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开发单元。作者手稿；PMC 2017年3月7日提供。
以最终编辑形式发布为：
开发单元。2016年3月7日；36(5): 540–549.
数字对象标识：2016年10月10日/j.devcel.2016.02.012
PMCID公司：项目经理4766004
NIHMSID公司：NIHMS760116标准
PMID：26954548

在增殖的哺乳动物细胞中，氨基酸而非葡萄糖占细胞质量的大多数

亚伦·霍西奥斯,1,2 薇薇安·C·赫奇特,1,三 劳拉·V·达奈,1,2 马克·约翰逊,4 杰弗里·拉思梅尔,4 马修·斯坦豪泽,5,6,7 斯科特·马纳利斯,1,三和马修·范德·海登1,2,8,*
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摘要

细胞必须复制其质量才能增殖。葡萄糖和谷氨酰胺是哺乳动物细胞增殖所消耗的主要营养素，但这些营养素和其他营养素对细胞质量的贡献程度尚不清楚。我们量化了来自不同营养素的细胞质量分数，发现细胞中的大部分碳质量来自其他氨基酸，这些氨基酸的消耗速率远低于葡萄糖和谷氨酰胺。虽然葡萄糖碳具有不同的命运，但谷氨酰胺对蛋白质的贡献最大，这表明谷氨酰胺补充TCA循环中间产物（回补）的能力主要用于氨基酸生物合成。这些研究结果表明，营养物质的消耗速率与物质积累间接相关，并表明葡萄糖和谷氨酰胺的高消耗速率除了为生物合成提供碳外，还支持细胞的快速增殖。

介绍

快速增殖细胞与非增殖细胞有不同的代谢需求。在每个细胞周期中，增殖细胞必须合成复制细胞质量所需的所有成分(Lunt和Vander Heiden，2011年). 许多增殖细胞共有的一个代谢特征是，在有氧的情况下，乳酸的糖酵解通量很高，这一现象被称为有氧糖酵分解或Warburg效应。为什么包括癌细胞在内的增殖细胞消耗大量葡萄糖，而只将其中大部分碳作为乳酸排出，这是一个有争议的话题(品牌，1985年;Brand等人，1986年;DeBerardinis等人，2008年;Gatenby和Gillies，2004年;Hsu和Sabatini，2008年;休谟等人，1978年;Jiang和Deberardinis，2012年;Koppenol等人，2011年;Lunt和Vander Heiden，2011年;Newsholme等人，1985年;Vander Heiden等人，2009年;巴斯克斯等人，2010年). 一个广为接受的假设是，高糖酵解通量允许中间产物分流到合成代谢途径中，以支持生物量积累(品牌，1985年;Chaneton等人，2012年;Faubert等人，2013年;Hsu和Sabatini，2008年;休谟等人，1978年;Jiang和Debrardinis，2012年;Jiang等人，2011年;Lunt和Vander Heiden，2011年;Newsholme等人，1985年;Shestov等人，2014年;Vander Heiden等人，2009年;王和格林，2012年). 许多增殖的哺乳动物细胞也消耗大量的谷氨酰胺，谷氨酰胺也被假设为生物合成物质(品牌，1985年;Brand等人，1986年;Daye和Wellen，2012年;DeBerardinis等人，2007年;Hsu和Sabatini，2008年;王和格林，2012年). 谷氨酰胺或其他碳源可以向三羧酸（TCA）循环（回补）中添加新碳，以便将TCA循环中间产物从循环中移除，并用于在细胞中生产新的大分子(Daye和Wellen，2012年;DeBerardinis和Cheng，2010年;DeBerardinis等人，2007年;Lunt和Vander Heiden，2011年;Newsholme等人，1985年;王和格林，2012年)尽管谷氨酰胺或其他营养物质对生物量的贡献程度尚未确定。

这些假设隐含着这样一个概念，即摄入最多的营养素也是生物合成的主要贡献者，因此也是细胞质量的主要贡献器。这个假设尚未经过严格的测试，但它构成了理解癌症代谢的建模基础(Cascante等人，2002年;Shestov等人，2014年;Shlomi等人，2011年). 在大肠杆菌细胞质量的来源及其命运已被仔细量化(罗伯茨等人，1955年)对于在规定的最小培养基中生长的原营养菌株，培养基成分限制了可用于生产新生物量的营养物质。哺乳动物细胞并非如此；在组织和细胞培养中，哺乳动物细胞暴露于不同的代谢底物。虽然在几个系统中检测了各种营养素的相对摄取量(Jain等人，2012年;Paredes等人，1998年)，任何物质对生物量的贡献程度尚不清楚。

葡萄糖和谷氨酰胺在增殖细胞中的各种定性命运已被广泛研究，最近的工作表明，其他营养物质的代谢对增殖很重要，尽管这些替代燃料对细胞质量的净贡献尚未量化(Comerford等人，2014年;Kamphorst等人，2013年;Labuschagne等人，2014年;Maddocks等人，2013年;Schoors等人，2015年;Schug等人，2015年). 在这项研究中，我们定量测定了快速增殖的哺乳动物细胞中的细胞质量来源。令人惊讶的是，我们发现葡萄糖和谷氨酰胺这两种消耗率最高的营养素并不是碳对细胞质量的主要贡献者。相反，其他消耗率低得多的氨基酸共同构成了细胞中碳的大部分。研究这些营养素的生物合成命运以进行大规模采集，为考虑代谢如何支持细胞增殖提供了一个框架。

结果

为了开始研究营养素对哺乳动物细胞质量的贡献，我们测量了H1299和A549非小细胞肺癌细胞系中葡萄糖、乳酸和氨基酸的消耗和排泄率，这些细胞以前已经证明依赖有氧糖酵解进行增殖(Christofk等人，2008年) (图1). 与其他哺乳动物细胞系相似(图S1A) (Jain等人，2012年)葡萄糖，其次是谷氨酰胺，是消耗最多的营养素，两者的消耗量都超过了第三大代谢产物丝氨酸的几倍。与这些细胞中的高需氧糖酵解相一致，葡萄糖的消耗速度约为乳酸排泄速度的一半。大多数乳酸来自葡萄糖(图S1B) (品牌，1985年;休谟等人，1978年)，一个葡萄糖分子可以衍生出两个乳酸分子。由于葡萄糖摄取和乳酸排泄之间的差异等于葡萄糖对细胞质量贡献的最大可能速率，因此相对于糖酵解的速率，葡萄糖的新质量添加速率必须较小。

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培养中快速增殖的哺乳动物细胞消耗的葡萄糖和谷氨酰胺超过了其他营养素

H1299和A549细胞对葡萄糖、乳酸和氨基酸的消耗和排泄率。营养素按其通量的绝对大小降序排列。每个条形代表N=3复制的线性拟合斜率，±标准误差。氨基酸使用标准的三字母缩写；Glc，葡萄糖；乳酸。

为了确定不同的营养素如何为细胞质量贡献碳，H1299和A549细胞在葡萄糖的存在下生长，葡萄糖均匀地标记有碳-14（[U-14C] -葡萄糖，即所有被碳-14取代的碳原子），直到超过95%的细胞质量发生翻转，从而可以测定由葡萄糖碳衍生的细胞干质量比例(图S2，参见方法）。令人惊讶的是，葡萄糖碳仅占细胞质量的10%左右，尽管细胞的干重约为碳的50%(图2A、B,S2B型). 为了证实该方法能够解释葡萄糖对细胞质量的贡献，在原营养状态下重复了该方法酿酒酵母菌株SK1。该菌株的干质量也约为50%的碳，当SK1酵母在含有葡萄糖作为唯一碳源的最小培养基中培养时，可以使用[U-14C] -葡萄糖(图2C).

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葡萄糖和谷氨酰胺都不能提供哺乳动物细胞增殖中的大部分碳

（A）H1299和（B）A549癌细胞中由碳组成的细胞干质量分数超过了葡萄糖或谷氨酰胺标记的细胞质量分数。（C） 在SK1原营养酵母中，葡萄糖作为唯一碳源标记的细胞质量分数等于由碳组成的细胞质量的分数。（D） 葡萄糖和谷氨酰胺对细胞质量的贡献在哺乳动物细胞中相似。（E） 活化的原代小鼠T细胞中由葡萄糖或谷氨酰胺衍生的细胞碳部分。每个条形代表N=3个重复的平均值，±S。D。

谷氨酰胺是血浆中含量最高的氨基酸(McMenamy等人，1957年)，和葡萄糖一样，可以被增殖的细胞迅速消耗。为了测量谷氨酰胺对细胞质量的贡献，我们从[U-14C] -谷氨酰胺(图2A、B). 与葡萄糖一样，谷氨酰胺碳对细胞质量的贡献不超过10%，这表明大多数细胞碳并非来自葡萄糖或谷氨酰胺。为了确保葡萄糖和谷氨酰胺碳的低掺入率不受基础培养基选择的影响，对RPMI 1640和DMEM培养细胞的碳-14标记进行了比较，没有观察到差异(图S2C). 我们还证实，在这些实验中，标记是饱和的；由于随后在含有标记葡萄糖或谷氨酰胺的培养基中传代并没有增加这些营养素标记的细胞质量分数(图S2D、E).

为了用正交法证实这些发现，细胞在含有[U-13C] -葡萄糖或谷氨酰胺，这样两种营养素中的碳都没有未标记。在该培养基中培养细胞直到产生大于95%的细胞质量从头开始用同位素比值质谱法（IRMS）测量了碳-13标记的细胞碳的分数，观察到的分数标记值与碳-14掺入的值一致(图S2F).

其他代表不同来源组织、致癌驱动因素和物种的细胞系也与H1299和A549细胞在相同程度上结合了葡萄糖和谷氨酰胺碳(表S1,图2D). 这一发现表明，许多永生化细胞的大量细胞来自葡萄糖和谷氨酰胺以外的来源。为了确定正常增殖的哺乳动物细胞是否获得了类似的细胞质量，我们检测了小鼠的原代胚胎成纤维细胞（MEF）和原代T细胞。MEFS和活化增殖的T细胞从葡萄糖和谷氨酰胺中的碳掺入水平相当，这表明这些细胞中的大部分细胞质量也来自其他营养物质(图2D，E).

哺乳动物细胞被认为主要由蛋白质组成(Alberts等人，2008年;Bonarius等人，1996年;Mourant等人，2005年)，所以我们假设氨基酸可能是细胞质量的主要贡献者。哺乳动物细胞不能合成许多氨基酸，并且通常可以在其环境中获得必需和非必需氨基酸。例如，缬氨酸是一种必需氨基酸，必须从环境中摄取，而丝氨酸是一个非必需氨基酸，可以合成从头开始这些氨基酸的碳在中心碳代谢中具有不同的命运，对非蛋白生物量的贡献能力也不同，每种氨基酸的碳标记为细胞质量的2-4%(图3A). 为了研究氨基酸对细胞质量的影响，我们在含有15个[U-14C] -氨基酸（不包括谷氨酰胺）。该培养基由RPMI 1640改性而成，以支持正常细胞增殖，以便于通过这些氨基酸定量测定细胞标记（见方法，图S3A、B). 总的来说，氨基酸可以标记细胞中的大多数碳，与葡萄糖和谷氨酰胺产生的碳一起，可以解释哺乳动物细胞中的大部分碳质量(图3B).

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氨基酸对哺乳动物细胞的增殖起主要作用

（A） 丝氨酸和缬氨酸碳分别占哺乳动物细胞干质量的2-4%。（B） 15种氨基酸的混合液可以标记哺乳动物细胞增殖中的大多数细胞碳。通过在改良RPMI中培养细胞来测定氨基酸质量贡献(表S2，图S3A)带有[U-14C] -氨基酸。还列出了D中测定的葡萄糖和谷氨酰胺的质量贡献，以供比较。（C） 由谷氨酰胺α-和酰胺氮原子衍生的细胞氮的部分。（D） 醋酸盐碳对电池质量的贡献较小，其净贡献取决于醋酸盐浓度。（E） 加入[U测定血清棕榈酸酯对细胞质量的贡献-14C] -棕榈酸酯。每个条形代表N=3个重复的平均值，±S。D。

除了提供碳外，谷氨酰胺还含有两个氮原子，可以作为培养细胞的氮源(DeBerardinis和Cheng，2010年). 酰胺氮可以转移到天冬酰胺和核苷酸，α-（氨基）氮可以转氨化为非必需氨基酸。这两个氮原子也可以作为谷氨酰胺并入蛋白质中，水解反应允许其中一个以氨的形式排出。为了确定谷氨酰胺为H1299和A549细胞的生物量提供氮的程度，在存在[酰胺]的情况下培养细胞-15N] -或[α-15N] -谷氨酰胺，在标记达到稳定状态后，通过IRMS测量每种物质对细胞氮的贡献(图3C,S3C、D). 酰胺氮原子和α氮原子分别约占细胞氮的11%和17%。有趣的是，在所分析的每个细胞系中，谷氨酰胺氮总共贡献了不到一半的氮，这表明其余的氮来自其他来源，如氨基酸。

接下来，我们试图确定葡萄糖和氨基酸对非增殖细胞碳质量的贡献程度。这些细胞没有复制细胞质量的生物合成需求，但不被认为是代谢静止的(Lemons等人，2010年)为了确定对静止细胞的质量贡献，我们检测了在提取表皮生长因子（EGF）时可逆性停滞的非转化人类乳腺上皮细胞（HMEC）(图S4A) (Stampfer等人，1993年). 增殖HMEC包含来自葡萄糖、谷氨酰胺、丝氨酸和缬氨酸的碳，其程度与其他增殖细胞相当，有趣的是，非增殖HMEC的标记接近类似的稳态值，这表明它们的大多数细胞质量在几周后会发生变化(图4A、B). 我们还测定了这些营养素对有丝分裂后细胞碳细胞质量的贡献：培养的原代肝细胞体外以及分化的肌细胞和脂肪细胞在体外分别来自C2C12和3T3-L1细胞。与HMEC类似，肝细胞、肌细胞和脂肪细胞被所用的每种示踪剂标记，表明一些细胞质量转换(图4C-G,S4B–E系列). 然而，在大多数情况下，标记接近稳态值，低于观察到的增殖细胞。这表明，与HMEC相比，这些分化细胞中只有一小部分细胞质量被翻转。重要的是，未分化的C2C12成肌细胞和未分化的3T3-L1前脂肪细胞在一定程度上与其他增殖细胞相似，含有葡萄糖和氨基酸(图4D，F). 与肝细胞和肌细胞一样，脂肪细胞中的氨基酸含量低于增殖细胞(图4G). 然而，葡萄糖标记了相当一部分脂肪细胞质量，这与它们在脂质储存中的作用相一致(图S4E). 分析的非增殖细胞表明，不同类型的细胞使用不同的代谢程序。肝细胞和心肌细胞利用葡萄糖和氨基酸以相似的程度部分翻转细胞团。脂肪细胞是代谢专门化的，含有大量的葡萄糖碳，而HMEC无论其增殖状态如何，都会大量将氨基酸纳入细胞团。

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碳对非增殖细胞质量的贡献

使用碳-14示踪剂，来自葡萄糖（Glc）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）和缬氨酸（Val）的碳被追踪到以下细胞团：（A）增殖的人乳腺上皮细胞（HMEC）、（B）停滞的HMEC、（C）原代肝细胞、（D）增殖的C2C12成肌细胞、（E）分化的C2C12肌细胞、（F）增殖的3T3-L1成纤维细胞和（G）3T3-L1分化为脂肪细胞。碳在增殖细胞中的掺入呈稳定状态，而在非增殖细胞中随着时间的推移而掺入。每个条形代表N=3个重复的平均值，±S。D。

尽管摄取量相对较低，但氨基酸对细胞质量的贡献较大，这表明以较低速度摄入的其他营养素可能会增加细胞质量。例如，醋酸盐可以在促进细胞增殖方面发挥作用(Comerford等人，2014年;Schug等人，2015年). 组织培养基中没有醋酸盐，因此我们测量了标记研究中使用的胎牛血清（FBS）和透析FBS中的醋酸盐水平(图S3E). 在牛血清中，醋酸盐约为400µM，在含有10%FBS或10%透析FBS的组织培养基中，醋酸酯水平分别约为40µM或4µM。当在含有10%血清的培养基中培养时，来自醋酸盐的碳没有明显标记细胞，但当培养基中存在400µM醋酸盐时，开始接近细胞干质量的1%(图3D)，浓度高于人类血清中通常观察到的浓度(Richards等人，1976年;Tollinger等人，1979年).

细胞也可以清除血清脂肪酸，作为另一种潜在的物质来源(Bailey等人，1972年;Kamphorst等人，2013年;Schoors等人，2015年). 由于血清中的脂肪酸成分复杂，无法使用同位素标记的示踪剂进行重述，因此对总脂肪酸贡献的定量评估变得复杂。然而，为了评估单个脂肪酸的贡献程度，我们检测了棕榈酸（C16:0）在细胞质量中的掺入。棕榈酸是血清和细胞膜中最丰富的脂肪酸(Kilsdonk等人，1992年;Raatz等人，2001年;Vajreswari等人，1990年). FBS中棕榈酸酯的含量约为260µM(图S3F)然而，该值包括脂质中的游离脂肪酸和酯化棕榈酸酯。[美]-14C] -当与培养基中的总棕榈酸酯（游离脂肪酸和酯化脂肪酸）相比较时，棕榈酸酯作为游离脂肪酸被标记为H1299和A549细胞质量的约5%(图3E). 这些数据表明，外源性脂类也可能对体重产生影响；然而，这种评估可能高估了这种贡献，因为大多数血清脂肪酸在诸如甘油三酯之类的脂质中酯化(Raatz等人，2001年). 细胞摄取的酯化脂肪酸首先被脂肪酶水解，生成游离脂肪酸，与细胞中的游离脂肪酸池混合(Walther和Farese，2012年). 然而，从[1-14C] -棕榈酸是从[U-14C] -棕榈酸酯(图S3G). 因为[1中标记的碳原子-14C] -棕榈酸酯是脂肪酸氧化过程中第一个损失的碳，这些数据表明，细胞获得的每一个棕榈酸酯分子要么完全分解，要么完全并入细胞团。基于类似的假设，[1-14C] -油酸（C18:1），第二丰富的血清脂肪酸(图S3F) (Raatz等人，2001年)，也可能约占细胞质量的5%(图S3G).

脂质可以从环境中清除或合成从头开始葡萄糖和谷氨酰胺作为潜在的底物从头开始生物合成(Kamphorst等人，2013年;Metallo等人，2012年;Mullen等人，2012年). 为了了解葡萄糖和谷氨酰胺对脂质的特殊贡献，我们采用了一种双相提取方案来分离和回收脂质（和其他非极性化合物）以及其他主要大分子类别：RNA、DNA、蛋白质和极性代谢物(图5A). 这种方法可以从高纯度的细胞裂解液中定量回收这些大分子，通过正交方法分离的放射性标准进行了验证(图5B、C). 使用这种方法对放射性标记细胞进行分馏也能完全恢复输入放射性(图S5A). 与以往研究一致(Kamphorst等人，2013年;Metallo等人，2012年;Mullen等人，2012年)，葡萄糖和谷氨酰胺中的碳-14在H1299、A549和A172细胞的脂质部分中被回收，与谷氨酰胺相比，葡萄糖对脂质的贡献更大(图5D). 在所研究的每个大分子部分中都回收了大量的葡萄糖碳，但最大比例的葡萄糖被转移到非极性部分，这表明葡萄糖是从头开始脂肪生成。

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葡萄糖、谷氨酰胺和其他氨基酸具有不同的生物合成命运

（A） 显示了用于基于不同溶解度将细胞分级为不同大分子类别的方案。未从水相沉淀的物质称为极性部分，未从有机相沉淀的材料称为非极性部分。（B） 从HEK293细胞中独立合成和纯化放射性大分子，然后用于评估（A）中方案产生的组分的产率和纯度。（C） 从HEK293细胞中提取来自不同营养物质的放射性小分子，并用于评估（A）中方案产生的极性部分的产量和纯度。（D和E）测定了（D）葡萄糖、谷氨酰胺、丝氨酸和缬氨酸以及（E）外源性棕榈酸酯对H1299、A549和A172细胞不同大分子组分的相对贡献。每个条形代表N=3个重复的平均值，±S。D。

为了评估葡萄糖中脂质生物合成相对于环境中脂质清除的贡献，我们测量了当增殖细胞被剥夺外源脂质时，葡萄糖并入脂质部分的增加。为此，细胞在通过非变性有机萃取去除脂质的血清中培养(图S3F). 在这些条件下，葡萄糖对脂肪酸的贡献的任何增加都应反映出当细胞在高脂条件下培养时，外源性脂质对质量的贡献。重要的是，当细胞在含有脂肪酸剥离血清的培养基中培养时，细胞质量没有显著变化(图S6A). 当细胞在没有脂类的情况下培养时，大量的葡萄糖碳被并入细胞团中，因此在这些条件下，葡萄糖中约一半的碳被转移到非极性部分(图6A、B). 这些数据与细胞从环境中获得大量脂质一致(图5E,5亿). 这些数据也与观察到的[U-14C] -棕榈酸酯和[1-14C] -棕榈酸酯对细胞质量(图S3G). 当细胞在不含脂质的情况下培养时，未观察到谷氨酰胺碳对细胞质量的净贡献有明显变化；然而，在此条件下，谷氨酰胺碳与非极性物质的相对结合量大约翻了一番。最后，当细胞在含有或不含有血清脂肪酸的情况下生长时，由葡萄糖产生的细胞质量比例的差异与存在这些脂肪酸时测定的棕榈酸和油酸碳对细胞质量的贡献很好地对应(图3E,S3G系列). 这证实了这两种脂肪酸是外源性脂质的主要质量贡献者的观点，并认为这些细胞中的脂质质量是通过清除和从头开始由葡萄糖合成。假设细胞脂质仅来源于葡萄糖、谷氨酰胺和细胞外脂质，上述数据表明60-70%的脂碳来源于外源，20-30%来源于葡萄糖，约5%来源于谷氨酰胺。

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当缺乏非必需营养素时，细胞内的葡萄糖碳吸收增加

在含有正常血清或去除脂质的血清的RPMI 1640（A）中生长的H1299和A549细胞中葡萄糖和谷氨酰胺的掺入和利用；（B） 含或不含丝氨酸和甘氨酸；或（C）含或不含天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酸。每个条形代表N=3个重复的平均值，±S。D。

葡萄糖碳可以进入许多生物合成途径(休谟等人，1978年;Lunt和Vander Heiden，2011年)葡萄糖对所有大分子部分都有贡献(图5D). 葡萄糖的一个非冗余功能是为核苷酸生物合成提供核糖，四分之一的葡萄糖碳可追踪到RNA和DNA。一些氨基酸也可能有助于蛋白质合成以外的途径。为了了解细胞如何利用氨基酸，我们追踪谷氨酰胺、丝氨酸和缬氨酸碳进入大分子(图5D). 谷氨酰胺和丝氨酸都可以代谢为其他生物合成前体。虽然TCA循环中的谷氨酰胺胸膜病被假设提供了能够满足蛋白质生物合成以外的生物合成需求的物质(Daye和Wellen，2012年;DeBerardinis和Cheng，2010年;DeBerardinis等人，2007年;Lunt和Vander Heiden，2011年;Metallo等人，2012年;Mullen等人，2012年)到目前为止，蛋白质是谷氨酰胺碳的主要命运。除了对非极性部分有少量贡献外，核酸中还回收了少量谷氨酰胺碳。谷氨酰胺碳掺入比丝氨酸或缬氨酸碳掺入大3-4倍(图2,​,3),三)但尽管如此，大多数谷氨酰胺碳都是通过蛋白质部分回收的。因为谷氨酰胺在细胞蛋白中没有过量表达(Bonarius等人，1996年)这一发现表明，谷氨酰胺胸膜炎为其他TCA环衍生氨基酸提供碳。丝氨酸碳与谷氨酰胺碳在细胞质量中的相对掺入量相似。虽然大多数丝氨酸碳存在于蛋白质中，但丝氨酸碳也存在于核酸中，这与丝氨酸为核苷酸生物合成提供单碳单位和甘氨酸的已知作用一致(Labuschagne等人，2014年;Lunt和Vander Heiden，2011年). 缬氨酸碳只被追踪到蛋白质中。如果葡萄糖、谷氨酰胺和丝氨酸被认为是核酸的唯一碳源（甘氨酸可能是这些细胞分泌的一个次要成分，参见图1)这些数据表明，葡萄糖提供60-80%的核苷酸碳，谷氨酰胺和丝氨酸分别提供10-20%和~15%。

在某些条件下，葡萄糖和/或谷氨酰胺碳对细胞质量的贡献可能更大。一些氨基酸对细胞来说是非必需的，没有这些氨基酸培养的细胞可能会更加依赖葡萄糖、谷氨酰胺或其他营养素。为了确定哪些氨基酸或组合或氨基酸对培养中的细胞是非必需的，将H1299和A549细胞培养在缺乏非必需氨基酸组合的培养基中(图S6B、C). 可从糖酵解中提取的两种氨基酸，丝氨酸和甘氨酸，以及可从TCA循环中提取的四种氨基酸，天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸可从培养基中去除，而不会阻止这些细胞的增殖。去除甘氨酸或TCA循环氨基酸对受试细胞倍增的影响最小(图S6B、C)TCA循环氨基酸或丝氨酸和甘氨酸的去除都不会显著改变细胞质量(图S6A). 在缺乏丝氨酸和甘氨酸的情况下，细胞含有更多的葡萄糖碳(图6C)掺入量的增加大约是丝氨酸掺入碳量的两倍。在这种情况下，更多的葡萄糖碳也有助于蛋白质的合成(图6D)，但葡萄糖碳的相对命运与丝氨酸/甘氨酸充足的条件没有太大区别，很可能是因为丝氨酸和甘氨酸也有助于核苷酸和脂质(Lunt和Vander Heiden，2011年). 由于丝氨酸和甘氨酸是由糖酵解中间体合成的，因此当细胞在缺乏这些氨基酸的情况下培养时，谷氨酰胺的结合和利用不会改变(图6D).

在没有TCA循环的情况下，氨基酸天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸，葡萄糖和谷氨酰胺碳掺入细胞质量都不会改变(图6E)，它们的相对生物合成命运没有改变(图6F). 这表明，无论是否存在这四种TCA衍生氨基酸，谷氨酰胺为这些氨基酸提供了大量的碳，即使它们在培养基中可用。由于谷氨酰胺碳主要对蛋白质起作用，并且其在细胞中的结合量是丝氨酸或缬氨酸的3-4倍，因此这些数据与谷氨酰胺产生的TCA循环胸膜炎相一致，谷氨酰胺产生这些氨基酸的量大于其他大分子前体。与此假设一致，基于已知的途径，谷氨酰胺碳对RNA和DNA的贡献仅通过谷氨酰胺生成的天冬氨酸发生。

低氧时葡萄糖和谷氨酰胺的利用发生改变：葡萄糖提供较少的碳，谷氨酰胺为脂肪生成的乙酰辅酶A提供更多的碳，细胞越来越依赖清除的脂质(Kamphorst等人，2013年;Metallo等人，2012年). 在H1299细胞中，当细胞在1%氧气中培养时，葡萄糖和谷氨酰胺的掺入没有改变，而在A549细胞中两者的掺入减少，而在缺氧中丝氨酸和缬氨酸的掺入相对不变(图S6D、E). 重要的是，HIF1α在1%氧气中培养的细胞中稳定，证实了对低氧的正常反应(图S6F)这些结果表明，尽管代谢特异性途径受缺氧调节，但葡萄糖和谷氨酰胺碳在细胞团中的结合并没有明显改变。

讨论

哺乳动物细胞的大部分质量来源于外源性氨基酸的发现为细胞的高效生长提供了一个模型。通过利用环境中可用的生物合成最终产物，而不是合成它们从头开始，细胞将需要更少的ATP、氧化还原当量和碳来支持细胞增殖。与这一假设一致，可用脂肪酸中的碳仅用于生成非极性物质，任何脂肪酸氧化似乎都不会为非脂生物量提供碳。在某些细胞类型中，脂肪酸碳已被追踪到dNTP中，但该碳源的净贡献尚未量化(Schoors等人，2015年). 在这项研究中，缬氨酸碳只在蛋白质中发现，没有证据表明这种氨基酸的分解代谢为非蛋白质生物量提供了碳。整个蛋白质也可以作为细胞氨基酸的替代来源被清除(Commisso等人，2013年). 因为我们可以通过吸收游离氨基酸来解释细胞中的蛋白质质量，所以在测试条件下，蛋白质清除似乎不是细胞碳的主要贡献者。然而，在游离氨基酸受到限制的情况下，从散装蛋白质中动员氨基酸可能很重要(Commisso等人，2013年)尤其是在最小化从头开始在增殖细胞中有利于氨基酸的合成。

氨基酸共同贡献了大部分细胞质量的发现与细胞主要由蛋白质组成的概念是一致的(Alberts等人，2008年;Dolfi等人，2013年;Mourant等人，2005年)与哺乳动物代谢的基因组模型一致(Thiele等人，2013年). 用于支持其他生物体生长的营养素也认为，直接使用氨基酸营养素是支持细胞增殖的常见手段。受精的鸟蛋和发芽的植物种子都是主要由蛋白质、氨基酸和脂质储存组成的封闭系统的例子，在缺乏其他外源营养素的情况下，这些系统支持有机质的快速增长(Boulter and Barber，1963年;莫兰，2007年;Willems等人，2014年). 这些系统中的细胞快速增殖也与增殖细胞避免从头开始尽可能进行生物合成。糖酵解通量对发育也至关重要，但它对ATP和氧化还原平衡可能比直接生产生物合成碳更重要(库切拉等人，1984年)，而种子中发现的糖储量主要对幼苗中的多糖有贡献(阿卜杜勒·巴基，1969年).

观察到葡萄糖掺入量可以增加以弥补某些营养素的缺乏，这意味着在大分子生物合成中存在一定程度的模块化。当丝氨酸限制时，细胞对葡萄糖衍生丝氨酸的依赖性增加(Chaneton等人，2012年;Labuschagne等人，2014年)当细胞生长时没有丝氨酸和甘氨酸，葡萄糖掺入量的增加大约是丝氨酸产生的碳量的两倍。同样，在没有脂质的情况下，葡萄糖掺入量的增加与棕榈酸和油酸对细胞质量的贡献密切相关。这些发现表明，细胞组成和增殖所需的生物合成成分在这些条件下不会发生变化。

建模工作试图通过最大限度地将消耗的碳纳入生物质的效率来解释葡萄糖和谷氨酰胺的快速消耗(Cascante等人，2002年;Shestov等人，2014年;Shlomi等人，2011年). 然而，特定营养素的快速摄入不一定与细胞质量合并相关，似乎通过糖酵解和谷氨酰胺酶解的大量流动支持了除碳外的其他方式的增殖。尽管葡萄糖碳对细胞质量的贡献很小，但葡萄糖碳和葡萄糖代谢对增殖仍然很重要。例如，细胞增殖需要核酸的复制，这需要葡萄糖或另一种生物可利用的碳水化合物中的核糖。葡萄糖和谷氨酰胺代谢在为生物合成提供非碳物质方面也有重要作用，包括能量和还原当量以及氮。在许多细胞系和一些肿瘤中，谷氨酰胺是氮的主要来源，可以提供胸膜TCA循环碳。两个谷氨酰胺氮原子对细胞氮的贡献都很大，而α-氮的贡献稍大。因为α-氮用于从头开始氨基酸合成对蛋白质和核酸都有贡献，而酰胺氮主要对核酸有贡献，细胞内蛋白质丰度的增加可能是造成这种差异的原因。

谷氨酰胺对增殖细胞生物量生产的主要贡献是对蛋白质组分的贡献。虽然非谷氨酰胺氨基酸是蛋白质碳质量的主要来源，但由于谷氨酰胺原子被并入其他氨基酸和TCA循环中间产物中，因此谷氨酰胺的贡献超过了谷氨酰胺单独回收的预期。事实上，虽然谷氨酰胺可能不是所有细胞中的TCA循环底物体内(Davidson等人，2016年;Marin-Valencia等人，2012年;Tardito等人，2015年;Yueva等人，2012年)，我们的数据表明谷氨酰胺衍生碳在TCA循环中间产物中的重要结合，无论它们是否在介质中自由可用。例如，天门冬氨酸盐在前列腺和神经系统外的细胞中运输不良(Lao等人，1993年;Storck等人，1992年)，因此必须进行合成。谷氨酰胺是迄今为止组织培养基中最丰富的氨基酸；在培养细胞中观察到这种氨基酸的易运输和高谷氨酰胺酶活性(DeBerardinis和Cheng，2010年)产生快速涌入的谷氨酰胺碳来生成谷氨酸和脯氨酸，这两种物质都由被研究的细胞分泌。高浓度的谷氨酸能够在缺乏谷氨酰胺的情况下促进细胞生长，这表明相对于谷氨酰胺，谷氨酸的输入是有限的(Eagle等人，1956年). 或者，从头开始TCA循环氨基酸的合成可能会为哺乳动物细胞的增殖提供一些益处，而这些益处超过了合成成本。总的来说，我们的数据表明，快速糖酵解和谷氨酰胺解对增殖细胞的重要性在于能够产生生物量碳以外的代谢产物。

实验程序

细胞培养

使用标准组织培养技术，将细胞维持在补充有10%热灭活胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100µg/mL）的RPMI 1640或DMEM（不含丙酮酸盐）中。当细胞在缺乏特定氨基酸的情况下生长时，缺乏这些氨基酸的RPMI 1640补充有10%的热灭活透析FBS，并且所有其他培养基成分与正常RPMI 1640。通过将葡萄糖和氨基酸溶解到RPMI 1640碱基中来制备含有修饰氨基酸的RPMI。该介质的成分详见表S2和图S3A缺乏脂质的培养基为RPMI 1640，补充10%的脂质剥离热灭活FBS（参见补充实验程序). 原营养SK1酿酒酵母在以葡萄糖为唯一碳源的合成葡萄糖最低培养基（不含氨基酸的0.67%酵母氮基，2%葡萄糖）的液体培养基中生长。

营养素消耗和排泄的测量

监测细胞数量，并从指数增殖细胞培养物中收集培养基。在YSI-7100 MBS（黄泉仪器）上测量葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸浓度。通过气相色谱-质谱（GC-MS）对中氨基酸进行定量。消费量被归一化为增长曲线下的面积。

质谱分析

如前所述，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析样品(Lewis等人，2014年). 样品用MOX试剂（Thermo Scientific）衍生N个-叔丁基二甲基硅基-N个-甲基三氟乙酰胺与1%叔丁基二甲基氯硅烷（Sigma-Aldrich）。脂肪酸在含有2%硫酸的甲醇中衍生为脂肪酸甲酯。衍生化后，在Agilent 7890A气相色谱仪与Agilent 5975C质谱仪耦合的情况下，使用DB-35MS柱（安捷伦科技）对样品进行GC-MS分析。使用前面描述的内部软件分析数据(Lewis等人，2014年).

碳-14标记研究

除非另有说明，哺乳动物细胞生长在含有10%透析热灭活FBS（补充碳-14示踪剂）的RPMI 1640中。介质是从美国放射性标签化学品公司或Perkin Elmer公司购买的补充示踪剂（参见补充实验程序). 为了确保达到标记稳定状态，细胞在碳-14的存在下生长，直到超过95%的细胞材料翻转。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞三次，以去除未结合的碳-14，通过胰蛋白酶收集，并通过液体闪烁计数对结合的碳14进行量化。为了确定特定营养素产生的细胞干质量分数，通过碳-14示踪剂与培养基中相应的碳-12营养素的摩尔比调整纳入细胞的碳-14。合并碳的质量标准化为培养质量（细胞数乘以单个细胞质量，参见补充实验程序).

稳定同位素标记研究

细胞在添加10%热灭活透析FBS的RPMI 1640中培养，并含有[U-13C] -葡萄糖或[U-13C] -谷氨酰胺（剑桥同位素实验室）代替相应的未标记营养素。在含有碳-13的培养基中多次传代后，测量葡萄糖或谷氨酰胺对细胞总碳的贡献。对于在如上补充但含有[酰胺的RPMI 1640中生长的细胞，测量谷氨酰胺对总细胞氮的贡献-15N] -或[α-15N] -谷氨酰胺（补充量为谷氨酰胺总量的4%）。碳-13和氮-15富集（即。13抄送：12C和15编号：14N） 通过同位素比率质谱（IRMS）测量（参见补充实验程序).

细胞分离

使用TRIzol试剂（Life Technologies）对细胞进行裂解，并根据制造商的说明通过双相提取提取和纯化RNA、DNA和蛋白质(乔姆琴斯基，1993年). 简单地说，在最初的溶解之后，不溶性物质被认为是DNA；RNA从水相中沉淀出来，剩下的可溶性物质称为“极性部分”；蛋白质从有机相中沉淀出来，剩下的可溶性物质称为“非极性部分”。通过液体闪烁计数对每个组分的放射性进行量化。为了评估这种纯化方案的效果，在分馏之前，将定义的大分子类放射性分子加入未标记HEK293细胞的TRIzol裂解液中（参见补充实验程序)以及测量所得馏分中的放射性。通过比较每个馏分中的放射性总量与输入放射性示踪剂的总量来评估分馏的产率(图2B、C).

​

集锦

  • 葡萄糖和谷氨酰胺不是大多数哺乳动物细胞的来源
  • 非谷氨酰胺氨基酸为增殖细胞提供丰富的碳和氮
  • 非增殖性哺乳动物细胞表现出不同程度的细胞质量转换
  • 营养成分的命运已确定，表明谷氨酰胺主要对蛋白质起作用

补充材料

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致谢

这项工作得到了NIH拨款U54CA121852、R01CA168653、P30CA14051、R01HL108006（J.C.R.）、U54CA143874（S.R.M.）和K08DK090147（M.L.S.）的支持；Burroughs Wellcome基金；和Damon Runyon癌症研究基金会。A.M.H.是霍华德·休斯医学院国际学生研究所研究员，也是顶点学者。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

作者贡献：A.M.H.计划并执行了所有实验。V.C.H.和S.R.M.协助原代细胞和有丝分裂后细胞培养测量细胞质量。M.O.J.和J.C.R.分析了原始T细胞。M.L.S.执行了氮-15 IRMS。A.M.H.和M.G.V.H.设计了研究，分析了数据，并撰写了手稿。

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