国际临床实验病理学杂志。2015; 8(10): 13102–13107.
2015年10月1日在线发布。
C/EBP-α表达在人肝和肝纤维化中的作用及其与自噬的关系
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尹振斋
2复旦大学基础医学院病理学系，上海200032
迪丁
3复旦大学附属中山医院病理科，上海200032
刘秀平
2复旦大学基础医学院病理学系，上海200032
1中国北京大学深圳医院病理科
2复旦大学基础医学院病理学系，上海200032
3复旦大学附属中山医院病理科，上海200032
*平等贡献者。
2015年8月7日收到；2015年9月21日接受。
摘要
目的：探讨CCAAT增强子结合蛋白-α（C/EBP-α）在正常人肝脏和肝纤维化中的表达及其与自噬的可能关系。方法：采用双标记免疫组织化学方法检测C/EBP-α在肝细胞和肝星状细胞中的定位。在人类肝脏石蜡切片中，还通过免疫组织化学方法评估C/EBP-α、Atg5和Atg6的表达。用雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤（3MA）诱导或抑制HSC-T6细胞自噬，并用Western blotting检测C/EBP-α蛋白的表达。结果：双标记免疫组化显示C/EBP-α主要定位于肝细胞，与正常肝组织相比，其在纤维化组织中的表达显著降低。Atg5在纤维化中表达增加，但主要位于肝间隔和血管周围区域，这与HSC的分布一致。相反，Atg6在正常或纤维化肝脏中不表达。Western blotting显示，用雷帕霉素或3MA处理培养的HSC-T6细胞分别减少或增加C/EBP-α的表达。结论：C/EBP-α主要在正常肝细胞中表达，但在肝纤维化中表达显著降低。自噬可能通过与C/EBP-α的相关性在肝纤维化中发挥作用，但这一假设值得进一步研究。
关键词：C/EBP-α、肝细胞、肝星状细胞、自噬
引言
肝纤维化及其终末期疾病肝硬化是世界上主要的健康问题。更好地了解肝纤维化的发病机制对于开发逆转其进展的治疗方法至关重要。例如，肝星状细胞（HSC）的激活在肝纤维化过程中起着关键作用。活化的HSC是预防肝纤维化进展的主要细胞靶点。
HSC的分化与脂肪细胞的分化相似[1]. 因此，脂肪细胞特异性基因也可能协调HSC变化的调控。CCATT/增强子结合蛋白（C/EBP）家族在脂肪细胞的分化中起关键作用，已知C/EBP-α（C/EBP--α）控制前脂肪细胞的成熟和细胞生长[2-5].
在我们之前的研究中，我们发现C/EBP-α可以诱导HSC凋亡，但对体外肝细胞和体内小鼠肝功能只有轻微影响。然而，C/EBP-α在人类肝脏和肝纤维化中的表达尚不清楚。此外，先前的研究确定胱天蛋白酶-9的激活是体外细胞凋亡的主要事件。然而，半胱天冬酶非依赖性途径，如自噬、截瘫或有丝分裂突变，可能参与肝纤维化[6]. 因为自噬在正常脂肪细胞分化中的作用[7-9]，我们假设自噬与肝纤维化中的C/EBP-α相关。
在本报告中，我们首先用双标记免疫组织化学方法研究了C/EBP-α在正常人肝脏和肝纤维化中的表达和定位。通过免疫组织化学方法还测量了自噬相关5（Atg5）和6（Atg6）在正常人肝脏和肝纤维化中的表达。最后，使用大鼠肝星状细胞系（HSC-T6细胞）证明C/EBP-α与自噬的相关性。
材料和方法
材料
本研究选择了2014年至2015年间在北京大学深圳医院病理证实的30例肝纤维化患者的福尔马林固定石蜡包埋肝组织切片。正常肝脏标本也取自因外伤而接受肝切除术的患者。抗C/EBP-α抗体从圣克鲁斯生物技术公司（美国德克萨斯州达拉斯）获得。双标记免疫组织化学试剂盒和抗α-SMA抗体从麦新生物科技公司（中国福州麦新）获得。抗Atg5（克隆EPR1755-2）和Atg6（克隆EPR1733Y）的抗体从Abcam Biotechnology（英国剑桥）获得，雷帕霉素和3MA从Sigma-Aldrich（美国）购买。
C/EBP-α和α-SMA或CK8/18的双标记免疫组织化学
该程序是根据制造商的说明执行的。简单地说，脱蜡组织切片首先用α-SMA或CK8/18抗体进行免疫染色，并用BCIP/NBT/碱性磷酸酶染色进行可视化。清洗切片，用C/EBP-α抗体孵育，并通过AEC/过氧化物酶染色进行可视化。
肝组织切片的免疫组织化学
脱蜡组织切片（3µm厚）在95°C的0.01 m柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中培养20分钟，以进行抗原检索，然后进行C/EBP-α、α-SMA、Atg5或Atg6的免疫组织化学染色，并使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）进行可视化。对自动染色器（BenchMark XT，Roche）进行免疫组织化学染色，使用DAB作为染色原，Mayer’s苏木精作为副染色。
蛋白质印迹分析
HSC-T6细胞在600μM雷帕霉素存在下孵育8小时或10 mM 3MA孵育6小时。收集细胞后，将其在冷磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤，在冰镇RIPA缓冲液（10μM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS和10μl/ml蛋白酶抑制剂混合物）中冰上溶解45分钟。通过13000 g离心30分钟清除裂解液，并使用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。提取的细胞蛋白在含有十二烷基硫酸钠（SDS）的样品缓冲液中变性，在10-12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离，并转移到硝化纤维素膜上。使用ECL分析试剂盒显示蛋白质条带。使用抗C/EBP-α和β-actin的抗体，β-acton作为等负荷对照。
统计分析
使用11.0版SPSS软件进行统计分析。χ2试验用于比较C/EBP-α在正常肝脏和肝纤维化中的表达百分比。A类P（P）-值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
基于双标记免疫组织化学，C/EBP-α主要位于肝细胞，而非HSC、正常肝脏和肝纤维化
基于CK8/18和C/EBP-α双重标记免疫组织化学，我们发现C/EBP-α主要在正常肝脏的肝细胞核中表达。由于正常肝脏中的HSC处于静止状态，并且α-SMA标记物激活了HSC，因此在正常肝脏中未检测到α-SMA。肝纤维化时，肝细胞C/EBP-α表达降低；然而，C/EBP-α在α-SMA阳性细胞中不表达().
C/EBP-α和CK8/18或α-SMA的双标记免疫组化。
基于免疫组织化学，C/EBP-α主要位于正常肝脏的肝细胞中，在肝纤维化中表达降低
在正常肝脏中，C/EBP-α表达丰富，但在肝纤维化中几乎没有表达。然而，与正常肝脏相比，肝纤维化中Atg5的表达增加；Atg5主要在纤维隔膜周围的细胞核中表达，这与α-SMA阳性细胞的定位一致().
正常肝脏和肝纤维化中C/EBP-α、Atg5和Atg6表达的免疫组织化学分析（放大倍数×400）。
雷帕霉素诱导自噬，降低C/EBP-α表达
为了研究C/EBP-α是否参与自噬，将HSC-T6细胞在600μM雷帕霉素存在下孵育8小时，并对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析以检测C/EBP-α的表达。与未处理细胞相比，处理细胞中C/EBP-α的表达降低(P（P）<0.05;).
雷帕霉素或3MA处理的HSC-T6细胞C/EBP-α表达的Western blot分析。
自噬抑制剂3MA增加C/EBP-α的表达
为了研究C/EBP-α是否参与自噬，用10 mM 3MA处理HSC-T6细胞6 h，并对细胞裂解物进行Western blot分析以检测C/EBPα的表达。与未处理细胞相比，处理细胞中C/EBP-α的表达增加(P（P）<0.05;).
讨论
肝纤维化是肝脏慢性损伤的结果。长期的肝损伤会触发HSC的激活，从而产生细胞外基质成分。HSC活化在肝纤维化过程中起着关键作用，是抗纤维化治疗的重要靶点。
我们以前的研究发现C/EBP-α可以诱导HSC凋亡，但对小鼠肝细胞几乎没有影响[10]. 然而，C/EBP-α在人类正常肝脏和肝纤维化中的表达尚未研究。使用30例经病理证实的肝纤维化患者的福尔马林固定石蜡包埋肝组织切片，采用C/EBP-α和α-SMA或CK8/18双标记免疫组织化学方法检测其在HSC和肝细胞中的表达。CK8/18在肝细胞中表达，α-SMA主要在活化的HSC中表达；因此，我们发现C/EBP-α主要在正常肝脏的肝细胞中表达。由于正常肝脏中的HSC处于静止状态，这些细胞不表达α-SMA。相反，HSC在肝纤维化中被激活，但C/EBP-α在HSC中不表达，这与我们之前在小鼠中的发现一致[10].
我们以前的研究发现，C/EBP-α的表达在肝纤维化中降低，但通过双标记免疫组织化学检测，这种下降没有统计学意义。双标记免疫组织化学可能产生了较暗的背景，这可能使我们的结果更难解释。为了进一步研究这一问题，使用免疫组织化学自动染色器进行免疫组织化学检测C/EBP-α的表达，发现C/EBPα主要在正常肝脏中表达，但在肝纤维化中显著下调。
我们之前的研究还确定，半胱天冬酶非依赖性途径可能参与肝纤维化。据我们所知，已经提出了几种半胱天冬酶非依赖性细胞死亡程序的模型，如自噬、旁凋亡和有丝分裂突变[11].
自噬是一个动态的基本过程，据报道在发育、分化、细胞修复、免疫防御以及蛋白质质量控制中发挥作用。人们普遍认为，动态自噬过程主要由自噬相关基因（ATG）编码的一系列蛋白质执行[12].
ATG系统是完成自噬体的关键，类似于泛素化系统。atg5基因编码泛素样蛋白Atg12的受体蛋白atg5[13]. atg5的功能对脂肪生成很重要，提示自噬参与脂肪生成。与这一概念一致，氯喹对自噬的药物抑制阻止了细胞模型中的脂肪生成[14]. HSC的分化与脂肪细胞的分化相似[7]. 因此，脂肪细胞特异性基因也可能协调调节HSC的改变。我们之前的研究发现C/EBP-α参与了HSC的调节，所以我们想知道Atg5是否参与了HSC的调节。在本研究中，我们研究了Atg5在正常肝脏和肝纤维化中的表达。据我们所知，我们是第一个通过免疫组化证明Atg5在肝纤维化中过度表达的人。
Beclin-1首先被鉴定为一种Bcl-2-结合蛋白，其结构与酵母中的Atg6相似，并且在进化上在不同物种中保持不变[16]. Beclin-1基因座在各种人类恶性肿瘤中经常发生单等位基因缺失，包括脑癌、卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌[17]. 然而，在这项研究中，在正常肝脏和肝纤维化中没有检测到Atg6，而且Atg6似乎在肝纤维化中没有发挥作用。
HSC-T6细胞是一种永生化大鼠肝星状细胞系，已被广泛用作研究抗纤维化药物作用机制的体外检测系统。基于与原代细胞相似的维甲酸表型，该细胞模型对维甲酸代谢的研究特别有价值[18]. 正如我们之前使用过这些细胞一样，我们选择HSC-T6细胞作为HSC的模型系统。本研究分别使用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3MA诱导或抑制HSC-T6细胞的自噬，并通过Western blot分析检测C/EBP-α的蛋白表达。雷帕霉素使C/EBP-α蛋白表达降低，3MA使C/EBPα蛋白表达增加（均P<0.05）。这些数据表明C/EBP-α的表达可能由自噬控制，但其机制尚需进一步研究。
总之，我们的结果强烈表明C/EBP-α主要在正常肝脏的肝细胞中表达，但在肝纤维化中表达降低。C/EBP-α的表达可能与自噬有关，但其机制尚不清楚。据我们所知，我们是第一个研究C/EBP-α与自噬之间存在关联的人，我们认为这种关联可能对我们理解肝纤维化至关重要。
致谢
广东省自然科学基金博士启动基金（2015A030310031）；深圳市健康与计划生育科学研究项目（201401048）；北京大学深圳医院科学研究基金（201401）。
工具书类
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