肝纤维化分子机制研究进展

摘要

介绍

纤维化是一种伤口愈合反应，产生并沉积细胞外基质（ECM）蛋白质，包括胶原纤维，导致组织瘢痕形成[1,2]。肝损伤后通常再生。然而，当肝脏损伤和炎症持续进行时，肝脏无法正常再生并导致纤维化。进行性肝纤维化会导致肝硬化，由于纤维瘢痕和再生结节的形成以及肝血供减少，肝细胞无法正常工作[1,2]。多种病因，如乙型和丙型肝炎感染、慢性酒精滥用、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、胆汁淤积和自身免疫性肝炎，最终发展为肝硬化。虽然去除肝纤维化的病原体会使肝组织瘢痕退缩，但治疗晚期肝硬化是困难的[三]。到目前为止，还没有批准的抗纤维化药物。肝移植是肝硬化唯一的治疗方法。然而，由于供体肝脏数量不足，需要开发有效的抗纤维化药物。肝星状细胞（HSC）是激活的肌成纤维细胞的主要前体，肌成纤维纤维细胞是在肝纤维化过程中产生ECM蛋白的细胞类型。静止的HSC储存含有维生素A的脂滴，HSC被激活后会失去脂滴。转化生长因子（TGF）-β和血小板衍生生长因子（PDGF）是促进HSC活化和增殖的两种主要细胞因子，可激活成肌成纤维细胞[4]。许多其他细胞因子、细胞内信号和转录因子参与了这一过程[4]。控制HSC的激活过程将是治疗肝纤维化的理想策略。因此，理解HSC激活的分子机制至关重要。本文综述了近年来肝纤维化分子机制的研究进展。

活化肌成纤维细胞的起源

虽然人们认为HSC是肌成纤维细胞的主要前体，但其他类型的细胞，如内源性门静脉成纤维细胞和来自经历上皮-间充质转化（EMT）的肝实质细胞的肌成纤维纤维细胞也有助于形成肌成纤维母细胞库[5]。不同来源的细胞对肌成纤维细胞池的贡献可能取决于肝纤维化的不同病因。Iwaisako等人的研究使用表型分析鉴定了两种胶原蛋白生成细胞群：维生素A阳性HSC和维生素A阴性门静脉成纤维细胞，使用胶原蛋白启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠[5]。他们证明肌成纤维细胞主要在肝毒素（四氯化碳[CCl₄])-诱导肝纤维化。在早期胆汁淤积性肝病中，门静脉成纤维细胞是肌成纤维细胞池的主要来源，而在后期胆汁淤滞性损伤中，HSC占主导地位[5]。有趣的是，Asahina及其同事证明间皮细胞的分化有助于肝损伤时的HSC池[6]。在CCl中，间皮细胞具有分化为HSC和肌成纤维细胞的能力₄-诱导性肝损伤，而胆汁淤积性肝损伤仅诱导间皮细胞分化为HSC，而不诱导肌成纤维细胞分化，这表明HSC以外的细胞，如门静脉成纤维细胞，在胆汁淤滞性肝损伤中有助于肌成纤维池[6]。施瓦布及其同事也试图回答同样的问题。他们在卵磷脂视黄醇酰基转移酶（Lrat）启动子的控制下，新生成了Cre转基因小鼠，该酶是维生素A代谢所需的酶，主要在HSC中表达[7]。该研究确定HSC是在更广泛的纤维化（毒性、胆汁淤积和脂肪性肝病）条件下，在所有肝纤维化小鼠模型中转分化为肌成纤维细胞的主要细胞[7]。他们还证明Lrat阳性HSC并非来源于骨髓，在肝脏再生时不会分化为肝细胞和胆管细胞[7]。应该指出的是，对于每一个拟议的肌成纤维细胞前体（即HSC或门静脉成纤维细胞），尚未进行明确的研究用细胞特异性诱导Cre进行基因标记，从而可以在纤维化模型中进行经典的脉冲期实验，跟踪离散细胞群进入激活的肌成纤维细胞群(图1).

在单独的窗口中打开

图1

肝星状细胞的激活和退化。静止的肝星状细胞（HSC）储存含有维生素A的脂滴，并在细胞被激活时失去维生素A。肝上皮损伤，如肝细胞和胆道上皮细胞的死亡，直接或通过免疫细胞释放的细胞因子（包括枯否细胞、骨髓源性单核细胞、Th17细胞和先天性淋巴细胞（ILC））诱导HSC活化。转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-17和肠源性脂多糖（LPS）促进HSC活化。IL-33通过ILC2促进HSC活化。HSC自噬与HSC激活有关。活化的肌成纤维细胞池主要由活化的HSC构成，但胆道损伤可诱导门静脉成纤维细胞分化为活化的肌纤维细胞。然而，没有证据表明构成肌成纤维细胞池的上皮-间充质转变。肝损伤停止后，纤维化开始消退，活化的HSC诱导凋亡或恢复到静止状态。HSC过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的表达与HSC逆转相关。一些活化的HSC衰老，导致p53发挥作用的促纤维化特性丧失。此外，血管生成有助于纤维化的发展和消退

此外，其他几项使用遗传细胞命运定位的研究得出结论，EMT对小鼠的肌成纤维细胞池和肝纤维化没有贡献。这些研究使用Cre-loxP技术（分别为白蛋白-Cre、CK19-Cre和AFP-Cre）标记肝细胞、胆管细胞以及肝细胞和胆管细胞，并在肝纤维化发展过程中追踪这些细胞[8–10]。研究发现，肌成纤维细胞既不是来源于肝细胞，也不是来源于胆管细胞。尽管我们必须意识到，小鼠研究不能概括所有人类疾病，但现有的小鼠研究表明：（1）EMT不会发生；（2） HSC是肝毒性肝纤维化中肌成纤维细胞的主要来源；（3） 在胆汁淤积性肝损伤早期，门静脉成纤维细胞是肌成纤维细胞群的重要组成部分；和（4）间皮细胞在肝损伤时具有分化为HSC和肌成纤维细胞的潜力。

TLR4与肠道微生物组

肝硬化患者血浆和门静脉内毒素（也称为脂多糖[LPS]，革兰氏阴性细菌细胞壁成分）水平升高。由于肝硬化患者存在肠道渗漏、细菌过度生长和生物失调，可以想象，移位的微生物产物和内毒素的内源性传感器TLR4可能有助于肝病的进展[11]。事实上，TLR4、CD14和LPS结合蛋白缺陷的小鼠对酒精性肝病小鼠模型具有抵抗力[12]。同样，TLR4突变小鼠和肠道绝育小鼠也不能发展成肝纤维化[4,13]。值得注意的是，在肝纤维化期间，TLR4突变小鼠的血液LPS水平与WT小鼠相似，表明TLR4主要作用于肝脏[13]。虽然包括Kupffer细胞在内的免疫细胞表达TLR4，但HSC是TLR4介导的肝纤维化的主要细胞(图1) [13]。TLR4刺激的HSC产生多种趋化因子（例如CCL2、CCL3、CXCL2、CXCL10）并表达粘附分子（例如e-selectin、VCAM-1、ICAM-1），促进炎症细胞浸润到肝脏。TLR4信号通路还通过下调BMP和激活素膜结合抑制剂（BAMBI）（TGF-β受体的诱饵受体），促进成纤维反应，从而增强HSC中TGF-？信号通路[13]。在HSC中，核因子（NF）-κBp50:p50和HDAC1转录调节BAMBI的表达[14]。此外，TLR4介导的HSC纤维连接蛋白的产生促进血管生成，促进肝纤维化和门脉高压[15]。TLR4信号通路还通过抑制miR-29的表达调节HSC激活和肝纤维化[16]。重要的是，TLR4单核苷酸多态性与丙型肝炎患者肝纤维化程度相关[17]证明TLR4在人类肝纤维化中的临床相关作用。与在肝脏内发挥作用的TLR4相反，TLR2是革兰氏阳性细菌成分的受体，可以维持肠道屏障功能，防止肝纤维化中的细菌移位。TLR2级^−/−小鼠通过抑制脂多糖向肝脏的转运而减轻了肝纤维化[18]。肝脏疾病的不同病因可能会影响肠道微生物环境。胆管结扎术（BDL）在早期诱导细菌过度生长，但不会改变肠道细菌的组成，而慢性CCl₄只有在肝纤维化发生后，肠道细菌组成才会发生治疗变化[19]。CCl中的营养不良₄-治疗组小鼠表现出增加厚壁菌属和放线菌门[19]。BDL后的定量变化（细菌过度生长）与CCl后的定性变化（失调）之间的差异₄治疗可能是由于肠道胆汁酸减少的直接作用和CCl的次要作用₄-诱导肝毒性。虽然BDL单独使用不会引起生物失调，但高脂饮食（HFD）喂养条件显著改变了肠道细菌的组成（增加了革兰氏阳性菌的比例，降低了两者之间的比例）拟杆菌纲和厚壁菌属)BDL之后[20]。因此，与对照饮食动物相比，喂食HFD的小鼠中胆汁淤积诱导的肝纤维化加重[20]。这项研究进一步从HFD+BDL小鼠中纯化了“纤维生成”革兰氏阴性细菌，并证实这些“纤维形成”细菌显著增强了肝纤维化[20]。HFD喂养还与梭菌属簇XI，将初级胆汁酸代谢为脱氧胆酸（DCA）的细菌[21]。肠源性DCA进一步诱导DNA损伤和活性氧生成，促进肝细胞癌（HCC）的发展[21]。在纤维化相关肝癌发生模型中（DEN+CCl₄)，WT和TLR4突变小鼠的肠道微生物组分相似，表明TLR4在慢性肝损伤期间的肠道失调中不起作用[22]。该研究还证实，非吸收性长期抗生素治疗和无菌条件可抑制纤维瘤相关肝癌的生长[22]。然而，最近一份使用无菌动物研究肝纤维化的报告表明，无菌小鼠更容易受到肝毒素诱导的肝纤维化的影响，这表明肠道中存在预防肝纤维化的有益细菌，此外还有慢性肝病中增加的有害细菌[23]。Dapito等人和Mazagova等人所做研究之间的差异可能是由于毒素暴露的持续时间，或是否接受DEN治疗。还可以考虑研究之间对照动物的不同饲养和鼠舍环境。

炎症细胞因子

最近的研究表明IL-17、IL-22和IL-33在肝纤维化中的重要性(图1). IL-17主要由Th17细胞产生，在乙型和丙型肝炎、酒精性肝病和自身免疫性肝炎中上调[24]。IL-17是一种促炎症和促纤维化细胞因子，可激活枯否细胞和HSC中的NF-κB和STAT3。IL-17刺激的HSC上调胶原α1（I）、α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）和TGF-β水平，促进肝纤维化[25]。IL-17A或IL-17RA缺乏的小鼠对胆汁淤积和毒素诱导的肝纤维化具有抵抗力[25]。有趣的是，内源性大麻素CB2受体信号传导的抗纤维化作用是通过抑制IL-17的产生来介导的[26]。

Th17细胞也产生IL-22。在肝脏中，IL-22R在肝细胞和HSC上表达，但在免疫细胞上不表达。IL-22通过STAT3诱导其生物功能，如细胞增殖、组织修复和伤口愈合反应[27]。肝硬化患者的血液IL-22水平升高，IL-22升高与肝硬化的严重程度、并发症和死亡率相关[28]。虽然IL-22是致癌的[29]IL-22对酒精性肝病、T细胞介导的肝炎模型和对乙酰氨基酚诱导的肝损伤具有保护作用[30–32]。此外，IL-22具有抗纤维化作用，IL-21治疗通过STAT3和p53诱导HSC衰老来抑制肝纤维化[33]。然而，一些研究表明，IL-22具有致病性，并通过乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒转基因小鼠的Th17细胞和肝祖细胞促进肝脏炎症和纤维化[34–36]。虽然IL-22的肝保护作用已被充分证明，但IL-22在乙型肝炎和肝癌中的有害作用也很明显。

肝硬化患者IL-33及其受体ST2水平升高[37]。在CCl暴露诱导的小鼠肝纤维化中，IL-33表达也上调₄和TAA，以及感染曼氏血吸虫[37]。IL-33作为一种危险警报分子从受损的肝细胞中释放出来。IL-33诱导肝固有淋巴细胞II型（ILC2）产生IL-13。IL-13信号转导通过IL-4Rα和STAT6增强HSC中TGF-β信号转导，促进肝纤维化[37]。白介素-33^−/−小鼠、用可溶性ST2治疗的小鼠或用抗Thy1.2抗体去除ILC的小鼠对肝纤维化具有抵抗力[37]。IL-33还通过ILC2和IL-13参与原发性胆汁性肝硬化的发展、胆汁修复和致癌作用[38,39]。

TGF-β与肝纤维化

转化生长因子-β在包括肝纤维化在内的纤维化疾病中起核心作用[40]。在肝脏中，包括Kupffer细胞在内的肝巨噬细胞是TGF-β的主要产生者，而HSC也会产生TGF-α。TGF-β是作为潜在形式产生的，需要加工才能激活。αv整合素通过激活TGF-β参与肝纤维化[41]。生物活性转化生长因子-β与转化生长因子β受体II型结合可磷酸化转化生长因子－βI型受体，激活Smad和非Smad途径[40]。在HSC中，TGF-β介导的Smad2/3活化诱导I型和III型胶原的转录，促进肝纤维化(图1). Smad信号也诱导Smad7转录，负调控TGF-β信号[40]。另一种TGF-β阴性调节因子BAMBI与TGF-βI型受体和Smad7相互作用，抑制TGF-β信号传导[42]。一份新的报告证实了维生素D核受体（VDR）在TGF-β-Smad信号调节中的作用。激活VDR拮抗Smad与HSC促纤维化基因启动子区的结合[43]。因此，维生素D缺乏促进和维生素D治疗减轻小鼠肝纤维化[43]。

在原代培养肝细胞中，TGF-β诱导表达I型胶原的EMT样表型改变。与体外观察不同，在体内肝纤维化中没有观察到TGF-β介导的EMT样变化[8,10]。相反，TGF-β信号转导介导脂载肝细胞中的肝细胞死亡，继而激活HSC促进肝纤维化[44]。TGF-β信号转导还诱导肝细胞中的结缔组织生长因子，促进肝纤维化[45]。

肝纤维化和肝癌中HSC的衰老

肝硬化中常可见衰老的HSC。与复制激活的HSC相比，衰老激活的HSCs失去了其增殖和胶原蛋白生成能力，并增加了炎症特性以产生炎性细胞因子[46]。p53通过p21诱导与细胞衰老相关(图1). 从p53中分离出的HSC^−/−小鼠对衰老具有抵抗力，并且比WT-HSC具有更强的增殖能力[47]。因此，p53^−/−小鼠表现出比WT小鼠更严重的肝纤维化，这意味着p53介导的细胞衰老限制了肝纤维化的发展[47]。此外，衰老的HSC上调炎症细胞因子的表达，并通过NK细胞介导的杀伤而易于凋亡，从而限制纤维化进展[47]。后续研究进一步证明，衰老HSC中p53的表达与肝巨噬细胞通过衰老相关分泌音型（SASP）极化为M1状态有关，从而抑制肝细胞癌（HCC）的发展[48]。始终如一地，p53^−/−HSC诱导巨噬细胞极化为M2表型，通过影响肿瘤微环境促进HCC增殖[48]。有趣的是，IL-22还通过STAT3-53轴诱导HSC衰老，从而限制肝纤维化。IL-22介导的HSC衰老诱导可能是一种新的肝纤维化干预策略[33]。与上述研究相反，有报告显示HSC中的SASP表型促进肥胖相关HCC的发展[21]。有趣的是，在这项研究中，肥胖介导的HSC衰老和SASP表型与肝纤维化无关[21]。因此，HSC衰老在肝纤维化中的作用尚不明确，需要在体内肝纤维化实验模型中对HSC进行细胞特异性基因修饰的进一步实验。

肝纤维化中的自噬

自噬是通过降解和再循环蛋白质聚集体或受损细胞器（例如线粒体）来维持细胞内环境稳定的过程。HSC激活期间观察到自噬通量，自噬抑制抑制HSC激活和增殖[49]。因此，缺乏自噬的HSC小鼠可减少HSC活化和肝纤维化。由于自噬与脂质降解有关，缺乏自噬的HSC不能失去脂滴并使细胞保持静止状态，这表明自噬对HSC活化的要求(图1) [49]。α1抗胰蛋白酶（AT）缺乏症是一种常见的遗传病，通过在肝细胞内质网中积累突变Z蛋白而导致肝脏疾病[50,51]。携带α1 AT Z突变的小鼠再现了人类α1 AT缺乏症的许多特征，包括肝纤维化[50,51]。在α1 AT缺乏症患者和Z蛋白突变小鼠中，肝细胞中的自噬被激活，自噬空泡中含有α1 AT突变Z蛋白。用自噬诱导药物卡马西平或雷帕霉素治疗，可抑制含有α1AT突变Z蛋白的小球在肝脏的蓄积和肝纤维化[50,51]。因此，尽管HSC激活需要自噬，但肝细胞中的自噬诱导对许多其他肝脏疾病是有益的，包括α1 AT缺乏症、酒精性肝病（ALD）和NASH。

血管生成与肝纤维化

肝星状细胞是肝周细胞，其收缩性调节与肝内血流阻力和门脉高压相关的窦性收缩[52]。内皮素-1和血管紧张素II控制HSC的收缩性[52]。HSC还通过产生血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-1促进血管生成[53,54]。通过阻断VEGF或血管生成素-1抑制血管生成抑制肝纤维化，暗示血管生成在肝纤维化发生中的重要作用(图1) [54,55]。

急性肝损伤后肝脏再生，而慢性肝损伤时肝脏诱导纤维化而非正常再生。Rafii及其同事证明，趋化因子受体CXCR4和CXCR7调节再生和纤维化之间的转换[56]。CCl致急性肝损伤₄或醋氨酚上调肝窦内皮细胞（LSEC）中的CXCR7。CXCR7信号通过LSEC中DNA结合抑制剂1（Id1）诱导肝细胞生长因子（HGF）和Wnt2的产生，促进肝再生[56]。相反，BDL或慢性CCl引起的慢性肝损伤₄治疗通过成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）上调CXCR4。LSEC中的FGFR1-CXCR4轴抑制CXCR7-Id1通路以抑制正常肝再生，但激活HSC，改变异常再生反应，纤维化[56]。

肝纤维化的可逆性

长期以来，人们认为纤维化是不可逆的。然而，许多研究人员也预测了纤维化的可逆性，因为当患者和啮齿类动物模型中的病因条件（包括酒精、肝炎病毒、化学物质、胆道梗阻和肥胖）消除后，纤维化会退化。据报道，活化的HSC在纤维化消退过程中发生凋亡(图1) [57]。另一方面，在培养实验中，如果过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）过度表达或用PPARγ配体处理细胞，激活的HSC可以恢复到静止状态[58]。最近，两项使用细胞命运追踪的独立研究表明，体内约40-50%的活化HSC恢复到静止状态[59,60]。这些“先前激活”或失活的HSC比“从未激活”或静止的HSC对第二次纤维原性刺激更敏感[59,60]。此外，“先前激活的”HSC既不分化为肝细胞也不分化为胆管细胞，失活的HSC也不来源于骨髓[59]。然而，目前尚不清楚是否所有激活的HSC都能失活，或者是否有完全激活的HSC已经达到“不归路点”，无法逆转。

虽然肝巨噬细胞是肝纤维化发展所必需的，但单核细胞/巨噬细胞谱系也通过产生降解ECM的基质金属蛋白酶（MMPs）来帮助解决肝纤维化。当肝脏炎症停止时，骨髓源性炎症Ly6C表达的单核细胞分化为恢复性巨噬细胞，其Ly6C低表达，产生MMP9和MMP12，诱导肝纤维化逆转[61]。

血管生成在解决肝纤维化方面也起着关键作用。抑制VEGF抑制纤维化消退[44]。肝巨噬细胞通过产生CXCL9和MMP-13促进纤维化的解决[44]。因此，CXCL9和VEGF的过度表达可加速纤维化的消退[44]。

结论

这篇综述强调了对肝纤维化的细胞和分子机制的新见解，包括肝纤维化的消退。由于多个肝细胞有助于纤维化的进展，因此确定分化为肌成纤维细胞的责任细胞并了解HSC的生物学，包括其激活和失活，是值得注意的。炎症和纤维化是紧密联系和调节的。因此，通过测量血液中炎症介质的水平来检测肝纤维化更敏感和特异的生物标记物是可行的。此外，控制炎症途径可能是一种有吸引力的肝纤维化治疗策略。最近的研究指出了肠道微生物群与肝脏免疫系统之间的联系。调节肠道微生物群有可能预防肝纤维化的进展。另一方面，消除病因是最现实的治疗策略，它可以增强肝脏的可逆性。与此同时，我们必须处理肝硬化的治疗问题，因为肝硬化已达到“不可逆转的地步”。法尼类X受体激动剂治疗NASH患者成功减轻肝纤维化的最新临床试验[62]。未来和正在进行的临床试验将验证包括肝纤维化联合疗法在内的新治疗策略的有效性、特异性和安全性。

致谢

脚注

参与者信息

Ekihiro Seki，美国加利福尼亚州洛杉矶市DAVIS贝弗利大道8700号西达斯西奈医疗中心内科消化科，D2099室。

David A.Brenner，美国加利福尼亚州拉霍亚加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院。

工具书类