跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
神经免疫药理学杂志。作者手稿；2017年3月1日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
神经免疫药理学杂志。2016年3月；11(1): 168–181.
2015年11月20日在线发布。 数字对象标识：2007年10月10日/11481-015-9643-8
预防性维修识别码：下午746110
NIHMSID公司：NIHMS740171号
PMID：26589234

创伤后应激障碍患者外周血单个核细胞中促炎细胞因子、白细胞介素-12和干扰素γ表观调控的证据

Marpe Bam公司,#1 杨晓明,#1 周菊华,1,# 杰·金斯伯格,2 奎恩·莱登,2 普拉卡什·S·纳加卡蒂,1和米齐·纳加卡蒂1,2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

虽然创伤后应激障碍（PTSD）与免疫功能障碍有关，但其潜在机制尚不清楚。研究表明，表观遗传机制和微RNA（miRNAs）的参与发挥了作用。在这里，我们检测了PTSD患者外周血单个核细胞（PBMC）的全基因组组蛋白和DNA甲基化。我们注意到PTSD组蛋白H3在K4、K9、K27和K36位点的三甲基化与对照组相比存在显著差异。虽然控制组和创伤后应激障碍组的总体DNA甲基化水平没有显著差异，但几个单独基因（例如γ干扰素）的启动子(IFNG公司)和白细胞介素(伊利诺伊州)-12亿)被不同程度地甲基化。ChIP-seq数据显示IFNG公司和TBX-21型与PTSD中的激活标记H3K4me3相关。PTSD患者IFNG和TBX-21的转录水平较高，与甲基化模式的改变密切相关。此外，创伤后应激障碍患者的白介素-12在他们的PBMC中。组蛋白和DNA甲基化标记的分析表明白介素-12也可能通过表观遗传修饰被激活。敲除赖氨酸（K）特异性去甲基酶5B（KDM5B）或抑制DNA（胞嘧啶-5-）-甲基转移酶1（DNMT1）导致白介素-12此外，这些细胞因子的表达也受到miRNAs的调节。我们的miRNA微阵列鉴定出PTSD中许多下调的miRNA，并预测其靶向性IFNG公司和白介素-12因此，我们发现上调hsa-miR-193a-5p可以降低IL-12的表达。总的来说，目前的研究表明，PTSD患者促炎细胞因子的高表达可能受到多种表观遗传机制和miRNA的调控。

关键词：创伤后应激障碍、炎症、DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA、IL-12

介绍

创伤后应激障碍可能会在军事战斗等创伤事件后发展。据报道，10-20%的美国军人在从伊拉克部署回国后患有创伤后应激障碍(Thomas等人，2010年). 即使在一般成年人中，仅在美国，创伤后应激障碍的患病率就约为3.5%(Kessler等人，2005年). 创伤事件发生后，与压力相关的症状对大多数人来说通常是暂时的。然而，对于创伤后应激障碍患者来说，创伤事件是如此巨大，以至于压力症状可能会持续很长时间，这严重影响了生活质量。

尽管创伤后应激障碍主要表现为精神障碍，但持续压力的症状不仅影响神经系统，还影响其他生物功能。越来越多的证据表明，免疫功能是创伤后应激障碍患者失调的功能之一。我们在PTSD患者的血样中报告了广泛的细胞因子异常(Zhou等人，2014年)和其他(Hoge等人，2009年). 一般来说，促炎细胞因子水平升高，而抗炎细胞因子水平降低(Smith等人，2011年;Sutherland等人，2003年;von Kanel等人，2007年). 据推测，下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的失调会导致创伤后应激障碍患者的免疫系统功能障碍(Rohleder&Karl 2006年). 皮质醇调节不足也是一个可能的原因(Gill等人，2009年). 尽管有这些影响，但尚不清楚PSTD患者的过度炎症是如何引起的。我们之前的研究和其他研究表明，表观遗传修饰和miRNAs在改变创伤后应激障碍患者免疫系统的基因表达方面发挥着重要作用。例如，我们发现创伤后应激障碍患者外周血单个核细胞（PBMC）中IFNG水平显著增加，IFNG增加至少部分受miRNAs调节(Zhou等人，2014年). 最近的一项研究表明，通过比较军人部署前后的DNA甲基化水平，DNA甲基化可能有助于PTSD患者PBMC中长非编码RNA转录物H19和IL-18的表达改变(Rusiecki等人，2013年).

众所周知，环境因素可以通过表观遗传修饰来调节基因表达，这种影响可以持续很长时间。基因表达可以通过DNA甲基化和组蛋白修饰在转录水平上进行表观遗传调控，也可以通过miRNA和其他非编码RNA在转录后水平上进行调控(Flintoft 2013年;He&Hannon 2004年;Rothbart&Strahl 2014年). 在这些表观遗传机制中，组蛋白修饰可能是最复杂的一种。组蛋白可以磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化(Zhou等人，2011年)甲基化可以是单甲基化、二甲基化或三甲基化(Greer&Shi 2012年). 根据类型和位点的不同，这些组蛋白修饰在基因表达中具有非常多样的调节功能。例如，启动子组蛋白H3（H3K4me3）中赖氨酸4处的三甲基化通常与基因激活有关，而赖氨酸27处的三甲化（H3K27me3）与基因抑制有关(Bernstein等人，2006年;Roh等人，2007年;Wei等人，2009年). 组蛋白H3（H3K9me3）中赖氨酸9处的三甲基化与基因沉默有关，赖氨酸36处的三甲化（H3K 36me3）参与转录延伸(Bannister等人，2005年;Mikkelsen等人，2007年;Vakoc等人，2005年). 至于DNA甲基化，修饰通常发生在CpG区的5-胞嘧啶处。启动子区域的高度DNA甲基化被认为抑制转录。另一方面，活性基因转录体中的DNA甲基化水平可能会增加(穆尔斯2013). 此外，DNA甲基化和组蛋白甲基化是相互关联的。例如，已经表明H3K9和H3K27处的组蛋白三甲基化促进DNA甲基化，因为催化H3K9和H3K27甲基化的甲基转移酶与DNA甲基转移酶结合，并促进它们募集到靶基因座(Lehnertz等人，2003年;Vire等人，2006年). 因此，表观遗传学修饰的复杂机制对于调节基因表达以响应包括创伤事件在内的环境刺激是重要的。

另一种水平的基因调控是由miRNAs发挥的。微RNA是约22个核苷酸，是非编码RNA，通过抑制mRNA翻译来调节转录后基因表达(安布罗斯2004). 以前的许多报告显示了miRNAs在影响免疫功能相关基因表达方面的作用。例如，在创伤后应激障碍患者中，我们的实验室显示IFNG水平改变，这种改变与hsa-miR-125a的下调有关(Zhou等人，2014年).

为了确定表观遗传修饰是否在创伤后应激障碍患者免疫功能改变中发挥作用，并确定用于创伤后应激疾病诊断的潜在生物标记物，我们首先使用ChIP-seq和MeDIP-seq方法比较了健康对照组和创伤后应激病患者PBMC的全基因组组蛋白甲基化和DNA甲基化模式。此外，我们使用NCBI的GEO数据集上的可用数据比较了特定基因的DNA甲基化水平(GSE21282标准)77名对照组和23例创伤后应激障碍患者的全基因组DNA甲基化(Uddin等人，2010年). 总的来说，我们发现H3K4me3、H3K27me3、H3K36me3和H3K9me3模式发生了显著变化，而总体DNA甲基化没有显著变化。此外，促炎细胞因子的表达，IFNG公司和白介素-12PTSD患者的表达增加，且其表达与其相关的表观遗传标记物相关。为了确定IFNG公司和白介素-12我们在更多PBMC样本中使用甲基化特异性PCR和qRT-PCR，结果与我们的ChIP-seq和MeDIP-seq数据一致。此外，击倒H3K4me3脱甲基酶KDM5B系列或抑制DNA甲基化酶DNMT，导致白介素-12B表明上述表观遗传机制可能调控IL-12和IFNG的表达。作为基因调控的另一个水平，我们确定了许多miRNAs的改变表达，这些miRNAss被预测为靶向上述基因。因此，我们显示miR-193a-5p预测为靶向白介素-12B在创伤后应激障碍中下调，在培养细胞中上调其表达可降低IL-12的表达。

总之，为了表明表观遗传机制可以影响基因表达，并特别注意PTSD，我们使用来自每个对照组和PTSD PBMC的ChIP-seq和MeDIP-seq数据作为筛选工具，以确定潜在的靶基因。然后，我们通过增加样本量和执行在体外实验。此外，我们还发现，miRNAs可以在转录后水平调节促炎基因的表达。我们的报告为进一步了解创伤后应激障碍（PTSD）慢性炎症的发生和维持机制以及制定治疗策略提供了未来的方向。

材料和方法

患者和细胞制备

研究中的所有参与者均获得知情同意。创伤后应激障碍患者是1991年波斯湾战争或最近伊拉克或阿富汗战争的退伍军人，如前所述，他们是从当地退伍军人协会医院招募的(Zhou等人，2014年). 对照组是年龄匹配的健康志愿者，没有任何免疫紊乱病史。立即使用Ficoll-Paque（GE Healthcare，Uppsala，Sweden）离心法处理10 mL外周血，以分离PBMC和血浆。通过台盼蓝排除法测定PBMC的存活率。在本研究中，我们包括16名对照组和17名创伤后应激障碍患者。

ChIP-Seq公司

用甲醛（终浓度为1%）处理分离的PBMC以交联组蛋白和DNA。通过添加甘氨酸对甲醛进行淬火后，将细胞造粒并用冷PBS洗涤2次。然后用微球菌核酸酶消化染色质。在通过简短的超声波破坏核膜后，对样品进行离心，并使用上清液用Simple ChIP-enzymatic chromatin IP Kit（Cell signaling，#9003）进行染色质免疫沉淀。ChIP抗体H3K4me3（ab1012）、H3K27me3（ab6002）、H3K9me3（ab8898）和H3K36me3（ab9050）购自马萨诸塞州剑桥市的Abcam。用蛋白酶K处理免疫沉淀染色质，逆转交联。然后纯化DNA并进行定量。根据制造商的说明，使用Illumina的芯片测序样品制备试剂盒（#1003473）构建测序库，并由Illuminia HiSeq2000在塔夫茨大学基因组核心设施进行测序。

MeDIP-seq公司

纯化的基因组DNA用dsDNA剪切酶处理（加利福尼亚州欧文市的发酵研究所）。使用Illumina Chip-seq文库制备试剂盒纯化200bp至400bp的DNA片段，构建测序文库。然后使用来自Diagenode（新泽西州丹维尔）的MeDIP试剂盒，用抗5-甲基胞嘧啶抗体对dsDNA进行变性和免疫沉淀。纯化沉淀DNA并测序。免疫沉淀前的样品也被测序作为输入控制。

数据分析

ChIP-seq和MeDIP-seq文库均以50bp的单端读取进行测序。使用Bowtie软件将原始测序读数映射到人类基因组构建hg19，允许读数中的两个不匹配(Langmead等人，2009年). 然后对映射的读取进行过滤，并且仅将唯一映射的读取用于下游分析。对于ChIP-seq数据，SICER用于峰值呼叫(Blankenberg等人，2010年;Zang等人，2009年). 除H3K4me3使用200bp窗口大小和200bp间隙大小外，峰值调用参数为200bp窗口尺寸和600bp间隙大小。峰值在UCSC基因组浏览器中显示(http://genome.ucsc.edu/). 这些信号的相关热图是使用DiffBind软件生成的(Ross-Innes等人，2012年). 使用CEAS软件计算各种基因组特征中的信号分布(Shin等人，2009年). 启动子区域定义为转录起始位点（TSS）上游和下游3kb。对于MeDIP-seq数据，使用MEDIPS软件分析映射读取(Lienhard等人，2014年). TSS上游和下游1kb的位置是使用UCSC表格浏览器生成的。提取DNA甲基化信号并进行相关性分析。使用Ingenuity pathway Analysis（IPA；加利福尼亚州红木市恰根）分析IL-12和IFN-γ途径的miRNA调控。为了使用NCBI数据库中的数据分析特定基因的DNA甲基化水平，获得每个基因的平均β值，并在对照组（n=77）和PTSD组（n=23）之间进行比较。β值对应于执行微阵列检测特定CpG岛DNA甲基化水平后获得的值。

定量实时PCR（qRT-PCR）和甲基化特异性PCR

根据制造商的说明，使用miScript II RT试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）合成互补DNA。所有用于检测基因转录物的qRT-PCR反应均使用iQ™通用SYBR进行®绿色超级混合物（Bio-Rad Inc.，USA），具有25ng的cDNA作为模板。用于检测成熟miRNA，miScript SYBR®绿色PCR试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）与3ng cDNA模板一起使用。对于甲基化特异性PCR，引物的设计使用了网上提供的软件http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprierr.cgi(Li和Dahiya，2002年). 我们利用包括IL-12B基因转录起始位点（TSS）在内的启动子区域的序列设计引物。该软件提供的引物序列如下：甲基化（MSP）正向-AGTTGGGGTAGTATATATAATTAACTGG，反向-TATTCAAAACCATTAACTCCG，非甲基化（USP）正向-TGTAGTTTGGGTGTATATAATATG，反向-ATTCAAACCATT。根据UCSC基因组浏览器，IL12-B基因TSS上游1Kb内有一个CpG岛。人类IL-12B基因的基因组位置从第5染色体上的核苷酸159314783到159330473。此后，根据制造商说明，使用亚硫酸氢盐转化试剂盒（EpiTect亚硫酸氢酯试剂盒，Qiagen）处理DNA样本。随后，对亚硫酸氢盐转化的DNA样本进行PCR。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行检测。

血浆细胞因子测定

按照上述方法，收集后储存在−80°C下的血浆样品用于检测IL-12（p70）和26种其他细胞因子，方法是使用Bio-Read（美国加利福尼亚州Bio-Rad Inc.）的Bioplex检测试剂盒，遵循制造商的说明和之前描述的协议周等，2014.

5-氮胞苷（5-AZA）对DNMT1的体外抑制作用

THP-1细胞在含有50ml FBS、5ml HEPES、5ml青霉素链霉素和0.9μlβ-巯基乙醇的完整RPMI1640培养基中培养。然后在1ml培养基中用1μM 5-AZA处理200万处于指数期的细胞2-4天。每24小时，用新鲜培养基替换一半培养基，并添加5-AZA。在上述治疗持续时间后，从细胞中分离出总RNA，并用于qRT-PCR检测IL-12B转录物。

用siRNA敲除KDM5B

Kdm5b通过转染其特异性siRNA在THP-1细胞中被敲除。siRNA具有以下序列，来自Integrated DNA Technologies（IDT，Iowa，USA）；意义：rGrCrCrArCrArArUrUrGrCrArUrGrUrGrGrArArUdTdT和反义：rArUrCrArArArUr GrCrArAr UrGrArArAr。第一，2×105THP-1细胞接种于500μl完整RPMI培养基中的24孔板中。24小时后，去除60%的培养基，用脂质体包裹的siRNA转染细胞®RNAi MAX（美国生命科技公司），最终浓度为5pmol，遵循转染试剂的可用说明。随后添加与转染前去除的体积相等的新鲜培养基。转染24小时后，加入重组人IFNG（100ng/ml，Biolegend，美国）和细菌LPS（1μg/ml，SIGMA，美国）刺激THP-1细胞诱导IL-12表达。刺激24小时后，收集细胞并提取总RNA，以qRT-PCR测定IL-12B和KDM5B转录物。

miR-193a-5p和抗miR-193a-5p转染

新鲜PBMC（1×106)按照制造商的说明，用封装在HiPerFect®转染试剂（均来自加利福尼亚州巴伦西亚的Qiagen）中的前miR或抑制剂（50nM终浓度）转染从健康对照中分离的细胞。仅用转染试剂进行对照/模拟转染，但不使用miRNA。转染并在6h结束时形成最终培养体积后，添加人重组IFNG（100ng/ml）和细菌LPS（1μg/ml）。然后将细胞在5%CO中孵育24小时2孵化器。在上述培养时间后，分离总RNA并用于IL-12B转录物的qRT-PCR估计。

结果

PBMC中的全基因组组蛋白H3三甲基化

为了确定PTSD患者免疫细胞中的组蛋白甲基化状态是否发生改变，我们从外周血中分离出PBMC并进行ChIP-seq。检测了四个研究相对较好的组蛋白标记物H3K4me3、H3K27me3、H3K36me3和H3K9me3。从这些标记沿着23条染色体的ChIP-seq获得的信号强度显示为图1a总的来说，PTSD样本中与H3K4me3、H3K36me3和H3K9me3标记相关的区域更多。然而，对照组和创伤后应激障碍患者与H3K27me3相关的基因组区域数量相似。相关分析进一步说明了这一点，如图1b众所周知，这些组蛋白标记在基因组中的分布并不均匀(Mikkelsen等人，2007年;Roh等人，2006年). 还根据基因组特征比较了它们的分布模式。对照组和创伤后应激障碍患者之间这4个标记物的信号分布特征存在显著差异(图2a-2d)这表明组蛋白标记在基因组中的位置发生了变化。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-740171-f0001.jpg
PBMC中的全基因组组蛋白甲基化

分离出一名对照组和一名创伤后应激障碍患者的PBMC，并按照方法中的描述用ChIP-seq检测组蛋白甲基化。a）圆形图显示对照组和创伤后应激障碍患者23条染色体中的组蛋白三甲基化。从最外面的圆开始，这些圆分别代表对照组和创伤后应激障碍组的H3K4me3、H3K36me3、H3K27me3和H3K9me3。b）组蛋白标记整体相关性的热图。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-740171-f0002.jpg
组蛋白甲基化信号在基因组特征中的分布

对照组和创伤后应激障碍患者的PBMC按照图1组蛋白甲基化信号位于启动子区域（TSS上游3kb）、基因体（内含子和外显子）和基因间区域的百分比。还显示了这3个区域的基因组序列百分比。a）H3K4me3，b）H3K27me3，c）H3K36me3和d）H3K9me3。

PBMC中的全局DNA甲基化

由于DNA甲基化在调节基因表达方面也起着重要作用，我们使用MeDIP-seq比较了一名对照组和一名创伤后应激障碍患者PBMC的整体DNA甲基化模式。在我们的MeDIP实验中，与基因组中几个位置对齐的读数很常见，因为重复区域的甲基化程度很高。在这里，我们只使用了唯一映射的读取。大约70-80%的总序列读取是唯一映射到基因组的。与组蛋白甲基化相反，对照组和创伤后应激障碍组的DNA甲基化的总体水平和模式没有显著差异。对照组和创伤后应激障碍患者23条染色体的DNA甲基化水平如图所示图3a许多基因在其转录起始位点（TSS）中具有CpG岛，并且DNA甲基化信号通常在CpG岛中富集。富集分析确实表明，DNA甲基化信号在两个样品的TSS的1kb范围内高度富集(图3b). 由于已知启动子区域的DNA甲基化可以调节基因活性，因此我们在所有基因的TSS的1kb范围内进行了信号关联。对照组和创伤后应激障碍患者启动子区的总DNA甲基化水平相关性良好(图3c)表明这两个样本中大多数基因在TSS附近具有相似的DNA甲基化水平。然而，某些单个基因的信号密度存在显著差异，这表明这些基因的表达可能通过PTSD患者PBMC中的DNA甲基化而改变。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-740171-f0003.jpg
PBMC的全基因组DNA甲基化模式

从一名对照组和一名创伤后应激障碍患者的PBMC中分离出基因组DNA。用MeDIP-seq检测DNA甲基化。a）圆形图显示23条染色体中观察到的DNA甲基化，外环为对照，内环为创伤后应激障碍患者。彩色线条将miRNA在不同染色体中的位置与miRNA的预测或已知靶点的位置连接起来。b）TSS附近DNA甲基化信号的相对富集曲线。c）对照组和创伤后应激障碍患者TSS 1kb范围内DNA甲基化信号的相关性。

的表达式IFNG公司及其相关组蛋白和DNA甲基化

在我们之前的研究中，我们发现PTSD患者PBMC中IFNG的蛋白水平显著增加(Zhou等人，2014年). 为了确定增加的蛋白质是否是由于转录增强，我们检测了IFNG公司及其转录因子TBX-21型通过实时PCR。两者的表达TBX-21型和IFNG公司PTSD样本与对照样本相比显著增加(图4c)，表明IFNG公司创伤后应激障碍可能会加重。从我们的ChIP-seq数据中检查组蛋白甲基化显示IFNG公司PTSD中的基因与激活标记H3K4me3相关，而对照组中没有该标记(图4a). 同样，在TBX-21型创伤后应激障碍基因(图4a). 此外，我们还发现TSS附近的DNA甲基化水平IFNG公司与对照组相比，PTSD较低(图4b). 然而，DNA甲基化在TBX-21型发现启动子（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-740171-f0004.jpg
提升的表达式IFNG公司和TBX-21型PTSD患者PBMC中

对照组和创伤后应激障碍患者的PBMC按照图1.a）不同相关组蛋白甲基化标记IFNG公司和TBX-21型.b）基因启动子区的DNA甲基化水平IFNG公司.c、 d）相对丰度（以褶皱变化表示）IFNG公司和TBX-21型通过实时PCR分别测定来自对照组（n=17）和PTSD患者（n=16）的PBMC转录物。创伤后应激障碍组中的每个方块代表一名人类受试者。控制中的液位设置为1。

的表达式白介素-12及其相关的DNA和组蛋白甲基化

在我们的MeDIP-seq数据中，我们发现白介素-12BPTSD患者的基因显著低于对照组(图5a). 为了确定差异DNA甲基化水平白介素-12B该基因是由于个体变异或创伤后应激障碍所致，使用从几个对照组和创伤后应激疾病患者的PBMC中分离的DNA进行DNA甲基化特异性PCR。在对照样品中，甲基化带比非甲基化带强得多，而PTSD样品中甲基化带和非甲基化条带的强度相似(图5b). 此外白介素-12B该基因与PTSD样本中的激活组蛋白标记H3K4me3相关，而在对照样本中发现抑制标记H3K9me3(图5c). 组蛋白和DNA甲基化标记都表明，这种促炎细胞因子的表达是通过表观遗传修饰激活的。事实上白介素-12B通过实时PCR测定，PTSD样本中PBMC的转录物高于对照样本(图5d). 的表达式白介素-12A编码IL-12 p35亚基的基因在PTSD中也略有增加(图5d). 然而，在我们的ChIP-seq和MeDIP-seq数据中没有发现差异相关的组蛋白标记或DNA甲基化（数据未显示），这表明白介素-12A基因可能受到其他机制的调控。CpG岛对应的DNA甲基化水平的比较IL12B级使用NCBI的GEO数据集，我们发现PTSD的平均β值略低于对照组（数据未显示），表明PTSD的DNA甲基化趋势较低。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-740171-f0005.jpg
提升的表达白介素-12PTSD患者PBMC中

对照组和创伤后应激障碍患者的PBMC按照图1.a）IL-12B启动子区的DNA甲基化。b）代表性对照组和PTSD患者的DNA甲基化特异性PCR结果（M：甲基化DNA，U：非甲基化DNA）。c）IL-12B基因中的相关组蛋白甲基化标记物。d、 e）实时PCR分别测定对照组（n=17）和创伤后应激障碍患者（n=16）PBMC中IL-12A和IL-12B转录物的相对丰度（以倍数变化表示）。创伤后应激障碍组中的每个方块代表一名人类受试者。控制中的液位设置为1。

击倒KDM5B系列或抑制DNMT1（DNMT1）上调表达白介素-12B

KDM5B是一种组蛋白去甲基化酶，已知专门去甲基化H3K4me3的赖氨酸4。H3K4me3型甲基化与靶基因的上调有关。用siRNA转染后KDM5B系列，转录水平白介素-12B与对照组相比显著增加(图6a). 根据转染到敲除的基因KDM5B系列在转染细胞中较少(图6b). DNMT1是负责DNA甲基化的酶之一，已知低剂量5-AZA可以抑制这种酶。用1μM浓度的5-AZA处理后，IL-12B的转录物显著高于未处理的THP-1细胞(图6c).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms-740171-f0006.jpg
保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-740171-f0007.jpg
白细胞介素-12B表达受多种表观遗传机制和miRNA的影响

a）对照组和创伤后应激障碍受试者血清中IL12（p70）水平，通过Bioplex测定进行分析。对于在体外研究表明，在一种实验中，THP-1细胞被5-AZA@1μM浓度处理，并转染siRNAKDM5B系列另一种方法是通过实时PCR定量IL-12B转录。b）5-AZA治疗48小时后IL-12B的转录水平。c）基因敲除后IL-12B的转录水平KDM5B。 d）KDM5B被siRNA敲除后的转录水平。e）在IPA中为失调的miRNAs和一些选择性靶点生成MiRNA-gene交互网络。绿色表示下调的miRNA，红色表示上调。实心箭头表示直接交互，而断开则表示间接交互。随后，如方法所述，通过转染其前miR，hsa-miR-193a-5p在THP-1细胞中上调，以观察其对IL-12表达的影响。f）qRT-PCR检测PTSD患者PBMC中hsa-miR-193a-5p水平（对照组17人和PTSD组16人）。g）用pre-miR-193a-5p或其抑制剂转染后，健康对照组PBMC中IL-12B转录物的水平。h）用前miR-193a-5p转染健康对照组PBMC后，通过ELISA检测培养上清液中的IL-12（p70）。（RA：相对丰度，RE：相对表达）。

miRNA在促炎细胞因子表达中的作用

我们之前报道过PTSD患者外周血单个核细胞IFNG增加，至少部分受miRNAs调节(Zhou等人，2014年). 在该研究中，我们还发现了许多在创伤后应激障碍（PTSD）样本中表达显著下调的miRNAs。为了评估这些改变的miRNAs是否与促炎细胞因子、IFNG和IL-12的增加表达有关，我们使用Ingenuity Pathway analysis（IPA；加利福尼亚州红木市齐根）进行了miRNA-gene相互作用分析。如所示图6e，几个miRNAs直接靶向IL-12、IFNG或TBX-21型因此，我们选择了hsa-miR-193a-5p，因为它在我们的阵列数据中被显示为下调，并且也被预测为靶向白介素-12B我们对hsa-miR-193a-5p的qRT-PCR分析表明，在创伤后应激障碍中，miRNA的表达至少减少了50%(图6f). 用前miR-193a-5p转染THP-1细胞后，IL-12B的转录水平明显低于模拟转染组(图6g). 此外，用IL-12培养上清液进行ELISA后，我们在模拟转染组中无法检测到IL-12(图6h).

讨论

应激是一种已知的因素，可以诱导表观遗传变化，并有助于各种疾病的发病机制。表观遗传调控在PTSD样症状发展中的大多数证据来自使用动物模型的研究，这些研究通常侧重于PTSD相关精神影响的表观遗传机制。很少有研究调查表观基因组在创伤后应激障碍患者免疫功能障碍中的作用。在这项研究中，我们首先检测了PBMC的整体组蛋白和DNA甲基化状态。为此，我们仅纳入了对照组和创伤后应激障碍组各一个样本，因为我们的目标是将其用作识别目标基因的筛选工具。4种组蛋白标记物，特别是H3K4me3、H3K36me3和H3K9me3的总水平和基因组区域的显著变化表明，PTSD中组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的活性可能会改变。这些结果进一步表明，PTSD组蛋白甲基化修饰可能会改变大量基因的表达。然而，我们对这些数据的解释非常谨慎，因为个体差异可能对组蛋白标记的改变有很大贡献。然而，应激诱导的组蛋白甲基化的全局变化与啮齿类动物有关。据报道，在大鼠大脑中，急性应激导致H4K9me3和H3K27me3的全球水平发生变化，H3K4me3略有变化，而慢性应激降低H3K9me2水平并增加H3K4me3水平(Hunter等人，2009年). 组蛋白去乙酰化酶（HDAC）与记忆形成和PTSD发展有关。PTSD患者HDAC2水平降低(Sun等人，2013年). 尽管PTSD与HDAC表达改变之间缺乏机械联系，但这些观察结果增加了组蛋白修饰酶活性可能影响PTSD易感性和发展的可能性。未来，我们将利用健康对照组和创伤后应激障碍患者的大量样本，检查PBMC中组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的活性或表达是否发生改变。

关于DNA甲基化，一些研究表明PTSD患者PBMC中某些免疫功能基因的表达受DNA甲基化的调节。使用微阵列分析外周血细胞中CpG位点的甲基化状态，乌丁等。，(2010)研究表明，在创伤后应激障碍的非甲基化基因中，免疫功能相关基因的比例过高。另一项研究还显示与免疫功能相关的全球以及基因特异性DNA甲基化模式发生改变(Smith等人，2011年). 例如，PTSD患者PBMC中促炎细胞因子IL-18的表达增加，这种增加的表达与基因中DNA甲基化的减少相关(Rusiecki等人，2013年). 我们发现，与对照组相比，PTSD患者PBMC中许多基因的启动子区域具有不同的DNA甲基化水平，尽管总体甲基化状况没有显著变化。因此，我们的数据表明，由于特定基因中DNA甲基化的改变，参与PTSD发病机制和相关炎症的许多基因的表达可能会发生改变。

IL-12是一种促炎基因，其在创伤后应激障碍相关免疫功能障碍中的作用尚未见报道。在功能上，IL-12（p70）具有IL-12A（p35）和IL-12B（p40）亚单位，它们结合为异二聚体。我们对改变基因表达的筛查表明白介素-12BPTSD患者的表达可能被解除了调控。与此相关的是，更大样本量的qRT-PCR分析确实表明，IL-12B基因转录物在PTSD中更多。我们的组蛋白甲基化数据显示H3K4me3在白介素-12BPTSD的启动子，这表明该基因转录水平较高。因此，为了确认白介素-12B转录受H3K4me3甲基化的影响，我们敲除了KDM5B系列KDM5B是负责H3K4me3去甲基化的酶(Klein等人，2014年). 我们假设撞倒了KDM5B系列将导致H3K4me3去甲基化减少，导致白细胞介素-12B基因。事实上，我们看到了更高的转录水平白细胞介素-12BsiRNA敲除后KDM5B系列此外，经qRT-PCR确认后KDM5B系列在siRNA转染的细胞中与载体相比更少，这表明敲除是有效的。这些数据表明，IL-12B基因的表达受H3K4me3甲基化的影响。

此外，我们的筛选结果表明，DNA甲基化在白介素-12B创伤后应激障碍。因此，我们用围绕CpG岛的引物进行甲基化特异性PCR白介素-12B添加更多样本后启动程序。我们发现，对照样品中的甲基化带比非甲基化带强得多，而PTSD样品中甲基化带和非甲基化条带的强度相似。启动子区域周围的DNA甲基化与相应基因的低转录有关(穆尔斯2013). 因此，我们的结果表明白介素-12B对照个体中的基因甲基化严重，该基因的表达可能受到抑制。另一方面，DNA甲基化白介素-12BPTSD的启动子较低，因此甲基化介导的抑制可能在PTSD中被解除。为了确认这一点白介素-12B基因表达也受到DNA甲基化的影响，我们开始改变THP-1细胞中的DNA甲基化。我们用5-氮胞苷（5-AZA）处理细胞以抑制DNA甲基转移酶。5-AZA被认为在较低浓度下抑制DNA甲基转移酶(Christman 2002年). 我们的治疗结果表明白介素-12B与溶媒对照组相比，治疗组的转录物显著增多。该观察结果表明，较低的DNA甲基化可以增强白介素-12B因此可能是导致其在创伤后应激障碍中表达改变的另一种机制。

IFNG是Th1细胞产生的标志性细胞因子，如我们之前的研究所示，其在PTSD患者PBMC中的表达升高(Zhou等人，2014年). 已知IL-12可诱导IFNG表达(Puddu等人，1997年)通过JAK-STAT信号通路(Schroder等人，2004年). 在这项研究中，我们发现组蛋白标记和DNA甲基化与白细胞介素-12B和IFNG公司与PTSD患者PBMC中其表达增加的事实一致。基于此，我们假设IFNG公司PTSD中产生细胞可能是通过涉及JAK-STAT途径的IL-12信号传导。有趣的是，我们关于JAK和STAT分子的其他数据（未发表）也表明，与对照组相比，它们在PTSD中上调。此外，TBX-21，与IFNG公司促进剂(Djuretic等人，2007年;Collier等人，2014年)根据我们的qRT-PCR分析，创伤后应激障碍也受到上调。H3K4me3标记打开TBX-21型被发现在创伤后应激障碍样本中更为突出，如图4a这一结果表明，观察到的TBX-21型PTSD中的基因可能是因为H3K4me3甲基化水平较高。

miRNAs对基因表达的转录后调控是基因调控的另一层(巴特尔2004). 例如，我们已经展示了PTSD中IFNG失调与靶向miRNAs表达改变之间的关系(Zhou等人，2014年). 在我们正在进行的研究中，使用微阵列，我们发现PTSD患者PBMC中许多miRNA的表达下调（数据未显示）。许多下调的miRNA被预测直接靶向白介素-12，如所示图6e提示促炎细胞因子的表达将进一步增加。因此，我们试图进一步研究hsa-miR-193a-5p在白介素-12B表达。我们将前miR-193a-5p转染到从健康供体收集的PBMC中。我们的结果表明，miR-193a-5p转染降低了IL-12B转录物和IL-12 p70的水平。这些数据清楚地表明白介素-12B可能是hsa-miR-193a-5p的靶点，miRNA表达的改变可以在转录后水平影响IL-12B的表达。然而，我们知道还需要进一步研究来证明hsa-miR-193a-5p与IL-12B。

总之，目前的研究表明，促炎细胞因子IL-12在PTSD患者PBMC中上调，从而表明IL-12对这些患者IFNG增加的作用。此外，我们提供了证据表明，多种表观遗传机制和miRNAs可以影响促炎基因的表达。作为证明，我们证明了白介素-12和IFNG公司可能受到多种表观遗传学机制（组蛋白甲基化、DNA甲基化）和miRNA的影响。尽管如此，我们知道需要更大的样本量和细胞特异性研究来收集更多关于创伤后应激障碍对这些表观遗传标记和miRNAs表达的全基因组影响的信息。最近的一项大型研究表明，患有创伤后应激障碍的男性和女性感染性疾病、内分泌代谢、神经系统、消化系统、自身免疫系统和许多其他疾病的发病率较高(Frayne等人，2011年). 有趣的是，炎症是大多数此类临床疾病的根本原因。因此，我们旨在了解表观基因组和miRNA在引发PTSD炎症加剧中的作用的研究可能会开发出新的策略来预防和治疗PTSD，以及一些PTSD相关的临床障碍。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）P01AT003961、R01AT006888、R01ES019313、R01MH094755和P20GM103641的资助，以及PN和MN的退伍军人事务优秀奖（Veterans Affairs Merit Award BX001357）的支持。

脚注

道德认可在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序均由机构审查委员会批准。

利益冲突提交人声明他们没有利益冲突。

参考文献

  • Ambros V.动物microRNA的功能。自然。2004年9月16日；431(7006):350–5.doi:10.1038/nature02871。[公共医学][谷歌学者]
  • Bannister AJ、Schneider R、Myers FA、Thorne AW、Crane-Robinson C、Kouzarides T。组蛋白H3的二甲基和三甲基赖氨酸36在活性基因上的空间分布。生物化学杂志。2005;280:17732–17736.doi:10.1074/jbc。M500796200[公共医学][谷歌学者]
  • 巴特尔DP。微RNA：基因组学、生物发生、机制和功能。单元格。2004;116(2):281–97.doi:10.1016/S0092-8674（04）00045-5。[公共医学][谷歌学者]
  • Bernstein BE、Mikkelsen TS、Xie X、Kamal M、Huebert DJ、Cuff J、Fry B、Meissner A、Wernig M、Plath K、Jaenisch R、Wagschal A、Feil R、Schreiber SL、Lander ES。二价染色质结构标志着胚胎干细胞中的关键发育基因。单元格。2006;125:315–326.doi:10.1016/j.cell.2006.02.041。[公共医学][谷歌学者]
  • Blankenberg D、Von Kuster G、Coraor N、Ananda G、Lazarus R、Mangan M、Nekrutenko A、Taylor J.Galaxy:一种面向实验学家的基于网络的基因组分析工具。当前质子分子生物学。2010;10:11–21.第19章：第19单元。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 克里斯特曼·JK。5-氮胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷作为DNA甲基化抑制剂：机理研究及其对癌症治疗的意义。致癌物。2002年8月12日；21(35):5483–95.doi:10.1038/sj.onc.1205699。[公共医学][谷歌学者]
  • Collier SP，Henderson MA，Tossberg JT，Aune TM。T-bet对从Ifn到Tmevpg1的Th1基因组基因座的调节。免疫学杂志。2014年10月15日；193(8):3959–65.doi:10.4049/jimmunol.1401099。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Djuretic IM、Levanon D、Negreanu V、Groner Y、Rao A、Ansel KM。转录因子T-bet和Runx3协同激活T辅助1型细胞中的Ifng并沉默Il4。自然免疫学。2007年2月；8(2):145–53.doi:10.1038/ni1424。[公共医学][谷歌学者]
  • Flintoft L.非编码RNA：lncRNA的结构和功能。Nat Rev基因。2013;14:598.doi:10.1038/nrg3561。[公共医学][谷歌学者]
  • Gill JM、Saligan L、Woods S、Page G。创伤后应激障碍与过度的炎症免疫活动有关。透视精神病护理。2009;45:262–277.doi:10.1111/j.1744-6163.2009.00229.x[公共医学][谷歌学者]
  • Greer EL，Shi Y.组蛋白甲基化：健康、疾病和遗传的动态标记。Nat Rev基因。2012;13:343–357.doi:10.1038/nrg3173。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • He L、Hannon GJ。MicroRNAs：在基因调控中起重要作用的小RNA。Nat Rev基因。2004;5:522–531.doi:10.1038/nrg1379。[公共医学][谷歌学者]
  • Hoge EA、Brandstetter K、Moshier S、Pollack MH、Wong KK、Simon NM。惊恐障碍和创伤后应激障碍中广泛的细胞因子异常。抑制焦虑。2009;26:447–455.doi:10.1002/da.20564。[公共医学][谷歌学者]
  • Hunter RG、McCarthy KJ、Milne TA、Pfaff DW、McEwen BS。急性和慢性应激对海马H3组蛋白甲基化的调节。美国国家科学院院刊。2009;106:20912–20917.doi:10.1073/pnas.0911143106。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kessler RC、Chiu WT、Demler O、Merikangas KR、Walters EE。国家共病调查复制中12个月DSM-IV疾病的患病率、严重程度和共病。Arch Gen精神病学。2005;62:617–627.doi:10.1001/archpsyc.62.6.17。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Klein BJ、Piao L、Xi Y、Rincon-Arano H、Rothbart SB、Peng D、Wen H、Larson C、Zhang X、Zheng X、Cortazar MA、Peña PV、Mangan a、Bentley DL、Strahl BD、Groudine M、Li W、Shi X、Kutateladze TG。组蛋白-H3K4-特异性脱甲基酶KDM5B通过不同的PHD指与底物和产物结合。单元格代表。2014年1月30日；6(2):325–35.doi:10.1016/j.celrep.2013.12.021。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Langmead B、Trapnell C、Pop M、Salzberg SL。短DNA序列与人类基因组的超快和高效记忆比对。基因组生物学。2009;10（3） ：R25。doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lehnertz B、Ueda Y、Derijck AA、Braunschweig U、Perez-Burgos L、Kubicek S、Chen T、Li E、Jenuwein T、Peters AH。Suv39h介导的组蛋白H3赖氨酸9甲基化将DNA甲基化导向中心周围异染色质的主要卫星重复序列。当前生物量。2003;13:1192–1200.doi:10.1016/S0960-9822（03）00432-9。[公共医学][谷歌学者]
  • Lienhard M、Grimm C、Morkel M、Herwig R、Chavez L.MEDIPS：DNA富集实验测序数据的全基因组差异覆盖分析。生物信息学。2014;30：284–286。doi:10.1093/bioinformatics/btt650。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Li LC，Dahiya R.MethPrimer:设计甲基化PCR引物。生物信息学。2002年11月；18(11):1427–31.10.1093/bioinformatics/18.11.1427。[公共医学][谷歌学者]
  • Mikkelsen TS、Ku M、Jaffe DB、Issac B、Lieberman E、Giannoukos G、Alvarez P、Brockman W、Kim TK、Koche RP、Lee W、Mendenhall E、O'Donovan A、Presser A、Russ C、Xie X、Meissner A、Wernig M、Jaenisch R、Nusbaum C、Lander ES、Bernstein BE。多能干细胞和谱系承诺细胞染色质状态的基因组图。自然。2007;448:553–560.doi:10.1038/nature06008。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Muers M.基因表达：分离DNA甲基化。Nat Rev基因。2013;14:519.doi:10.1038/nrg3535。[公共医学][谷歌学者]
  • Puddu P、Fantuzzi L、Borghi P、Varano B、Rainaldi G、Guillemard E、Malorni W、Nicaise P、Wolf SF、Belardelli F、Gessani S.IL-12诱导小鼠腹腔巨噬细胞中IFN-gamma的表达和分泌。免疫学杂志。1997年；159:3490–3497.[公共医学][谷歌学者]
  • Roh TY，Cuddapah S，Cui K，Zhao K。人类T细胞组蛋白修饰的基因组景观。美国国家科学院院刊。2006;103:15782–15787.doi:10.1073/pnas.0607617103。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Roh TY，Wei G，Farrell CM，Zhao K。组蛋白乙酰化模式对保守和非保守增强子的全基因组预测。基因组研究。2007;17:74–81.doi:10.1101/gr.5767907。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rohleder N，Karl A.内分泌和炎症改变在创伤后应激障碍合并躯体疾病中的作用。Minerva内分泌。2006;31：273–288。[公共医学][谷歌学者]
  • Ross Innes CS、Stark R、Teschendorff AE、Holmes KA、Ali HR、Dunning MJ、Brown GD、Gojis O、Ellis IO、Green AR、Ali S、Chin SF、Palmieri C、Caldas C、Carroll JS。不同雌激素受体结合与乳腺癌临床结局相关。自然。2012;481:389–393.doi:10.1038/nature10730。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rothbart SB，Strahl BD.解释组蛋白和DNA修饰的语言。Biochim生物物理学报。2014年8月；1839(8):627–43.doi:10.1016/j.bbagrm.2014.03.001。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rusiecki JA、Byrne C、Galdzicki Z、Srikatan V、Chen L、Poulin M、Yan L、Baccarelli A.PTSD和特定免疫功能基因启动子区域的DNA甲基化：美国军人的重复测量病例对照研究。前线精神病学。2013;4:56.doi:10.3389/fpsyt.2013.00056。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Schroder K，Hertzog PJ，Ravasi T，Hume DA。干扰素-γ：信号、机制和功能概述。白细胞生物学杂志。2004年2月；75(2):163–89.doi:10.1189/jlb.0603252。[公共医学][谷歌学者]
  • Shin H、Liu T、Manrai AK、Liu XS。CEAS：顺规则元素注释系统。生物信息学。2009;25:2605–2606.doi:10.1093/bioinformatics/btp479。[公共医学][谷歌学者]
  • Smith AK、Conneely KN、Kilaru V、Mercer KB、Weiss TE、Bradley B、Tang Y、Gillespie CF、Cubells JF、Ressler KJ。创伤后应激障碍患者的差异免疫系统DNA甲基化和细胞因子调节。Am J Med Genet B神经精神病学遗传学。2011;156B亿：700–708。doi:10.1002/ajmg.b.31212。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sun H、Kennedy PJ、Nestler EJ。抑郁大脑的表观遗传学：组蛋白乙酰化和甲基化的作用。神经精神药理学。2013;38:124–137.doi:10.1038/npp.2012.73。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Frayne SM、Chiu VY、Iqbal S、Berg EA、Laungani KJ、Cronkite RC、Pavao J、Kimerling R。创伤后应激障碍退伍军人的医疗需求：他们的其他负担。J Gen医学实习生。2011年1月；26(1):33–9.doi:10.1007/s11606-010-1497-4。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Sutherland AG、Alexander DA、Hutchison JD。创伤后精神病理学中促炎细胞因子的干扰。细胞因子。2003;24:219–225.doi:10.1016/j.cyto.2003.09.004。[公共医学][谷歌学者]
  • Thomas JL、Wilk JE、Riviere LA、McGurk D、Castro CA、Hoge CW。在伊拉克作战3个月和12个月后，现役部队士兵和国民警卫队士兵中心理健康问题和功能损害的患病率。Arch Gen精神病学。2010;67:614–623.doi:10.1001/archgen精神病学2010.54。[公共医学][谷歌学者]
  • Uddin M、Aiello AE、Wildman DE、Koenen KC、Pawelec G、DE Los Santos R、Goldmann E、Galea S.创伤后应激障碍相关的表观遗传和免疫功能概况。美国国家科学院院刊。2010;107:9470–9475.doi:10.1073/pnas.0910794107。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Vakoc CR、Mandat SA、Olenchock BA、Blobel GA。组蛋白H3赖氨酸9甲基化和HP1gamma与哺乳动物染色质的转录延长相关。分子细胞。2005;19:381–391.doi:10.1016/j.molcel.2005.06.011。[公共医学][谷歌学者]
  • Vire E、Brenner C、Deplus R、Blanchon L、Fraga M、Didelot C、Morey L、Van Eynde A、Bernard D、Vanderwinden JM、Bollen M、Esteller M、Di Croce L、de Launoit Y、Fuks F。Polycomb组蛋白EZH2直接控制DNA甲基化。自然。2006;439:871–874.doi:10.1038/nature04431。[公共医学][谷歌学者]
  • von Kanel R、Hepp U、Kraemer B、Traber R、Keel M、Mica L、Schnyder U。创伤后应激障碍患者的低度全身促炎活性证据。精神病学研究杂志。2007;41:744–752.doi:10.1016/j.jpsychires.2006.06.009。[公共医学][谷歌学者]
  • Wei G，Wei L，Zhu J，Zang C，Hu-Li J，Yao Z，Cui K，Kanno Y，Roh TY，Watford WT，Schones DE，Peng W，Sun HW，Paul WE，O'Shea JJ，Zhao K。H3K4me3和H3K27me3的全球定位揭示了分化CD4+T细胞谱系命运决定的特异性和可塑性。免疫。2009;30:155–167.doi:10.1016/j.immuni.2008.12.009。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zang C，Schones DE，Zeng C，Cui K，Zhao K，Peng W.从组蛋白修饰ChIP-Seq数据中鉴定富集结构域的聚类方法。生物信息学。2009;25:1952–1958.doi:10.1093/bioinformatics/btp340。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhou J，Nagarkatti P，Zhong Y，Ginsberg JP，Singh NP，Zhang J，Nakarkatti M.小RNA表达失调与创伤后应激障碍作战退伍军人免疫功能改变相关。公共科学图书馆一号。2014;9：e94075。doi:10.1371/journal.pone.0094075。2014年电子收集。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 周大众，戈伦A，伯恩斯坦BE。绘制哺乳动物基因组的组蛋白修饰和功能组织。Nat Rev基因。2011;12:7–18.doi:10.1038/nrg2905。[公共医学][谷歌学者]