。基因开发 17: 2205–2232[公共医学][谷歌学者]
  • Hollenhorst PC、Chandler KJ、Poulsen RL、Johnson WE、Speck NA、Graves BJ（2009）与不同转录因子功能相关的DNA特异性决定簇。公共科学图书馆-基因 5：e1000778[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hsung CC、Morrissey CS、Udugama M、Frank CL、Keller CA、Baek S、Giardine B、Crawford GE、Sung MH、Hardison RC、Blobel GA（2015）基因组可及性在有丝分裂期间被广泛保存并受到局部调节。基因组研究 25: 213–225[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Johnson BV、Bert AG、Ryan GR、Condina A、Cockerill PN（2004）GM‐CSF增强子激活需要NFAT和AP‐1元件之间的合作，并与广泛的核小体重组相关。摩尔细胞生物学 24：7914–7930[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jones EA，Flavell RA（2005）远端增强子元件转录IL-10家族基因簇中的基因间RNA。免疫学杂志 175: 7437–7446[公共医学][谷歌学者]
  • Kadauke S、Udugama MI、Pawlicki JM、Achtman JC、Jain DP、Cheng Y、Hardison RC、Blobel GA（2012）造血转录因子GATA1的组织特异性有丝分裂标记。单元格 150: 725–737[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kedzierska K、Stambas J、Jenkins MR、Keating R、Turner SJ、Doherty PC（2007）定位而非CD62L表型在流感特异性CD8的早期建立中至关重要+T细胞存储器。《美国科学院院刊》 104: 9782–9787[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Komori HK、Hart T、LaMere SA、Chew PV、Salomon DR（2015）通过CpG DNA甲基化的表观遗传景观定义CD4 T细胞记忆。免疫学杂志 194: 1565–1579[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kwasnieski JC、Fiore C、Chaudhari HG、Cohen BA（2014）ENCODE分段预测的高通量功能测试。基因组研究 24: 1595–1602[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lara‐Astiaso D、Weiner A、Lorenzo‐Vivas E、Zaretsky I、Jaitin DA、David E、Keren‐Shaul H、Mildner A、Winter D、Jung S、Friedman N、Amit I（2014）免疫遗传学。血液形成过程中的染色质状态动力学。科学 345：943–949[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lee GR，Fields PE，Flavell RA（2001）远端调节元件和GATA‐3在染色质水平对IL‐4基因表达的调节。免疫 14: 447–459[公共医学][谷歌学者]
  • Lee GR、Spilianakis CG、Flavell RA（2005）TH2基因座控制区的超敏位点7对于表达TH2细胞因子基因和长期染色体内相互作用至关重要。自然免疫 6: 42–48[公共医学][谷歌学者]
  • Lichtinger M、Ingram R、Hannah R、Muller D、Clarke D、Assi SA、Lie ALM、Noailles L、Vijayabaskar MS、Wu M、Tenen DG、Westhead DR、Kouskoff V、Lacaud G、Gottgens B、Bonifer C（2012）RUNX1在造血开始时重塑表观遗传景观。欧洲工商管理硕士J 31: 4318–4333[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Martinez‐Balbas MA、Dey A、Rabindran SK、Ozato K、Wu C（1995年）序列特异性转录因子从有丝分裂染色质中的置换。单元格 83: 29–38[公共医学][谷歌学者]
  • Mirabella F、Baxter EW、Boissinot M、James SR、Cockerill PN（2010年）人IL-3/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因座在未成熟胸腺细胞中表现为表观遗传沉默，并在T细胞发育过程中逐渐激活。免疫学杂志 184: 3043–3054[公共医学][谷歌学者]
  • Muthusamy N、Barton K、Leiden JM（1995年）缺乏Ets-1转录因子的T细胞的缺陷激活和存活。自然 377: 639–642[公共医学][谷歌学者]
  • Nakayama T、Yamashita M（2009年）多梳和三胸复合体在维持CD4 T细胞记忆中的关键作用。Semin免疫学 21: 78–83[公共医学][谷歌学者]
  • Pande S、Ali SA、Dowdy C、Zaidi SK、Ito K、Ito Y、Montecino MA、Lian JB、Stein JL、van Wijnen AJ、Stein GS（2009）Runx3抑癌基因的亚核靶向性及其与有丝分裂染色体的表观遗传关联。J细胞生理学 218：473–479[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Piper J、Elze MC、Cauchy P、Cockerill PN、Bonifer C、Ott S（2013）惠灵顿：一种从DNA序列数据中准确识别数字基因组足迹的新方法。核酸研究 41：e201[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rivera CM、Ren B（2013）绘制人类表观基因组。单元格 155: 39–55[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rogers PR、Dubey C、Swain SL（2000）记忆性T细胞生成伴随着质的变化：低剂量抗原下更快、更有效的反应。免疫学杂志 164: 2338–2346[公共医学][谷歌学者]
  • Rothenberg EV，Zhang JA（2012）T细胞特性和表观遗传记忆。当前顶级微生物免疫 356: 117–143[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Russ BE、Olshanksy M、Smallwood HS、Li J、Denton AE、Prier JE、Stock AT、Croom HA、Cullen JG、Nguyen ML、Rowe S、Olson MR、Finkelstein DB、Kelso A、Thomas PG、Speed TP、Rao S、Turner SJ（2014）不同的表观遗传特征描述了病毒特异性CD8（+）T细胞分化过程中的转录程序。免疫 41: 853–865[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Samstein RM、Arvey A、Josefowicz SZ、Peng X、Reynolds A、Sandstrom R、Neph S、Sabo P、Kim JM、Liao W、Li MO、Leslie C、Stamatoyannopoulos JA、Rudensky AY（2012）Foxp3利用预先存在的增强子环境来规范调节性T细胞谱系。单元格 151: 153–166[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Seumois G、Chavez L、Gerasimova A、Lienhard M、Omran N、Kalinke L、Vedanayagam M、Ganesan AP、Chawla A、Djukanovic R、Ansel KM、Peters B、Rao A、Vijayanand P（2014）人类原代T细胞的表观基因组分析揭示了与TH2记忆细胞分化和哮喘易感性相关的增强因子。自然免疫 15: 777–788[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sprent J，Surh CD（2002）T细胞存储器。免疫年度收益 20: 551–579[公共医学][谷歌学者]
  • Telfer JC、Rothenberg EV（2001）小鼠CBFalpha2基因干细胞启动子的表达和功能：在自然杀伤细胞和T细胞发育中的不同作用和调节。求文献一篇 229：363–382[公共医学][谷歌学者]
  • Thurman RE、Rynes E、Humbert R、Vierstra J、Maurano MT、Haugen E、Sheffield NC、Stergachis AB、Wang H、Vernot B、Garg K、John S、Sandstrom R、Bates D、Boatman L、Canfield TK、Diegel M、Dunn D、Ebersol AK、Frum T等(2012)人类基因组的可访问染色质景观。自然 489: 75–82[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wei G、Wei L、Zhu J、Zang C、Hu‐Li J、Yao Z、Cui K、Kanno Y、Roh TY、Watford WT、Schones DE、Peng W、Sun HW、Paul WE、O'Shea JJ、Zhao K（2009）H3K4me3和H3K27me3的全球定位揭示了分化CD4的谱系命运决定的特异性和可塑性+T细胞。免疫 30: 155–167[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamashita M、Shinnakasu R、Nigo Y、Kimura M、Hasegawa A、Taniguchi M、Nakayama T（2004）白细胞介素-4对记忆性Th2细胞中白细胞介素-4基因座组蛋白修饰的非依赖性维持。生物化学杂志 279: 39454–39464[公共医学][谷歌学者]
  • Young DW、Hassan MQ、Pratap J、Galindo M、Zaidi SK、Lee SH、Yang X、Xie R、Javed A、Underwood JM、Furcinitti P、Imbalzano AN、Penman S、Nickerson JA、Montecino MA、Lian JB、Stein JL、van Wijnen AJ、Stein GS（2007）Runx2对rRNA基因的有丝分裂占有和谱系特异性转录控制。自然 445: 442–446[公共医学][谷歌学者]
  • Zediak副总裁，Johnnidis JB，Wherry EJ，Berger SL（2011年）前沿：静息记忆CD8+T细胞中效应基因位点的染色质持续开放，与转录状态无关。免疫学杂志 186: 2705–2709[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhao K、Wang W、Rando OJ、Xue Y、Swiderek K、Kuo A、Crabtree GR（1998）T淋巴细胞受体信号后SWI/SNF样BAF复合物与染色质的快速磷酸肌醇依赖性结合。单元格 95: 625–636[公共医学][谷歌学者]
  • Zhao R、Nakamura T、Fu Y、Lazar Z、Spector DL（2011）基因书签加速了有丝分裂后转录再激活的动力学。Nat细胞生物学 13: 1295–1304[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团