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分子系统生物学。2015年11月；11(11): 838.
2015年11月30日在线发布。 数字对象标识：10.15252/msb.20156458
预防性维修识别码：项目经理4670727
PMID：26613961

频率调制ERK公司激活动力学改变细胞命运

玄柳,1,2 Minhwan Chung公司,1 梅西耶·多布伦斯基,三 德克·菲,三 扬尼克·布鲁姆,4 宋思利（Sung Sik Lee）,5 马提亚斯·彼得,5 鲍里斯·科洛登科,通讯作者三 Noo Li Jeon先生,通讯作者1,2和奥利维尔·佩茨通讯作者4,6
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补充资料

摘要

瞬态与持续ERK地图激酶(MAPK公司)激活动力学诱导表皮增殖与分化(表皮生长因子)或是神经(NGF公司)生长因子个人计算机‐12个电池。持续时间ERK公司因此，有人建议激活以指定细胞命运决定。使用生物传感器测量ERK公司单个活细胞的激活动力学表明表皮生长因子/NGF公司应用程序导致瞬态和持续的异构混合ERK公司种群不同细胞的活化动力学不同于种群平均水平。表皮生长因子偏向瞬态，而NGF公司对持续性的偏见ERK公司激活响应。相反，脉冲生长因子应用可以重复均匀触发ERK公司整个细胞群的活性瞬变。这些数据集使数学建模能够揭示MAPK公司最终，这预测了脉冲生长因子刺激机制，该机制可以绕过典型的反馈激活，重新连接系统，使其向细胞分化方向发展，而与生长因子的特性无关。

关键词：细胞命运决定、ERK活性动力学、FRET生物传感器、单细胞生物学、信号异质性
主题类别：定量生物学与动力系统、信号传递、发育与分化

介绍

复杂的信号网络允许细胞将外部刺激转化为特定的细胞命运。在许多情况下，信号动力学而非稳态控制着这些命运决定（莱文等,2013; 普维斯和拉哈夫，2013). 此外，即使在同基因群体中，单个细胞的信号状态也不同（Cohen‐Saidon等,2009; Snijder和Pelkmans，2011; 陈等,2012)由于蛋白质丰度的广泛分布，以及所有生化网络中存在的固有噪声（Snijder和Pelkmans，2011). 因此，测量单细胞信号动力学是理解细胞反应与命运决定之间关系的关键。

细胞外调节激酶（ERK）调节细胞命运，如增殖和分化。它在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号网络中发挥作用，其中生长因子（GF）受体激活Ras GTPase，随后触发MAPK级联，导致ERK激活（Avraham&Yarden，2011). 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞被用作研究MAPK依赖性命运决定的模型系统（Marshall，1995). 用EGF或NGF刺激分别导致短暂或持续的ERK激活动力学，从而触发增殖或分化（Marshall，1995; Avraham&Yarden，2011). 这些不同的ERK激活动力学涉及不同Ras亚型的激活（Sasagawa等,2005)以及依赖GF的MAPK网络拓扑控制（Santos等,2007)，负反馈或正反馈产生自适应或双稳态输出（Xiong&Ferrell，2003; 桑托斯等,2007; Avraham&Yarden，2011). 下游，信号持续时间的分子解释涉及通过持续的ERK活性稳定ERK诱导的即刻早期基因（IEG）产物，最终指示分化命运（墨菲等,2002; Nakakuki公司等,2010). 然而，单细胞分析表明，NGF不会导致PC-12细胞的均匀分化。相反，观察到分化细胞和增殖细胞的异质混合，各自的细胞命运选择取决于复杂的ERK和AKT信号编码（Chen等,2012). 在这里，我们研究了GF刺激的单个PC-12细胞中ERK的激活动力学。我们发现持续的GF刺激诱导不同于群体平均水平的异质性细胞反应，两种GF都能产生短暂和持续的ERK激活反应。我们通过应用GF脉冲动态探测ERK信号流，使ERK激活反应在整个细胞群体中均匀化。这为理解MAPK网络结构提供了新的见解，并最终为独立于GF身份的细胞命运决策重新布线提供了理论基础。

结果

持续GF刺激诱导异质ERK激活动力学

为了研究单个PC-12细胞中ERK的激活动力学，我们制作了一个表达EKAR2G的稳定细胞系，这是一种基于荧光共振能量转移的内源性ERK活性生物传感器（图1A） （哈维等,2008; 弗里茨等,2013). 该生物传感器专门报告ERK，但不报告p38丝裂原激活，也不报告c‐Jun N端激酶（Harvey等,2008). 通过核输出序列，EKAR2G定位于细胞质中的ERK活性，并专门测量其活性（图1B） ●●●●。虽然这似乎并不适用于所有类型的细胞（艾哈迈德等,2014)，我们假设ERK活性的细胞溶质和核池处于平衡状态，因为至少对于EGF刺激的PC-12细胞来说，核和细胞溶质ERK活化动力学之间没有明显的时滞（Herbst等,2011). 生物传感器的表达水平是均匀的，与人群中位数相比仅显示出较小的标准偏差(附录图S1A). 为了与我们的生物传感器实现的时间分辨率相匹配，我们使用了基于流量的计算机可编程微流体设备，以精确的动力学传递GFs（图1C） ●●●●。我们观察到流动诱导的瞬态ERK激活(附录图S1B和C). 这很可能是由于流动诱导的机械应力，和/或在活细胞成像实验中暴露于细胞存活所需的少量血清所致。随后，在流动效应减弱后，进行后续实验，得出平坦的基线(附录图S1D).

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持续GF公司刺激导致异质性ERK公司活动动力学

  1. EKAR公司2G生物传感器。磷酸化后ERK公司，绑定栈单磷酸化Cdc25底物序列的磷酸化识别域导致供体的空间重新定向(百万TFP1） 和受体（金星）荧光团导致FRET公司可以用比率测量的变化。
  2. 比例和百万TFP1个捐赠者图像EKAR公司2G英寸表皮生长因子‐刺激个人计算机‐指示时间点的12个电池吨=0′对应于表皮生长因子应用程序。上部面板：FRET公司比例图像是彩色编码的ERK公司活动。下面板：原始百万TFP1个黑/白对比的供者图像。比例尺=20μm。
  3. 基于流动的微流体装置GF公司交付。计算机控制的压力泵能够混合介质和GF公司s在控制部分（左），并在时间上定义GF公司在细胞培养室中输送（右侧放大插图）。
  4. 人口平均数ERK公司用磷酸化蛋白Western blot测定活化动力学ERK公司抗体。
  5. 人口平均数ERK公司细胞平均活化动力学EKAR公司2G排放比(急诊室s） 来自n个=至少111个单元格。显示StDev。
  6. 挑选出来的EKAR公司2G比率时间序列从上到下说明持续、振荡或瞬态ERK公司活动动力学。急诊室颜色编码为条形。比例尺=20μm。
  7. 单电池ERK公司活动轨迹。单元格平均值急诊室s用于n个=10个单元格，标准偏差范围（StDev），所示的总体平均值GF公司s和剂量。实验时间进程被标准化为紧邻前5个时间点的平均值GF公司应用程序。
  8. 单细胞瀑布图ERK公司活动轨迹。单元格平均值急诊室轨迹是彩色编码的(n个=78个细胞）、群体平均数（底部）。垂直虚线表示GF公司应用程序。

可在线获取此图的源数据。

在整个研究过程中，我们使用了高剂量、25 ng/ml EGF和50 ng/ml NGF（代表等效GF摩尔浓度（Santos等,2007))以及低剂量、1 ng/ml EGF和2 ng/ml NGF浓度。如前所述（桑托斯等,2007)Western blot分析表明，高剂量EGF触发了一个ERK激活峰，在10–15分钟后几乎恢复到基线水平（图1D） ●●●●。相比之下，高剂量NGF诱发了一个ERK激活峰，随后是持续的，但相对于ERK活性峰值而言有所降低。在群体平均EKAR2G测量中观察到类似的ERK激活动力学曲线（图1E） ●●●●。然而，在单细胞水平上，观察到短暂、振荡和持续ERK活性轨迹的混合（图1F–H，视频EV1)表明EGF和NGF诱导的ERK激活动力学是不同于群体平均水平的异质细胞反应的结果。这种信号异质性不是EKAR2G表达水平小而存在异质性的结果。具体而言，我们尚未观察到生物传感器表达水平与刺激后40′NGF触发的ERK活性之间的任何相关性，这是在细胞群中观察到高度异质性ERK活性的时间点和实验条件(附录图S1E). 此外，免疫染色实验证实了1标准与EGF相比，磷酸化ERK信号显示NGF的平均值和振幅扩展更高（图电动汽车1A–C）。使用Western blot对人群平均ERK活性测量值进行比较（图1D） 或免疫荧光（图电动汽车1B） ，与EKAR2G（图1E） ，揭示了1的稍慢的脱敏动力学标准后者的ERK活性峰值。天然与EKAR2G表达的PC-12细胞的免疫荧光分析显示，1标准后一种细胞中的峰值磷酸化ERK脱敏动力学（图电动汽车1D） 然而，在第一个峰值后，不会影响EGF与NGF磷酸化ERK信号的振幅。这表明生物传感器的表达在一定程度上影响MAPK信号网络。生物传感器FRET比率测量值不一定与他们报告的信号事件成线性比例，并且之前已经证明明确建模是有价值的（Birtwistle等,2011; 葛田等,2014). 然而，鉴于Western blot、免疫荧光和EKAR2G数据集之间的高度相似性，我们假设FRET比率测量可以直接用作ERK活性的替代物。这些结果表明，虽然EKAR2G的表达对ERK激活动力学的特定阶段有轻微影响，但它仍然是ERK信号传导的可靠指标。

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单电池的时间进程ERK公司激活稳态响应持续GF公司刺激

  1. 个人计算机‐用25 ng/ml刺激传统培养皿中的12个细胞表皮生长因子或50纳克/毫升NGF公司，在刺激后的指定时间点固定，并用抗磷酸染色ERK公司和反ERK公司2种抗体。图像是彩色编码的，用于磷化ERK公司或ERK公司2信号强度。请注意，免疫染色强度图像已被缩放，以便使磷酸化略微饱和ERK公司5′时间点的信号。这提供了所需的动态范围，以明确区分细胞群中的异质激活状态，以响应NGF公司在以后的时间点刺激。在1之后的时间点标准 ERK公司活动峰值，红色星号表示特定的细胞出现升高ERK公司活动。比例尺：50μm。
  2. 磷的种群分布ERK公司信号。细胞平均磷的箱线图ERK公司25 ng/ml的信号表皮生长因子和50 ng/mlNGF公司剂量，n个=至少1200个单元/条件/时间点；*<0.05，bootstrapping随机检验平均值的观察差异。中位数、四分位范围（方框）和1.5以内的数据IQR公司显示了下四分位数和上四分位数（晶须）的范围。测量值标准化为吨 = 0′.DAPI公司在CellProfiler中使用全局Otsu阈值分割染色图像。细胞体是通过基于总数的膨胀细胞核来识别的ERK公司染色。全细胞平均强度由磷ERK公司校正图像的不均匀照明和减去平均背景强度后的通道。
  3. 磷的密度图ERK公司25 ng/ml时的信号分布表皮生长因子和50纳克/毫升NGF公司刺激后45′。测量值标准化为吨 = 0′.
  4. phosho的种群分布ERK公司本机信号个人计算机‐12个电池或个人计算机‐12个细胞表达EKAR公司2G生物传感器。个人计算机‐12个表达或不表达EKAR公司混合2G，用25 ng/ml刺激表皮生长因子或50纳克/毫升NGF公司，固定在指定的时间点，并使用抗磷酸进行免疫染色ERK公司抗体。个人计算机‐12个表达或不表达EKAR公司2G使用FRET公司通道并按（B）进行分析，n个=至少990个细胞（*<0.05，两个样本吨平均值测试）。注意1标准 ERK公司在个人计算机‐12个表达EKAR公司2G与本机个人计算机‐12个电池。然而，磷酸化增加ERK公司当NGF公司‐和表皮生长因子在30′后的时间点比较处理过的细胞。

为了量化细胞异质性，我们汇集了上述所有高剂量和低剂量、EGF和NGF触发的ERK激活轨迹（图1E–H），并使用k‐means聚类提取5个代表性的时间激活模式（图2A） ●●●●。然后，我们根据不同的GF剂量确定了它们的发病率（图2B和C），发现EGF有利于适应性反应，而NGF导致大量持续ERK活动轨迹。我们还观察到随着EGF和NGF剂量的增加，出现了超敏和开关样ERK反应。第1个标准峰值振幅饱和，在1 ng/ml EGF和2 ng/ml NGF的阈值浓度以上保持不变（图第2版A和B）。浓度较低、异质性较低1标准观察ERK活性峰值振幅。一个引人注目的观察结果是，不同的代表性ERK活动轨迹显示出不同的1标准ERK活性峰值振幅与产生低或高1的瞬态或持续反应细胞的能力相关标准峰值振幅分别产生瞬态或持续响应（图2A–D）。为了进一步量化这种现象，我们关联了1标准长期40′ERK活性的峰值振幅（表示短暂或持续的ERK活性）。观察到NGF高剂量和低剂量之间存在稳健的相关性，表明高1标准ERK峰值振幅导致持续反应(附录图S2). 高剂量和低剂量EGF的相关性不显著。另一个有趣的观察结果是，与高EGF剂量相比，低EGF剂量显著改变了ERK活性轨迹的分布，使其更加持久（图2A–C）。重要的是，在计算总体平均值时，ERK活性分布的这种细微变化并不明显（图1G） ，说明了我们的聚类方法对分析单细胞轨迹数据集的价值。总之，这些结果表明，GF刺激产生异质性ERK活性反应，两种GF都能在人群的不同细胞中诱导短暂和持续的反应。这很可能是由于不同细胞内EGF触发的负反馈和NGF触发的正反馈的强度不同所致。对于NGF，持续ERK激活反应的存在与否可能取决于正反馈的强度（Ferrell&Machleder，1998)，这与1标准峰值与持续反应的建立相关。然而，持续的反应也可能是由于持续的GF暴露导致通过负反馈和持续的信号输入缺乏适应。

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量化ERK公司活动轨迹异质性

  1. 所有持续的轨迹GF公司刺激性实验(n个=307个单元格，相同ERK公司激活轨迹如图所示1)使用k‐means聚类和平方欧几里德距离确定了五个具有代表性的轨迹。原始（按簇进行颜色编码）和簇代表轨迹（黑色）。
  2. 重叠集群代表轨迹。
  3. 代表性人口分布ERK公司针对不同情况的活动轨迹GF公司剂量。数据代表n个=3个实验。
  4. 每个集群的峰值排放比强度。带中位数、四分位数（方框）和1.5的方框图IQR公司显示了（胡须）范围和原始数据集。箱线槽延伸1.58IQR公司/√否光突发事件为比较中值提供了大约95%的置信区间。

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门槛GF公司稳健所需的浓度ERK公司激活

ERK公司在微流体装置中评估了不同温度下的活化动力学表皮生长因子和NGF公司浓度对持续GF公司刺激。

  1. 代表ERK公司针对不同情况的活动轨迹GF公司剂量(n个 = 20).
  2. 单元格平均分布急诊室6′时为s（最大值为1标准 ERK公司活性峰值），或60′后GF公司刺激（长期ERK公司活动）。带中间值、四分位间（方框）和1.5的开槽箱线图IQR公司（胡须）范围至少显示为n个=30个细胞。注意ERK公司活动适应表皮生长因子与持续ERK公司的活动NGF公司在60′时间点。

脉冲GF刺激揭示了MAPK网络的新特征

因为连续信号输入不能有效探测MAPK网络以产生自适应或双稳态响应（Kholodenko等,2010; Avraham&Yarden，2011)，我们使用我们的微流体装置应用了单个GF脉冲。高剂量、3′和10′EGF或3′NGF脉冲诱发ERK活性的强健峰值，并立即适应（图三A和B，以及视频EV2). 相比之下，10′NGF脉冲在细胞亚群中诱导了持续的ERK活性，可能表明存在双稳态（Xiong和Ferrell，2003)而剩下的细胞则表现出短暂的反应（图三B） ●●●●。对于持续的NGF刺激，细胞轨迹聚类再次表明第一峰值振幅与产生持续反应的能力之间存在相关性(附录图S3). 低剂量、3′和10′、EGF和NGF单脉冲均导致适应性反应（图三C和D）。所有GF脉冲，以及持续的GF刺激，均诱发1标准ERK活性峰值，在不同剂量下具有相似的振幅分布，表明开关样反应（图三E和F）。与持续GF刺激形成鲜明对比的是，脉冲GF刺激观察到了群体均匀、快速的脱敏动力学，但NGF触发双稳态行为的细胞和条件除外（图三E和G）。这些结果表明，EGF仅诱导自适应输出，而NGF可以根据输入强度/持续时间产生自适应和双稳态输出。

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ERK公司活动对单个GF公司脉冲

  • A–D
    单个GF公司脉冲实验。单元格平均值急诊室s、 人口平均值和标准偏差范围n个=10个单元格。黑色条指示脉冲应用。3′（A，C）和10′（B，D）脉冲。高（A，B）和低（C，D）GF公司浓度。
  • E类
    测量振幅和持续时间1的原理标准 ERK公司放射性峰值响应GF公司刺激。峰值振幅测量为急诊室更改自GF公司刺激开始直到最高点ERK公司适应发生前的活动。峰值持续时间估计为上升阶段达到峰值一半最大值之前的第一点和下降阶段达到峰值半最大值之后的第一点之间的时间。
  • F类
    振幅为1标准 ERK公司不同持续或脉冲响应的活性峰值GF公司刺激实验。1的开槽箱线图标准 ERK公司中位数、四分位范围（方框）和数据在1.5以内的活动峰值振幅IQR公司显示了下四分位数和上四分位数（晶须）的范围(n个=每次实验20个细胞）。
  • 克
    持续时间1标准 ERK公司持续和脉冲响应的活性峰值GF公司刺激。1的箱线图标准 ERK公司中位数、四分位范围（方框）和数据在1.5以内的活动峰值持续时间IQR公司显示了下四分位数和上四分位数（晶须）的范围(n个=每次实验20个细胞）。

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为了探索适应发生的时间尺度，我们通过一个延迟的、2第3′EGF或NGF脉冲，其只能诱导适应性ERK活性瞬变。当ERK活性仍然达到峰值时，延迟3′后再触发并不影响ERK激活动力学（图4A） ●●●●。当ERK活性已经显示出明显的脱敏时，在10′延迟后再次触发，导致2第低振幅ERK活性峰值（图4B） ●●●●。当发生自适应时，在20′延迟后重新触发，启用2第振幅与1相似的活动峰值标准一个（图4C） ●●●●。因此，对于EGF和NGF，MAPK网络结构使ERK在适应发生之前无法再激活。

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ERK公司多项活动响应GF公司脉冲

  • A–C
    双脉冲GF公司实验。（A） 3英尺玻璃纤维/3′暂停/3′GF公司.（B）3′GF公司/10′暂停/3′GF公司.（C）3′GF公司/20′暂停/3′GF公司.单元格平均值急诊室s、 人口平均值和标准偏差范围n个=10个单元格。
  • D–G型
    多脉冲GF公司实验。人口平均数急诊室秒(n个=至少30个单元格）表皮生长因子/NGF公司剂量。（D） 3英尺GF公司/3英尺暂停。（E） 3英尺GF公司/10′暂停。（F） 3英尺GF公司/暂停20分钟。（G） 3英尺GF公司/暂停60分钟。
  • 小时
    衰变动力学ERK公司活性最大值来自（D–G）。带中位数、四分位间距（方框）和1.5的方框图IQR公司（胡须）范围至少显示为n个=30个单元格。

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除了对以分钟为时间尺度运行的上游组件的反馈回路外，ERK还诱导双特异性磷酸酶（DUSP）的表达，其在小时为时间尺度上负调控ERK（Patterson等,2009). 持续刺激GF后5小时ERK活性轨迹的评估显示，无论是高剂量还是低剂量，ERK对EGF和NGF的适应都呈现出全球长期趋势(附录图S4). 这些ERK反应固有的异质性使得很难辨别在小时尺度上运行的任何监管模式。因此，我们推断可重复的GF脉冲可以在细胞群体中均匀触发多个ERK活性瞬变，因为不应期有效地降低了噪声。因此，这种脉冲输入可以为长期、小时级反馈回路提供可靠的读数。因此，我们评估了不同暂停时间和GF剂量的3′GF多脉冲状态（图4D–G，单细胞轨迹如所示附录图S5和视频EV3). 高剂量EGF，3′GF/3′暂停多脉冲方案导致强大的单个ERK激活峰迅速消退，而相同的NGF脉冲方案显示ERK脱敏减弱（图4D） ●●●●。3′/10′和3′/20′状态触发了分辨率良好的ERK活性瞬变，其振幅随时间而减小，EGF的幅度大于NGF（图4E和F，以及视频EV4). 低剂量组与高剂量组的脱敏率较低，而高剂量组和低剂量组的差异要小得多（图三D–F）。3′/60′方案没有导致明显的长期ERK活性脱敏（图三G） ●●●●。图三H量化了ERK活性最大值的小时尺度衰减。这些结果清楚地确定了依赖于GF浓度和特性的明显小时负反馈，并且使用持续GF刺激无法区分。

MAPK网络结构建模

MAPK信号对持续GF刺激的动态响应已在文献中广泛建模（Kholodenko，2000,2006; 桑托斯等,2007; 冯·克里格希姆等,2009; 科洛登科等,2010; Nakakuki公司等,2010). 我们使用单个活细胞中的GF脉冲对ERK信号进行动态探测，提供了一个独特的机会，可以更详细地校准模型，并研究通过标准人口平均测量无法获得的时间尺度上的动力学。这使我们能够通过结合新的反馈和串扰结构来完善已建立的模型，这些结构是解释实验中确定的显著特征所必需的（图5A） ●●●●。我们的核心模型包括经典的Raf/MEK/ERK级联，ERK向Raf发出的短期（以分钟为时间尺度）负反馈作用于EGF和NGF刺激，以及ERK仅在NGF刺激期间向Raf提供的短期正反馈（Santos等,2007). 通过DUSP的表达，通过去磷酸化使ERK失活的额外负反馈作用以小时为时间尺度（Nakakuki等,2010; 费等,2012)（图5A） ●●●●。

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持续和脉冲的确定性和半确定性建模GF公司刺激

  • A类
    模型拓扑方案。星号表示活性蛋白质。蓝色/红色表示接线响应表皮生长因子/NGF公司刺激。&：反馈回路集成，o:合成和降解，非金融机构/PFB公司：蛋白质介导负/正反馈。
  • B类
    持续和3′脉冲的确定性建模GF公司刺激。标准化、平均化急诊室轨迹来自EKAR公司2G（2G）ERK公司带有平均值（点）和StDev（误差条）的活动测量值显示为红色。模拟ERK公司活动(ERK公司*)曲线以蓝色显示。黑线表示GF公司刺激输入。使用单个参数集模拟模型(附录表1). 持续和3′脉冲GF刺激ERK活性轨迹分别来自图2、图3A和图C。
  • C、 D类
    通过根据（C）中所示的对数正态分布随机分布所有激酶、反馈蛋白和磷酸酶浓度的参数值，对细胞集合进行建模。每个单个单元格的特征是参数值略有不同，如（D）所示，其中每列对应一个单元格。
  • E、 F类
    集成建模ERK公司3′/10′脉冲或持续、高剂量和低剂量下的活化动力学GF公司刺激。一个常微分方程(ODE公司)模型运行了1000次，总信号成分浓度从（C）所示的对数正态分布中提取。（E）表皮生长因子，（F）NGF公司.

核心模型的两个扩展对于解释脉冲实验揭示的显著特征至关重要。首先，在3′/3′、3′/10′和3′/20′多脉冲EGF方案中，我们观察到，即使在1标准ERK活动峰值振幅相同（例如，1标准20′）（图4D–G）。众所周知，ERK对EGF的脱敏反应是由负反馈回路的激活引起的（Santos等,2007; 弗里切·冈瑟等,2011; 费等,2012). 然而，事实是标准ERK活性峰值对不同EGF剂量的响应是相同的，这意味着单靠负反馈不能解释观察到的长期差异——完全依赖ERK的纯反馈机制将被激活到相同的量。因此，我们明确引入了一个额外的前馈成分NFB，其激活依赖于活性ERK和受体活性（图5A） ●●●●。其次，我们观察到高剂量10′NGF脉冲在细胞亚群中引发持续的ERK活性，表明存在双稳态（图三B、，附录图S3). 相反，高剂量和低剂量3′NGF和低剂量10′NGF单脉冲仅在整个细胞群中诱导短暂的适应性ERK活性曲线（图三A–D）。考虑到所有脉冲NGF刺激条件导致相同的1标准ERK活性峰值意味着存在（i）NGF诱发的正反馈激活稍有延迟，（ii）ERK‐Raf正反馈强度的额外调节，这可以解释适应性或持续性ERK激活的诱导。在模型中，我们通过在观察到的时间尺度上包含正反馈成分PFB和动力学来解释延迟，并使该成分的激活依赖于受体活性（图5A） ●●●●。请注意，轻微的延迟是由该反馈组件的激活隐式引起的，这需要时间，而不是通过引入显式延迟方程。模型的所有反应和方程式的详细说明见附录表S1.

根据实验数据对模型模拟进行基准测试

为了验证我们的模型，我们根据实验数据对模拟的GF诱发ERK活动输出进行了基准测试。使用具有固定参数集的纯确定性方法，我们的模型捕获了测量的ERK活动轨迹对持续和3′脉冲EGF和NGF刺激的平均行为（图5B） ●●●●。然而，与持续的GF刺激相比，在3′脉冲情况下，模拟更符合实验人群的平均值。原因是持续刺激会导致高度异质的细胞反应，而确定性模型无法解释。相比之下，3′GF脉冲引起的细胞反应更均匀，因此更好地用群体平均值表示。

为了考虑细胞的异质性，我们进行了基于相同确定性方程的半确定性建模，但用信号成分的总蛋白浓度模拟单个细胞时，信号成分的总体蛋白浓度是从对数正态分布中随机选择的，该分布与整个细胞群的蛋白质丰度分布相对应（图5C和D）。具体而言，我们试图解释在细胞亚群中出现的对10′高剂量NGF脉冲响应的持续ERK激活，与在所有其他EGF/NGF脉冲刺激条件下观察到的群体均匀的瞬态反应相比（图三A–D）。模拟集成模型模拟了所有测试的单个EGF和NGF脉冲条件下的实验数据（图5E和F）。在10′NGF脉冲的情况下，模拟ERK活动轨迹的k均值聚类表明，初始ERK峰值活动幅度与持续ERK活动响应之间存在相关性(附录图S6)，它概括了我们的实验数据(附录图S3). 相反，低初始ERK峰值活动幅度导致适应。这表明，人群中信号成分表达水平的差异可能会导致一些细胞显示出较高的初始ERK峰值活性，从而产生足够强的正反馈，从而诱导双稳态ERK激活（Ferrell&Machleder，1998; 桑托斯等,2007). 然而，该系统无法随着时间保持双稳态，这可以通过缓慢作用的DUSP催化的ERK去磷酸化来解释。从模型中去除ERK诱导的DUSP表达可实现稳健的双稳态ERK激活。综上所述，这些结果表明，根据人群中不同细胞内信号成分丰度的异质性，该网络能够诱导适应性和持续性ERK活性输出，以响应瞬态NGF刺激。我们还使用半确定性建模对持续GF刺激进行了建模，并发现我们的模型捕捉到了实验数据集的几个方面（图5E和F）。该模型捕捉到在低浓度与高浓度EGF刺激的细胞中出现了更持续的ERK活性轨迹，这是通过调节受体活性的负反馈而产生的（比较图5E和图中的实验值2B） ●●●●。这些结果再次表明，信号成分丰度的异质性导致种群中出现不同的细胞行为。

为了确认我们提出的模型结构不包含不必要的调控元素，我们根据实验数据对替代模型结构的模拟进行了基准测试。消除前馈串扰的模型无法解释低剂量和高剂量NGF、10′脉冲刺激之间的差异（图电动汽车3A和B）。通过使Raf激活直接依赖于激活的ERK来消除负反馈分量引入的延迟和前馈串扰的模型不能解释3′和10′脉冲刺激之间的差异（图电动汽车3C和D）。

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脉冲的半确定性建模GF公司使用替代模型进行刺激

3′或10′的集成建模表皮生长因子和NGF公司对不同模型的脉冲进行了测试。一个常微分方程(ODE公司)模型运行了1000次，总信号成分浓度取自图中所示的对数正态分布5C.模型参数与完整模型中的参数相同。

  1. 无接收器串扰的模型变体方案。
  2. 模拟ERK公司*响应指示的轨迹NGF公司根据（A）中所示的变量模型的刺激方案。
  3. 无延迟和无接收器串扰的模型变体方案。
  4. 模拟ERK公司*响应指示的轨迹NGF公司根据（C）中所示的变量模型的刺激方案。

然后，我们使用确定性建模，根据GF多脉冲实验数据集对我们的模型进行基准测试，在这些数据集中，均匀的细胞响应忠实地反映在总体平均值中。一致地，根据人口平均时间过程校准的确定性模型复制了多脉冲实验（图6A） ●●●●。这捕获了实验上观察到的对不同GFs和剂量的不同小时尺度ERK活性振幅衰减（图4D–G），这可以通过ERK诱导的DUSP磷酸酶的表达来解释，产生缓慢的负反馈去磷酸化ERK。为了进一步测试DUSP模块的相关性，我们将其从网络中删除，并观察到长期适应性行为的丧失（图电动汽车4A和B）。观察到，3′/3′、3′/10′和3′/20′EGF多脉冲机制导致高剂量与低剂量EGF下ERK活性振幅的强烈衰减，这是由于受体活性调节负反馈强度所致。一贯地，去除这种相互作用的模型无法解释在高剂量与低剂量EGF作用下观察到的ERK活性峰值振幅的降低（图电动汽车4C和D）。特别是，该模型中解释力的损失无法通过改变负反馈参数的值来恢复。

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多脉冲建模GF公司刺激

  1. 多脉冲响应的确定性建模表皮生长因子/NGF公司不同剂量的刺激。
  2. 的积分ERK公司根据ODE公司模型持续时间为60′，90′后GF公司刺激。白点表示评估细胞分化的条件。

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多脉冲感应的确定性建模ERK公司使用替代模型的活化动力学

  1. 模型变体的方案，其中DUSP（DUSP）模块已删除。
  2. 模拟ERK公司*显示完整模型（对照，绿色）与缺少模型的比较的轨迹DUSP（DUSP）感应（否DUSP（DUSP），蓝色）。高（左面板）和低（右面板）的结果表皮生长因子显示了剂量。行对应不同的刺激模式：持续GF公司刺激、3′/3′、3′/10′、3’/20′和3′/60′多脉冲。模型中观察到的长期衰减要低得多，其中DUSP（DUSP）在多脉冲实验中移除了模块。有无模型参数DUSP（DUSP）归纳法与完整模型中的归纳法相同。
  3. 模型变量的方案，其中前馈串扰ERK公司‐拉夫负反馈回路已移除。
  4. 模拟ERK公司*轨迹。行对应不同的刺激模式：持续GF公司刺激、3′/3′、3′/10′、3’/20′和3′/60′多脉冲。未观察到剂量依赖性差异。列对应于负反馈强度的不同参数值，表明该结果是稳健的。除k3_F外，所有参数均与完整模型中的相同。

我们还探讨了EGF受体内化和降解的潜在参与因素（Avraham和Yarden，2011)，以测试该过程是否与多脉冲实验中高剂量与低剂量EGF所观察到的长期脱敏有关。因此，我们消除了与负反馈的受体串扰，并使用一系列降解参数速率（图第5版). 我们发现，在多脉冲实验中，阻断内化或改变内化/降解速率会影响ERK激活动力学，但与EGF剂量无关。因此，EGF受体的内化/降解不能解释我们在实验中观察到的ERK活性反应。

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多脉冲感应的确定性建模ERK公司使用替代模型的激活动力学-以受体内部化和降解为特征的模型变体，而不是对负反馈的前馈循环

  1. 替代模型的方案。合成并降解受体，半衰期为8小时。通过绑定激活后表皮生长因子，受体内化（0.22分钟−1)并且再循环（反向速率是正向速率的20%）。内化受体的降解速度比非内化受体快得多（表示为T型 1/2). 所有参数，除了T型 1/2,与完整模型中的相同。
  2. 总受体水平的模拟变化R（右） 全部的 = R（右） + R（右）*+R（右） 我*响应持续的刺激表皮生长因子对于内化受体半衰期的不同参数值T型 1/2.
  3. 模拟ERK公司*轨迹对不同刺激模式的反应。从上到下：持续GF公司刺激、3′/3′、3′/10′、3’/20′和3′/60′多脉冲。未观察到明显的剂量依赖性差异。列对应于内化受体半衰期的不同参数值T型 1/2，证明该结果是稳健的。

最后，由于受体活性依赖性的前馈成分调节正反馈的强度（图5A） 解释对单个NGF脉冲响应的异质、自适应或双稳态ERK激活响应非常重要（图5C–F），以及NGF多脉冲数据集（图6A） ，我们对此进行了更详细的分析。更具体地说，我们探索了不同的模式，即线性依赖性与山形动力学，以模拟这种前馈组件的强度(附录注释1). 我们观察到，这些不同的建模模式并不影响模型模拟ERK活动轨迹的输出，以响应单个3′和10′高剂量和低剂量NGF脉冲以及我们的多脉冲数据集(附录图S7). 总之，我们的综合实验/建模方法强烈支持我们模型的拟议结构。

脉冲GF刺激对细胞命运的重塑

随着时间的推移，综合ERK活动，ERK整数与不同细胞系统中的细胞命运决定相关（墨菲等,2002; 桑托斯等,2007; 阿尔伯克等,2013; 青木等,2013). 我们推断，合成的GF多脉冲机制可能精确地控制ERK信号的持续时间，并最终控制分化命运。使用我们的模型，我们预测了优化ERK的时间GF脉冲/暂停状态整数标高（图6B） 发现不同的GF脉冲状态导致不同的ERK整数水平。长期EKAR2G成像导致光毒性，阻碍分化，排除直接ERK整数/单细胞水平的分化相关性。因此，我们将细胞置于不同的脉冲状态下13 h，然后在无GF的培养基中再增加24 h，并量化稳定状态下的神经突起生长，作为分化的测量（图7A和B）使用自动神经突起/体细胞分割算法(附录图S8A). 还显示了此数据集的统计分析(附录图S8B). 正如预期的那样，持续的EGF和NGF刺激分别导致未分化和分化状态。与持续NGF刺激相比，3′/3′、3′/10′和3′/20′高NGF剂量多脉冲方案导致分化显著增加，而3′/60′方案根本不会导致分化。虽然在轴突长度（以及分化率）方面不如NGF强大，但我们发现3′/10′和3′/20′，而不是3′/3′或3′/60′，高剂量和低剂量EGF多脉冲体制诱导了一种强大的分化状态。然而，无论是持续应用低NGF还是3′/10′低NGF多脉冲方案，都没有导致强有力的分化，尽管这些刺激方案会导致类似的ERK整数水平高于高NGF剂量。这表明，需要高剂量的NGF才能触发对神经元分化和/或存活至关重要的其他信号通路。我们的实验表明，除了低NGF浓度外，模型预测ERK整数使用特定频率的合成EGF或NGF多脉冲体制进行优化，可实现稳健微分。在EGF的情况下，这种频率调制的合成多脉冲体制因此将增殖转化为分化信号，并允许独立于GF身份控制细胞命运。通过合成的多脉冲体系维持持续的ERK活性最有可能通过磷酸化实现IEG产品的稳定，从而指示分化命运（墨菲等,2002; Nakakuki公司等,2010). IEG mRNAs和蛋白质的寿命极短，可以解释60′间隔的适应性ERK活性瞬变刺激导致的任何分化丧失（Murphy等,2002; Avraham&Yarden，2011).

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操纵ERK公司激活动力学改变细胞命运

  • A类
    微管蛋白染色的代表性显微照片个人计算机‐12NS公司‐1个持续多脉冲刺激的亚克隆细胞GF公司制度。比例尺=20μm。
  • B、 C类
    神经元分化命运的量化。（B） 每个细胞的神经突起总生长量归一化为细胞体长轴长度，用于持续和多脉冲GF公司制度。（C） 分化率计算为每个细胞具有标准化的总突起生长的细胞的分数大于1。每种情况下，至少在2个独立实验中量化了5000个细胞。显示了带有中间值、四分位间（方框）和1.5 IQR（晶须）的方框图。

讨论

我们表明，当分析群体中的单个细胞时，经典研究的EGF触发的瞬态和NGF触发的持续ERK激活动力学是高度异质的。因此，我们的单细胞测量方法基于细胞群平均值（Marshall，1995; 桑托斯等,2007; 冯·克里格希姆等,2009; 小腿等,2009; Nakakuki公司等,2010). 持续生长因子应用中遇到的重要问题是，异质ERK活动动力学响应排除了确定性建模的使用，并且不允许我们正确评估MAPK网络特性，如适应性和双稳态。通过应用脉冲生长因子输入动态探测MAPK信号通量解决了这两个问题。这使我们能够揭示MAPK网络拓扑的新特性，该拓扑由不同时间尺度的反馈和前馈回路组成。

我们的研究清楚地表明了前馈网络的存在，受体活性通过前馈网络调节正反馈和负反馈回路的强度来微调ERK活性。这与最近的一份报告一致，其中EGF触发的ERK动力学调节细胞周期进入，除了在核心Ras‐Raf‐MEK‐ERK级联（Sparta等,2015). 影响ERK到Raf的正反馈回路的最可能的候选前馈机制涉及蛋白激酶C（Santos等,2007)和PLCγ（von Kriegsheim等,2009). 对于负反馈回路，候选包括Raf在抑制位点的磷酸化和尚未鉴定的激酶的作用（综述于（Matallanas等,2011))或AKT介导的PEA‐15–ERK复合物的破坏，这是NGF分化计划的一部分（von Kriegsheim等,2009). 关于后者，PEA‐15复合物的释放将缓解竞争性抑制，并允许ERK磷酸化几个上游负反馈位点。此外，最近对适配器Shc1（Zheng）的动态、EGF触发的相互作用组的蛋白质组学分析等,2013)发现了一种暂时调节的Shc AKT反馈磷酸化，该磷酸化激活酪氨酸磷酸酶Ptpn12，最终导致EGF受体去磷酸化、Grb2解离和信号终止。所有这些可能性都为将受体活性的强度转化为负反馈和正反馈的调节提供了有吸引力的手段，今后必须进行系统研究。

我们研究的一个重要发现是，EGF只能导致适应性ERK激活（在没有连续信号输入的情况下），而NGF可以根据生长因子输入强度/持续时间和种群信号异质性生成自适应和双稳态输出。如我们的建模研究所示，后一个特征可能来自信号成分的随机表达水平。如前所述（陈等,2012)，这可能会使MAPK网络在应对NGF时保持细胞命运的稳态平衡，防止过度增殖或分化，这将对多细胞生物有害。

我们还发现，多次重新触发MAPK网络，同时将其保持在自适应状态，使整个细胞群的信号状态均匀化。事实证明，这对于揭示在小时尺度上发生的反馈信号机制至关重要，而在对持续生长因子刺激的异质性细胞反应中，很难识别这种机制。基于我们增强的MAPK信号网络模型，在没有任何药物或基因扰动的情况下，通过在特定频率传递GF脉冲机制来优化整合ERK活性，从而有效地重新连接独立于GF身份的细胞命运决定。因此，以所需频率传递EGF脉冲以优化整合ERK活性的刺激导致分化而非增殖。这可能有许多生物技术应用。然而，我们还发现，在某些情况下，导致相同整合ERK活性的GF脉冲方案不一定导致相同水平的分化（图7，高剂量与低剂量NGF）。毫不奇怪，这表明依赖GF，比ERK更多的信号网络对细胞命运的决定很重要。

我们预计，我们的脉冲生长因子刺激策略将是识别MAPK网络中精确分子电路的有力工具，该策略允许我们绕过细胞异质性，探测特定网络属性，并识别在不同时间尺度运行的反馈回路，当与摄动方法结合时。

材料和方法

细胞培养和稳定细胞系的产生

PC-12（美国组织培养收集）及其Neuroscreen‐1亚克隆（Tobias Meyer的馈赠）细胞在补充了10%马血清、5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM（德国西格玛）中培养。使用基于聚合酶链反应的试剂盒对细胞进行支原体污染检测。细胞培养在50μg/ml牛皮胶原蛋白溶液上（德国西格玛）。为此，在细胞接种前，在室温下对组织培养皿（BD falcon，USA）进行胶原包被30分钟。在70%的汇合处，用细胞刮板轻轻分离细胞并传代。由于其聚集倾向降低，Neuroscreen‐1细胞被用于分析细胞命运的实验。这大大促进了神经突起生长分析。

为了稳定的细胞系生成，我们制备了表达ERK活性生物传感器EKAR2G1（Fritz等,2013). 简而言之，用慢病毒和包装构建物转染HEK293 FT细胞（Invitrogen）。然后使用Lenti-X浓缩试剂盒（Clontech）收集上清液并进行浓缩。感染PC‐12细胞并用0.5μg/ml嘌呤霉素筛选，直到出现稳定的细胞群。随后在0.5μg/ml嘌呤霉素的存在下培养细胞，在成像实验之前去除嘌呤菌素。PC‐12/EKAR2G细胞用于ERK激活动力学成像。

微流体装置的构造和处理

我们使用之前描述的微流控电路的改进版本将趋化因子梯度应用于细胞（Lee等,2012). 对微流控电路结构的轻微修改使我们能够传输GF脉冲。微流控硅主控芯片是从具有SU‐8微结构的硅片上复制的。硅母模由两层40微米和100微米厚的光刻胶组成。首先，用SU‐8 100（Microchem，USA）负厚光刻胶旋涂等离子体处理的硅片，直到达到40μm的高度。在65℃烘烤5′和95℃烘烤20′后，将晶圆暴露于405 nm紫外光下（韩国Shinu MST），剂量为250 mJ，并用负膜掩模遮蔽（韩国Han&All Tech）。在此之后1标准曝光一轮后，将晶圆再次在65°C下烘焙1′，并在95°C下再次烘焙10′。然后使用SU‐8显影剂（美国Microchem）去除光刻胶的未曝光部分。用于沉积2第光刻胶层，使用晶圆第一层上的对准图案正确定位第二主控的薄膜掩模。然后对第二层的光刻胶进行旋涂，直到达到100微米的厚度。将晶圆在65℃下烘焙10′，95℃下烘焙30′，并暴露于500 mJ 405 nm紫外光下。在65°C下最后烘焙1′和95°C下烘焙10′后，将晶圆浸入显影剂中，并烘焙以蒸发顶部的残留溶剂。

使用聚二甲基硅烷（PDMS）复制母体。将前体（Sylgard 184，道康宁）以10:1的比例混合，并在真空室中脱气5分钟。然后将约7 g前体倒入母体顶部，并在80°C的干燥炉中固化30′。然后使用前体将来自8孔板条（美国Evergreen sci）的塑料储液罐粘在微流体装置的顶部。这些储液罐含有介质和生长因子，允许我们将微流体设备连接到ONIX压力泵（Millipore）。另外添加一层30 g前体以密封塑料储液罐。如图所示1C、 对PDMS复制品进行切割和穿孔。使用等离子处理将PDMS复制品粘合到盖玻片上（日本Tasumi），以实现适当密封，从而抵抗实验期间施加的高压。为了提高粘合强度，将设备在80°C的干燥箱中加热5分钟。粘合后，设备立即填充PBS。

使用50μg/ml胶原蛋白在4°C下过夜对微流体装置进行涂层。细胞接种前，用PBS冲洗设备。以2×10的浓度制备PC12/EKAR2G或NS‐1细胞悬浮液6细胞/ml。在出口中加入50μl这种细胞悬浮液，并用移液管从细胞库入口抽吸（图1C） ●●●●。30′孵育后，抽吸去除出口残留细胞，更换培养基。先前的实验中，细胞在含有1000 mg/ml葡萄糖、1%马血清和青霉素/链霉素的DMEM中饥饿。请注意，在整个活细胞实验中，流量是恒定的。这意味着剪切应力适应后，GF诱导的信号反应可以可靠地测量。此外，可以应用的最小GF脉冲时间有一个限制。稳定持续时间小于60秒的脉冲需要一定的流量，从而导致细胞分离。

活细胞成像

所有FRET比值成像实验均在外荧光Eclipse Ti倒置荧光显微镜（Nikon）上进行，其平面Apo air 20×（NA 0.75）物镜由Metamorph软件（Molecular Devices）控制。在整个实验中都使用了基于激光的自动对焦。使用Hamamatsu Orca R2相机在16位深度下进行图像采集。供体、FRET和红通道图像（显示显示GF暴露的Alexa546‐右旋糖酐）是使用滤光片轮依次采集的。采用以下激发、二向色镜和发射滤光片（Chroma）：施主通道：430/24×，Q465LP，480/40 m；FRET通道：430/24×，Q465LP，535/30 m；和mCherry通道：ET572/35、89006bs、632/60 m（用于右旋糖酐成像）。在整个实验过程中使用了标准的曝光设置。440‐nm（供体和FRET通道激发）和565‐nm（红色葡聚糖）LED灯用作光源（Lumencor Spectra X光引擎），灯功率分别为1.1%（440 nm）和1.5%（565 nm）。在binning 2×2时，供体通道的采集时间为300ms，FRET的采集时间是300ms。细胞在DMEM中用1000 mg/ml葡萄糖、1%马血清和青霉素/链霉素在37°C下成像。微流体装置安装在显微镜工作台上，并通过管道连接至ONIX泵。

FRET比率图像分析

结合ImageJ和Metamorph对EKAR2G生物传感器产生的FRET比值图像进行分析。供体和FRET图像是逐个图像减去背景的图像。FRET除以供体通道，再乘以1000，使用imageJ“calculator plus”插件生成16位比率的图像。然后将叠加比率图像传输到变形。然后根据时间平均堆栈对每个单元格进行分段，该堆栈为每个单元格的单元格移动提供了“足迹掩码”，并为每个单独的单元格创建了堆栈。细胞聚集体被手动分割并丢弃。使用ImageJ测量每个细胞通过时间的平均比率，并保存在文本文件中。由于每个实验都需要2小时的初始期来稳定细胞至剪切应力，因此我们将流量开启后约80′的5个时间点的平均强度设置为基础水平ERK激活以进行归一化。对Alexa546‐右旋糖酐通道进行堆叠和剖面分析，以验证微流体装置细胞室中暂时定义的生长因子暴露的准确性。

NS‐1分化实验

在微流控设备中进行分化实验之前，细胞需要饥饿6小时。然后将约200μl含GF的培养基添加到其中一个输入贮存器中（图1C） ●●●●。为了防止蒸发，使用粘性塑料密封电池入口。微流体装置通过注射器接头连接至ONIX压力泵（美国密理博）。分化实验在带有连接端口（Galaxy、Eppendorf）的台式小型培养箱中进行。输出阀压力稳定在1.5 psi，并运行不同的恒定或脉动协议。每个方案都包括在饥饿介质中流动2小时的适应时间，然后是13小时的持续或脉动GF暴露，这是通过改变计算机控制压力阀的开启顺序来确定的。由于可独立控制的阀门数量有限，我们将四通管道连接到每个阀门，以实现最大吞吐量。这种策略使我们能够使用嵌入泵中的8个阀门在4个不同的微流体设备中进行处理，最终能够同时进行16个实验。单个微流体的每个腔室为给定的刺激模式提供独立的结果。每个实验都包括一个阴性（无GF）和一个阳性对照（持续刺激GF）。在13小时GF刺激期后，断开设备，并在饥饿培养基中的培养箱中再培养24小时。

然后用PBS、4%多聚甲醛（固定液）固定细胞。为了接近微流控装置中的细胞，将50μl固定液滴在细胞入口的顶部，诱导流动通过细胞室。15′后，用PBS、0.1%Triton X‐100渗透细胞30′，并用PBS和2%BSA在PBS中封闭细胞15′。然后将细胞与抗α-微管蛋白（Sigma T9026，1:1000）抗体孵育6 h，洗涤30′，并与Alexa‐546抗小鼠二级抗体（1:1000）和DAPI孵育3 h。样品用PBS清洗30′。使用Metamorph“扫描玻片采集”模块对每个微流体通道的整个表面扫描并缝合DAPI和Alexa‐546图像。采用相同的免疫荧光和成像方案进行磷酸化ERK（1:1000，Sigma M8159）和ERK2（1:1000、Sigma M 7927）实验。然后使用Alexa‐488‐和Alexa­561标记的抗体进行二次检测。

使用变形“神经突起生长分析”模块（通用成像）处理分化实验中的Tubulin/DAPI染色图像。观察到细胞密度过高的视野用掩模手动擦除。这使我们能够提取每个细胞的一些指标，例如神经突起生长的总长度和平均长度，以及每个细胞的神经突起数量。然后将每个细胞都包含识别标签的分割图像导出到CellProfiler图像分析软件(http://www.cellprofiler.org/)（卡门茨基等,2011). 这用于计算适合细胞体的椭圆的长轴长度。最终，当神经突起的总生长量大于体细胞的长轴长度时，这被用于计算以细胞被视为已分化细胞为标准的分化细胞的比例。值得一提的是，我们基于计算机视觉的神经突起生长分割方法比用人眼进行经典的“手动”评估要严格得多（von Kriegsheim等,2009). 因此，不可能直接比较这些不同方法之间分化细胞分数的量化。

建模

基于图中的方案5A、 根据常微分方程导出了一个动力学模型。该模型与文献中建立的模型一致（Kholodenko，2000; 冯·克里格希姆等,2009; Nakakuki公司等,2010)，用于汇编本研究中使用的参数值。所有磷酸化和去磷酸化参数的选择都符合我们的实验数据，同时遵循生物学上合理的参数界限。DUSP蛋白和mRNA的半衰期设置为90分钟，这反映了在测量的ERK活性轨迹中观察到的长期衰减，并且在实验报告的7.5分钟到4小时的范围内（Nakakuki等,2010; 贝穆德斯等,2011; 卡格诺尔和里瓦德，2013). 利用内化、降解和再循环参数的实验报告值（Huang等,2006; Sorkin&Duex公司，2010). 该模型在MATLAB中通过数值积分实现和仿真。所有反应、方程式和参数的详细说明见附录表S1.

模拟可能的替代模型结构

由于模型的动态行为取决于其参数值，添加或删除模块通常需要重新调整一些参数值，以适应实验数据（Conzelmann等,2004; 索罗和科洛登科，2004; 德尔维奇奥等,2008; 萨伊斯·罗德里格斯等,2008). 因此，在添加或删除模块时，我们分析了一系列参数（图第5版). 这个过程本身最好用一个例子来解释：消除负反馈中的前馈串扰，同时保持所有参数不变，这意味着反馈的强度发生了变化。现在负反馈被强烈激活，导致只有一个ERK脉冲响应多脉冲EGF刺激（图第5版B、 面板）。很明显，这与我们的实验数据不符，我们必须考虑到负反馈参数的重新调整。将k3从0.0286/min调整到0.0045 min，恢复了低剂量EGF刺激的观察到的反应动力学（图第5版B、 中间的面板），并重新调整到0.001分钟，恢复了EGF高的观察轨迹（图第5版B、 面板）。然而，没有单一的参数调整能够同时解释低和高EGF剂量条件。我们可以得出结论，需要接收器串扰来解释我们的所有数据。"

作者贡献

OP、HR和MC设计实验。HR、MC和YB执行并分析了实验。MD、DF和BNK进行了数据分析和数学建模。SSL和MP提供了微流体装置的初步设计。HR、MC和NLJ设计了第二代微流体装置。OP、MD和DF撰写了论文。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

支持信息

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审查过程文件

图1的源数据

图3的源数据

图4的源数据

致谢

我们感谢Tobias Meyer提供NS‐1细胞系。这项工作得到了对O.P.和N.L.J的人类前沿计划拨款、对N.L.J.的Brain Korea 21 Plus项目、UCD种子基金和爱尔兰科学基金会对M.D.和B.N.K的06/CE/B1129号拨款、对B.N.K的欧盟FP7 PRIMES拨款以及韩国-瑞士战略合作计划的支持（项目参考：2009-00525）向M.P.和N.L.J.拨款，并由欧洲研究理事会向M.P..拨款。

笔记

分子系统生物. (2015)11: 838[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

笔记

另请参见：N Blüthgen公司（2015年11月）

工具书类

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